閆曉坤，靳曉琳，楊潤強，顧振新*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

氯化鹽處理對綠豆芽菜植酸降解的影響

閆曉坤，靳曉琳，楊潤強，顧振新*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

為降低綠豆芽菜中抗營養(yǎng)物質(zhì)植酸含量，探究氯化鹽對綠豆芽菜植酸降解的影響，研究了KCl、NaCl和CaCl2處理下綠豆芽菜的長勢、植酸酶活性及植酸含量的變化，篩選了具有降植酸效果的氯化鹽并優(yōu)化了濃度組合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaCl和CaCl2能夠促進植酸降解同時促進綠豆芽菜生長；單因素試驗結(jié)果表明，1.6 mmol/L NaCl和6 mmol/L CaCl2降植酸效果最佳，且NaCl和CaCl2促進植酸降解作用有疊加效應(yīng)。響應(yīng)面法優(yōu)化得到NaCl、CaCl2濃度分別為1.68 mmol/L和6.40 mmol/L時，植酸含量降低至8.04 μg/株，為對照的10.84%。

綠豆芽菜；氯化鹽；植酸酶；植酸降解

綠豆（Vigna radiata (Linn.) Wilczek），為豆科植物，別名青小豆、植豆等，種子和莖被廣泛食用，有清熱解毒功效[1]，在中國已有2 000多年的栽培史。綠豆營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)及碳水化合物、同時富含鈣、磷、鐵等多種礦物質(zhì)及維生素[2]，并富含植酸。植酸主要以鈣鎂鹽形式存在于植物籽粒的糊粉層、胚芽和子葉中[3]。雖然植酸具有抗氧化、抗癌等生理功能[4]，但同時又是一種抗營養(yǎng)因子，妨礙蛋白質(zhì)和礦質(zhì)元素的吸收[5]。豆類籽粒中植酸含量普遍高于谷類，可達0.2%～2.9%[6]。因此，以豆類為主食時，易導(dǎo)致人體礦質(zhì)元素缺乏。但豆類籽粒萌發(fā)后，其內(nèi)源植酸酶被激活[7]，部分植酸被水解成低級肌醇磷酸，低級肌醇磷酸既具有植酸原有的抗氧化與防癌癥等生理功能，同時又降低了植酸原有的抗營養(yǎng)作用[8]。提高植酸酶活性，則可增加植酸的降解量。有研究

表明，鹽脅迫能誘導(dǎo)小麥苗中植酸酶基因表達上調(diào)[9]，NaCl脅迫下大麥苗中植酸酶活性增加[10]；Ca2+可激活β-螺旋植酸酶[11]，尤其在逆境脅迫下，細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活一系列應(yīng)激反應(yīng)，使得煙草中相關(guān)植酸酶基因表達上調(diào)[12]，推測外源添加Ca2+可能會提高植酸酶活性。因此，在綠豆發(fā)芽期間用一定濃度無機鹽進行噴淋，可能會提高植酸酶活性，進而降低綠豆芽菜中植酸含量。目前，我國關(guān)于綠豆芽菜生長期間植酸含量變化的研究報道較少，無機鹽對綠豆芽菜中植酸降解的影響研究鮮見報道。

本研究以綠豆為試材，在其發(fā)芽過程中噴淋KCl、NaCl和CaCl2，探討3 種氯化鹽對綠豆芽菜中植酸降解的影響，旨在為低植酸綠豆芽菜生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆種子：蘇綠一號，預(yù)實驗測得種子中植酸含量約為742.94 μg/粒。由常州五星禾綠蔬菜有限公司提供，于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

Dowex 1×8 100-200離子交換樹脂 阿法埃莎（天津）化學有限公司；2-（N-嗎啉）乙磺酸-水合物（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES）、乙二胺四乙酸二鈉（(ethylenedinitrilo) tetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、鉬酸銨、丙酮、磺基水楊酸、硫酸、鹽酸、硫酸鈉、三氯化鐵、氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀 醫(yī)藥集團（上海）化學試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PGX-150智能培養(yǎng)箱 寧波海曙塞福實驗儀器廠；BX-802豆芽機 永康市貝欣五金電器廠；818型pH計美國Orion公司；Multiskan FC型酶標儀 上海賽默飛世爾儀器有限公司；UV-2802型紫外-可見分光光度計上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 種子發(fā)芽

稱取40 g籽粒飽滿的綠豆，用體積分數(shù)1.5%的次氯酸鈉浸泡15 min后，于蒸餾水中漂洗至pH值中性，然后在30 ℃浸泡4 h，置于發(fā)芽機中30 ℃黑暗培養(yǎng)4 d。期間，每2 h噴淋一次氯化鹽溶液，每次2 min。以蒸餾水噴淋為對照組。

1.3.2 芽長、株質(zhì)量測定

隨機選取30 株綠豆芽苗菜，分別用直尺和分析天平測定其芽長和株質(zhì)量。

1.3.3 植酸酶活性測定

參照李娜等[13]的方法，稍作修改，取綠豆芽苗2～3 株（約0.5 g），用5 mL MES-EDTA（pH 5.5）緩沖液冰浴研磨成漿狀，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min得上清液，即為植酸酶提取液。取200 μL粗酶液與等體積底物（4 mmol/L植酸鈉）混勻，在55 ℃條件下反應(yīng)15 min后立即加入800 μL丙酮-鉬酸銨溶液終止顯色，于405 nm波長處測定其OD值。每個處理重復(fù)3 次。以無機磷含量為標準，制作標準曲線并計算無機磷的增加量，以每分鐘產(chǎn)生1 μmol無機磷定義為1 個酶活力單位U，植酸酶活力表示為U/株。

1.3.4 植酸含量測定

植酸含量測定參照GB/T 170496—1998《食品中植酸的測定》，結(jié)果以μg/株表示。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以發(fā)芽第4天植酸含量為響應(yīng)值，自變量為NaCl濃度（A）、CaCl2濃度（B）。因子編碼及自變量水平見表1，每次試驗設(shè)3 個平行樣，取平均值，利用Design-Exper 8.0軟件進行試驗設(shè)計與結(jié)果分析。

表1 Box-Behnken試驗水平與因素Table1 The coded levels and corresponding actual levels of the independent variables used in the Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 18.0 進行統(tǒng)計分析，均值間比較采用Duncan’s多重比較，在0.05水平上進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同氯化鹽處理綠豆芽菜的芽長（A）和株質(zhì)量（B）變化Fig.1 Changes in sprout length (A) and sprout weight (B) with different chlorate treatments

2.1 氯化鹽處理對綠豆芽菜生長的影響

由圖1可以看出，綠豆芽菜的芽長和株質(zhì)量隨發(fā)芽時間的延長而增加，NaCl和CaCl2處理顯著增加了綠豆芽長（P＜0.05），而在發(fā)芽第4天時，CaCl2處理下的芽長最大，其次是NaCl，而KCl處理僅在第4天表現(xiàn)出促進作用，與對照相比，第4天時CaCl2、KCl和NaCl處理下芽長分別增加了42.80%、23.44%和70.90%（圖1A）。由圖1B

可以看出，在3 種鹽處理下，生長2 d的綠豆芽苗株質(zhì)量與對照無顯著差異，而發(fā)芽4 d的綠豆芽苗僅有CaCl2處理表現(xiàn)出促進作用，這可能是由于發(fā)芽第4天Ca2+提高了芽苗的含水量[14]。

2.2 不同無機鹽處理綠豆芽菜中植酸酶活性及植酸含量變化

表2 不同氯化鹽處理植酸酶活性Table2 Changes in phytase activity under different chlorate treatments

由表2可看出，對照和KCl處理綠豆芽菜的植酸酶活性隨發(fā)芽時間的延長而降低，而NaCl和CaCl2處理下的酶活隨時間的延長而增加，其中KCl處理的植酸酶活性最低。在發(fā)芽第2天，NaCl和CaCl2處理的酶活性與對照相比無顯著差異（P＜0.05）；在發(fā)芽第4天，NaCl和CaCl2處理的酶活性分別高于對照31.57%和35.11%（P＜0.05）。這表明KCl可抑制植酸酶活性，而NaCl和CaCl2處理能提高植酸酶活性。

圖2 氯化鹽處理綠豆芽菜第4天植酸含量變化Fig.2 Changes in phytic acid content on the 4thday with different chlorate treatments

由圖2可知，發(fā)芽至第4天，KCl處理綠豆芽菜中植酸含量顯著高于對照，而NaCl、CaCl2處理綠豆芽菜中植酸含量顯著低于對照（P＜0.05），分別為對照的70.77% 和49.22%。由此可見，這3 種氯化鹽對植酸降解作用不同，KCl可抑制植酸降解，NaCl和CaCl2處理能顯著促進植酸降解。

2.3 不同濃度CaCl2處理綠豆芽菜中植酸酶活性和植酸含量變化

表3 不同濃度CaCl2處理綠豆芽菜中植酸酶活性Table3 Changes in phytase activity with CaCl2treatment at different concentrations

由表3可知，隨著CaCl2濃度的增加，植酸酶活性先增加再減小。6 mmol/L CaCl2處理植酸酶活性最高，第4天時比對照高68.43%（P＜0.05）。

圖3 不同濃度CaCl2處理綠豆芽菜第4天植酸含量變化Fig.3 Changes in phytic acid content on the 4thday with CaCl2treatment at different concentrations

如圖3所示，不同濃度CaCl2處理下植酸含量均顯著低于對照，但隨著CaCl2噴淋濃度的增加，綠豆芽菜中植酸含量呈先降低后升高的趨勢。CaCl2濃度為6 mmol/L時，植酸含量最低，僅為對照的19.21%（P＜0.05）。

2.4 不同濃度NaCl處理綠豆芽菜中植酸酶活性及植酸含量變化

表4 不同濃度NaCl處理綠豆芽菜中植酸酶活性Table4 Changes in phytase activity with NaCl treatment at different concentrations

由表4可知，不同濃度NaCl處理對植酸酶活性的影響相似，即隨著NaCl濃度的升高，植酸酶活性先增大后減小。其中，1.6 mmol/L NaCl處理下植酸酶活性最高（P＜0.05），而其他濃度NaCl處理下植酸酶活性時與對照無顯著性差異，甚至低于對照。

圖4 不同濃度NaCl處理綠豆芽菜第4天植酸含量變化Fig.4 Changes in phytic acid content on the 4thday with NaCl treatment at different concentrations

如圖4所示，隨著NaCl濃度的增加，綠豆芽菜中植酸含量呈先降低再升高的趨勢，0.8、1.6、3.2 mmol/L NaCl處理下中植酸含量與對照相比均有顯著降低，分別為對照的83.41%、47.86%、63.13%；其中1.6 mmol/L NaCl處理綠豆芽菜植酸含量最低（P＜0.05）。結(jié)合植酸酶活性測定結(jié)果，1.6 mmol/L的NaCl有效促進植酸降解。

2.5 NaCl聯(lián)合CaCl2處理綠豆芽菜中植酸酶活性及植酸含量變化

表5 NaCl聯(lián)合CaCl2處理綠豆芽菜中植酸酶活性Table5 Changes in phytase activity with combined treatment of NaCl and CaCl2

由表5可知，NaCl聯(lián)合CaCl2處理下植酸酶的活性最高，發(fā)芽2、4 d相對于對照分別提高了54.41%和70.87%。CaCl2噴淋下植酸酶活性高于NaCl處理，去離子水噴淋酶活性最低。

圖5 NaCl聯(lián)合CaCl2處理綠豆芽菜第4天植酸含量變化Fig.5 Changes in phytic acid content on the 4thday with combined treatment of NaCl and CaCl2

圖5顯示，NaCl聯(lián)合CaCl2處理下綠豆中芽菜植酸含量顯著低于NaCl、CaCl2單獨處理和對照（P＜0.05），分別為NaCl、CaCl2和對照處理下的25.01%、54.87%和13.25%。CaCl2噴淋促進植酸降解的效果要優(yōu)于NaCl噴淋，但植酸含量均顯著低于對照（P＜0.05）。因而推測NaCl和CaCl2具有協(xié)同作用以增強綠豆芽菜中植酸酶活性并降低植酸含量。

2.6 NaCl聯(lián)合CaCl2處理試驗結(jié)果

表6 NaCl聯(lián)合CaCl2處理Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table6 Box-Behnken design with experimental data for combined treatment of NaCl and CaCl2

表7 回歸模型方差分析Table7 Analysis of variance of the regression model

圖6 NaCl與CaCl2的交互作用對植酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Interaction effect of NaCl and CaCl2on phytic acid content

用Design-Exper軟件設(shè)計兩因素三水平試驗，根據(jù)設(shè)計進行試驗，并得到相應(yīng)結(jié)果如表6所示。對Box-Behnken試驗設(shè)計進行方差分析見表7，利用Design-Expert 8.0對數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合得到植酸含量Y對編碼自變量NaCl濃度（A）、CaCl2濃度（B）的二次多項回歸方程為：

Y=170.066 1－166.750 0A－0.703 3B+4.368 75AB+ 47.239 58A2+0.315 83B2

由表7回歸模型方差分析可以看出FM=13.45，P＜0.028 8，模型顯著。A、B、AB、A2、B2項P＜0.05，影響顯著。Design-Expert 8.0軟件中Box-Behnken法計算回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)為0.886 1，即該模型能解釋

88.61%響應(yīng)值的變化，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差較小，以此模型優(yōu)化NaCl聯(lián)合CaCl2處理促進植酸降解是可行的。

表7列出了2 種影響因素在Box-Behnken試驗設(shè)計下影響植酸含量的回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗。結(jié)果表明NaCl濃度和CaCl2濃度的一次項及其二次項都對植酸含量有顯著性影響（P＜0.05）。同時NaCl濃度和CaCl2濃度的交互作用影響顯著（P＜0.05）。

由圖6可知，當CaCl2濃度一定時，NaCl濃度在1.2～2.0 mmol/L范圍內(nèi)增大時，曲線較陡，植酸含量在1.6 mmol/L左右達到最小值后就開始上升；當NaCl濃度一定時，CaCl2濃度在4～8 mmol/L范圍內(nèi)增大時，曲線變化較陡，在6 mmol/L附近時，植酸含量達到最小值，達到極值后開始緩慢上升。響應(yīng)曲面坡度反映響應(yīng)值對因素變化的敏感性，等高線的形狀可反映出交互作用的強弱[15]。從圖6可以看出，NaCl濃度和CaCl2濃度之間交互作用影響顯著。

對模型方程進行典型性分析，結(jié)果表明，模型具有穩(wěn)定點，穩(wěn)定點為其最小值。模型給出的最優(yōu)組合為NaCl濃度1.68 mmol/L，CaCl2濃度6.40 mmol/L，再此條件下預(yù)測植酸最低含量為8.47 μg/株。為了證明模型預(yù)測的準確性，在給出最優(yōu)條件下進行了3 次平行的重復(fù)性實驗，植酸含量均值為8.04 μg/株。這說明模型方程可信度較高，實驗值與預(yù)測值基本相符，能夠很好地預(yù)測實驗結(jié)果。

3 討 論

綠豆籽粒發(fā)芽初始階段，吸水膨脹，進入萌芽狀態(tài)；分解蛋白質(zhì)、脂肪等有機物為其萌芽生長提供充足能量，同時也會分解植酸為以獲得充足的磷元素，表現(xiàn)為芽長和株質(zhì)量迅速上升[16]。本研究發(fā)現(xiàn)外源鹽處理會影響綠豆芽菜的生長，在2 mmol/L濃度下，KCl、NaCl和CaCl23 種氯化鹽處理均促進了綠豆芽菜的生長，其中以CaCl2的促進效果最為顯著，NaCl次之，這與梁帥克等[17]對苜蓿幼苗的研究一致。

綠豆籽粒萌發(fā)后，內(nèi)源植酸酶被激活，植酸在其內(nèi)源植酸酶的催化下降解為低級肌醇磷酸[18]。植酸酶作為一種活性蛋白，會被不同種類的無機鹽激活或抑制[19]，從而影響植酸降解。本研究中，在2 mmol/L濃度下，KCl顯著抑制了植酸酶的活性，導(dǎo)致芽苗中植酸含量高于對照。有研究報道，NaCl脅迫可導(dǎo)致大麥苗植酸酶活性提高[10]，也可使小麥苗植酸酶基因[7]和大豆紫色酸性磷酸酶基因PAP基因[20]上調(diào)，從而提高植酸降解量。本研究中NaCl可顯著提高綠豆芽菜中植酸酶活性，促進植酸降解，與上述研究結(jié)果一致。Ca2+是多種酶的激活劑，Reddy等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+可激活β-螺旋植酸酶。還有研究報道，Ca2+能夠?qū)е聰M南芥[21]、煙草[22]中植酸酶基因表達上調(diào)，從而表現(xiàn)出高的植酸酶活性。此外，植酸降解的另一條途徑磷酸肌醇特異性磷脂酶C途徑中的關(guān)鍵酶特異性磷脂酰肌醇磷脂酶C也受到鈣離子調(diào)控[23]。本研究實驗結(jié)果表明，CaCl2顯著提高了植酸酶活性，與上述研究結(jié)果一致，且促進植酸降解的作用優(yōu)于NaCl。NaCl和CaCl2主要在第4天提高了植酸酶活性，而第4天芽苗中植酸含量卻顯著低于對照，可能因為植酸酶活性反映的是某一時刻植酸酶的降解能力，而植酸降解量是在各個時刻植酸酶的催化下逐步累積的。

NaCl和CaCl2單因素試驗結(jié)果表明，不同濃度氯化鹽處理對綠豆芽菜植酸降解的影響不同，濃度過低其降植酸效果與對照相比不顯著，濃度過高則可能因為對植株造成嚴重脅迫而影響正常生長和酶活，從而無法促進甚至抑制植酸降解。這可能是由于高濃度NaCl會使植物細胞內(nèi)滲透壓增加，阻礙其正常生長代謝活動[24]。有研究表明，高濃度的鹽會抑制大麥的萌發(fā)，使得植酸降解的產(chǎn)物無機磷在大麥中積累，從而抑制植酸酶的活性[10]。Ca2+濃度過高則會導(dǎo)致多余Ca2+與植酸形成植酸-Ca或Ca-植酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物，競爭酶的活性中心位點而影響植酸酶的活性從而降低植酸酶的作用[25]。因此NaCl 和CaCl2促進植酸降解的作用隨濃度的升高呈先增大再降低的趨勢。本研究綜合不同濃度NaCl和CaCl2對植酸酶活性和植酸含量的影響，獲得最優(yōu)濃度為1.6 mmol/L NaCl和6 mmol/L CaCl2。

NaCl和CaCl2分別提高了植酸酶的活性，且均有促進植酸降解的作用，推測二者的作用可能存在疊加效應(yīng)。本研究結(jié)果也印證了該推測，并經(jīng)響應(yīng)面試驗優(yōu)化出NaCl聯(lián)合CaCl2處理最優(yōu)濃度分別為1.68 mmol/L和6.40 mmol/L，經(jīng)驗證可靠。

4 結(jié) 論

不同的氯化鹽對綠豆芽菜中植酸降解的影響不同，2 mmol/L濃度下，KCl可抑制而NaCl和CaCl2可促進植酸降解；且CaCl2降植酸效果顯著優(yōu)于NaCl。

不同濃度的NaCl、CaCl2對植酸降解的影響不同，NaCl和CaCl2促進植酸降解的最優(yōu)濃度分別為1.6 mmol/L 和6 mmol/L，且二者對植酸降解的促進作用有疊加效果，經(jīng)優(yōu)化后聯(lián)合處理的濃度分別為1.68 mmol/L和6.40 mmol/L，驗證性實驗證實該優(yōu)化濃度可靠。

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Effects of Chlorate Treatments on Phytic Acid Degradation in Germinated Mung Beans

YAN Xiaokun, JIN Xiaolin, YANG Runqiang, GU Zhenxin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The objective of this study was to reduce the phytic acid content in germinated mung bean (Vigna radiata (Linn.) Wilczek). The effects of three chlorizated salts on phytic acid degradation were investigated. The growth performance, phytase activity and phytic acid content were studied in germinated mung bean sprouts treated with KCl, NaCl and CaCl2(2 mmol/L), respectively. The phytase activity and phytic acid content were used to screen the optimal concentrations of chlorizated salts, which have function in reducing phytic acid content. The results showed that all three chlorated salts could promote the growth of germinated mung bean and both NaCl and CaCl2reduced phytic acid content. NaCl at 1.6 mmol/L and CaCl2at 6 mmol/L had the best effects on phytic acid degradation. Furthermore, a synergistic effect was found between NaCl and CaCl2, the optimal combination determined by response surface analysis were 1.68 mmol/L NaCl and 6.40 mmol/L CaCl2. Under this condition, the phytic acid content was reduced to 8.04 μg/plant, which was 10.84% of the control.

geminated mung bean; chlorizated salt; phytase; phytic acid degradation

10.7506/spkx1002-6630-201622002

TS255.1

A

1002-6630（2016）22-0007-06

閆曉坤, 靳曉琳, 楊潤強, 等. 氯化鹽處理對綠豆芽菜植酸降解的影響[J]. 食品科學, 2016, 37(22): 7-12. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201622002. http://www.spkx.net.cn

YAN Xiaokun, JIN Xiaolin, YANG Runqiang, et al. Effects of chlorate treatments on phytic acid degradation in germinated mung beans[J]. Food Science, 2016, 37(22): 7-12. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622002. http://www.spkx.net.cn

2016-01-13

國家自然科學基金面上項目（31471596）

閆曉坤（1991—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工。E-mail：2014108023@njau.edu.cn

*通信作者：顧振新（1956—），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：guzx@jau.edu.cn