衛(wèi)艷萍，史四季，張如幸，劉秀琴，趙林棟

槲皮素對人黑素瘤A375細胞增生和凋亡的影響

衛(wèi)艷萍，史四季，張如幸，劉秀琴，趙林棟

目的 探討槲皮素對體外培養(yǎng)人黑素瘤A375細胞增生和凋亡的影響。方法 CCK8法檢測0、20、40、80、160 μmol/L濃度槲皮素作用于A375細胞24、48 和72 h后細胞增生水平。用0、20、40、80、160 μmol/L濃度槲皮素作用24 h后，以Annexin-V/PI法觀察A375細胞凋亡，分別測定Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的活性，并以蛋白印跡法（Western blot）檢測p53，Bax及Bcl-2的基因蛋白水平。結(jié)果 與空白對照組比較，20、40、80、160 μmol/L槲皮素作用24、48和72 h后均對A375細胞的增生有抑制作用，且有時間、濃度依賴性。0、20、40、80、160 μmol/L槲皮素在作用24 h時，A375細胞早期凋亡率由（3.02±0.49）%分別上升至（11.20±1.68）%、（12.44±1.68）%、（24.55±0.58）%和（47.68±0.79）%，各組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或＜0.01），80、160 μmol/L作用組的Caspase 3，Caspase 8，Caspase 9活性升高，且與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或＜0.01）。p53及Bax的蛋白水平隨藥物濃度的增加而升高，Bcl-2的蛋白水平隨藥物濃度增加而降低。結(jié)論 槲皮素對黑素瘤A375細胞具有抑制增生和誘導凋亡的作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)p53及Bcl-2/ Bax基因有關(guān)。

黑素瘤；槲皮素；凋亡；增生

衛(wèi)艷萍

槲皮素（quercetin）是從槲皮中提取的一種5-羥基黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果及多種中草藥中，具有多種生物學活性[1-3]。槲皮素作用廣泛，不僅能夠抑制多種腫瘤細胞的增生及促進腫瘤細胞凋亡，而且與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用后可增強藥物對腫瘤細胞的敏感性，可作為一種潛在的抗癌藥物，臨床應用廣泛[4]。槲皮素可以干擾細胞酶、受體、轉(zhuǎn)運蛋白和信號系統(tǒng)[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對多種惡性腫瘤細胞有生長抑制作用，如乳腺癌、肝癌、宮頸癌、腦膠質(zhì)瘤、黑素瘤[6]等。但對于黑素瘤細胞的促凋亡及其分子機制及其信號傳導途徑少見報道。本研究即以體外培養(yǎng)的人黑素瘤A375細胞為實驗對象，通過測定半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）活性和p53、Bax及Bcl-2基因蛋白表達水平的變化，初步探討槲皮素誘導黑素瘤細胞凋亡的途徑和調(diào)節(jié)機制。

1　材料與方法

1.1材料

人皮膚黑素瘤A375購于中國醫(yī)學科學院上海細胞庫。槲皮素（購自美國Sigma公司）用前溶于二甲基亞砜 （DMSO），配制成1 mol/L溶液，加藥前用含10%DMSO的滅菌雙蒸水配制成所需的實驗濃度。DMSO、Hoechst33258（美國Sigma公司），RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶（Gibco公司），新生牛血清（四季青生物公司），CCK8試劑盒（日本同仁化學公司），Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD Pharmingen公司），Caspase-Glo@3/7，8，9檢測試劑盒（美國Promega公司），Bcl-2抗體，Bax抗體（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），p53抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2方法

1.2.1藥物配制 藥物溶解于DMSO，槲皮素終濃度分別為0、20、40、80、160 μmol/L；DMSO在培養(yǎng)基中的最大終濃度＜0.2%，經(jīng)預實驗證實對細胞增生無影響。

1.2.2細胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)A375細胞，取對數(shù)生長期的細胞用于各項實驗。

1.2.3CCK8檢測細胞增生抑制率 將對數(shù)生長期的A375細胞按每孔1 × 104個細胞分別接種于96孔板，在37℃、5% CO2下孵育24 h，去上清液，每孔加入一定濃度槲皮素（0、20、40、80、160 μmol/L）的1640培養(yǎng)基100 μl，每一濃度設3個復孔?？瞻讓φ战M直接加1640培養(yǎng)基100 μl，分別培養(yǎng)24 、48 、72 h后，以1640培養(yǎng)基小心洗滌細胞2次，每孔加人100 μl 1640培養(yǎng)基，再加入10 μl的CCK8溶液，在37 ℃、5% CO2下孵育2 h，在酶標儀450 nm波長下測量各孔吸光度值， 細胞增殖抑制率=（空白對照組平均吸光度值-給藥組平均吸光度值）/空白對照組平均吸光度值×100%。

1.2.4槲皮素對細胞凋亡率的影響 收集經(jīng)0、20、40、80、160 μmol/L槲皮素作用24 h后的A375細胞，預冷的PBS洗滌2遍，以1×連接緩沖液將細胞密度調(diào)整為1 × 106個/ml，采用乙硫氰酸熒光素(Annexin V)-FITC/碘化丙錠(PI)雙染法，每管加Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl，輕輕振蕩混勻，室溫避光染色15 min，每管加400 μl 1×連接緩沖液，采用流式細胞儀測定槲皮素作用下細胞的凋亡率。

1.2.5Caspase活性的測定 選擇對數(shù)生長期的A375細胞，1640培養(yǎng)基調(diào)制成細胞懸液，以每孔100 μl、1 × l05個/ml的細胞密度接種在不透光的白底96孔培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2下孵育24 h，去上清液，每孔加入一定濃度槲皮素（0、20、40、80、160 μmol/L）的培養(yǎng)基100 μl，每個濃度設3個復孔，對照組直接加培養(yǎng)基，空白組不加細胞只加培養(yǎng)基，作用24 h后，將10 μl GF-AFC與2 ml細胞活力測定緩沖液混合，每孔中加入20 μl混合液，充分搖勻后37℃避光孵育30 min，測定細胞活力。接著每孔加入120 μl Caspase-Glo@3/7，Caspase-Glo@8或 Caspase -Glo@9試劑繼續(xù)避光孵育30 min，以熒光檢測儀讀數(shù)除以細胞活力讀數(shù)即為平均每個細胞的Caspase活性值。

1.2.6p53，Bcl-2，Bax基因蛋白水平檢測 采用Western blot法，將A375細胞分別與0、40、80、160 μmol/L槲皮素的培養(yǎng)基2 ml作用24 h，提出相同質(zhì)量的蛋白，進行凝膠電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，以含5%的脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h，p53抗體，Bcl-2抗體，Bax抗體4℃孵育過夜，繼以二抗室溫孵育l h，化學發(fā)光法檢測反應條帶。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，每組數(shù)據(jù)取平均值，結(jié)果以均值±標準差表示，組間比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1細胞增生抑制率

與空白對照組比較，20、40、80、160 μmol/L槲皮素作用24、48、72 h，均對A375細胞有抑制作用，且與時間、濃度呈依賴關(guān)系。槲皮素能抑制皮膚黑素瘤A375細胞的增生活性，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，槲皮素對A375細胞的生長抑制率逐漸增加，如圖1所示，各組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。

圖1　不同濃度槲皮素對A375細胞增殖抑制的影響

2.2細胞凋亡率

0、20、40、80、160 μmol/L槲皮素在作用24 h時，A375細胞早期凋亡率由0 μmol/L組的（3.02 ±0.49）%分別上升至（11.20± 1.68）%、（12.44±1.68）%、（24.55 ±0.58）%、（47.68±0.79）%，除0 μmol/L外的各組與空白對照組間相比差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。槲皮素能促進A375細胞的凋亡，隨著藥物濃度的增加，A375細胞的凋亡率逐漸升高。流式細胞檢測儀檢測A375細胞凋亡率結(jié)果見圖2。

2.3Caspase活性

如 表 l所 示， 20、40、80、160 μmol/L槲皮素在作用24 h槲，A375細胞的Caspase 3活性升高最為明顯，分別為對照組的112.23%，129.33%，186.75% 和449.65%。80、160 μmol/L作用組的Caspase 8，Caspase 9活性也明顯升高，與對照組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。結(jié)果顯示，槲皮素作用A375細胞24 h后，Caspase 3，Caspase 8和Caspase 9的活性均呈濃度依賴性增加。

2.4Bcl-2、p53及 Bax蛋白水平

圖2　槲皮素對A375細胞凋亡率的影響

表1　槲皮素對A375細胞Caspase活性的影響（　±s，分）

表1　槲皮素對A375細胞Caspase活性的影響（　±s，分）

注：與對照組相比，aP＜0.05，bP＜0.0l

組 別 n Caspase 3 Caspase 8 Caspase 9空白對照組 5 100.00±3.20 100.00±3.26 100.00±3.26槲皮素0 μmol/L 5 101.27±2.45 99.74±4.18 102.39±3.75槲皮素20 μmol/L 5 112.23±1.44a90.27±1.28a92.46±1.80a槲皮素40 μmol/L 5 129.33±0.97b112.73±1.00 102.66±3.60a槲皮素80 μmol/L 5 186.75±3.24a126.29±0.98b130.77±0.55b槲皮素160 μmol/L 5 449.65±0.55b186.43±4.27a192.25±6.21

使用Western blot法對空白對照組、40、80、160 μmol/L槲皮素作用24 h后，對A375細胞中的Bcl-2、p53和Bax進行檢測。應用BandScan4.5圖像分析軟件，以β-肌動蛋白的表達灰度值為標準，計算Bcl-2、p53及Bax蛋白的相對量。對照組、40、80、160 μmol/L組的Bcl-2表達與β-肌動蛋白的灰度比值分別為0.98、1.08、0.80、0.20；p53表達與β-肌動蛋白的灰度比值分別為0.28、0.48、0.89、0.96；Bax表達與β-肌動蛋白的灰度比值分別為0.24、0.49、0.80、0.94?？梢姡晕刺幚鞟375細胞為對照，p53、Bax在槲皮素作用的A375細胞中的表達隨藥物濃度的增加而升高，Bcl-2在槲皮素作用的A375細胞中的表達隨藥物濃度的增加而降低（圖3）。

3　討論

自1971年美國的一項研究首次發(fā)現(xiàn)槲皮素在臨床上治療白血病有效后，多項研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制多種癌細胞的增生，其作用機制可能是通過抑制腫瘤細胞的信號傳導、抑制細胞周期[7]、誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡及分化[8]等。此外，槲皮素尚可抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移等多種途徑來發(fā)揮其抗腫瘤作用[9]，因而推測其將是很有應用前景的治療癌癥的天然藥物，特別對生長較快的惡性腫瘤可能具有明顯的抑制作用。目前對于槲皮素作用于人黑素瘤A375細胞的研究報道較少。

圖3　槲皮素對A375細胞Bcl-2、p53和Bax蛋白表達的影響

本研究結(jié)果表明，槲皮素能抑制皮膚黑素瘤A375細胞的增生活性，且這種作用隨著藥物濃度的升高和作用時間的增加而逐漸增強，具有濃度和時間的依賴性。槲皮素可抑制黑素瘤細胞的增生，且隨藥物濃度增加，凋亡率也隨之增加。誘導細胞凋亡主要有Caspase依賴途徑和非Caspase依賴途徑，而以前者為主[10]。Caspase家族被認為是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。目前認為至少有3條通路參與凋亡的發(fā)生，包括經(jīng)典的兩條細胞凋亡途徑，即細胞外途徑（細胞表面死亡受體途徑）和細胞內(nèi)途徑（線粒體引發(fā)途徑），以及新近引起關(guān)注的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[11]。筆者通過Caspase活性測定，檢測3種重要的凋亡相關(guān)蛋白激酶Caspase3，Caspase 8和Caspase 9在槲皮素作用于A375細胞時的活性變化。結(jié)果顯示，以20、40、80、160 μmol/L的槲皮素作用A375細胞24 h后，3種蛋白酶的活性均呈濃度依賴性增加，提示槲皮素可通過細胞內(nèi)和細胞外兩種途徑誘導A375細胞凋亡。

p53蛋白是第一個被確認與DNA損傷引起的凋亡有關(guān)的蛋白，它在調(diào)控細胞凋亡過程中起重要作用。活化的p53可以轉(zhuǎn)錄激活一系列凋亡效應分子，通過細胞內(nèi)或細胞外途徑誘導凋亡。Bcl-2基因家族是細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)者。根據(jù)其對細胞凋亡作用的功能特點，可將Bcl-2蛋白家族分為兩類：促凋亡蛋白家族如Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，抗凋亡蛋白家族如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1[12]。用Western blot測定槲皮素作用的A375細胞中Bcl-2及Bax、p53蛋白水平變化，p53蛋白及其下游基因Bax蛋白的表達水平隨槲皮素濃度的增加而增強，而其下游基因Bcl-2蛋白水平則因槲皮素的作用逐漸降低。可見，槲皮素可通過激活p53蛋白誘導黑素瘤A375細胞的凋亡。同時，槲皮素也通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族，尤其是降低Bcl-2與Bax的比值誘導細胞凋亡。

綜上所述，槲皮素對黑素瘤A375細胞具有抑制增生和誘導凋亡的作用，其機制可能與調(diào)節(jié)p53及Bcl-2/Bax基因有關(guān)，對其更加深入的機制研究，有待進一步探討。

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（本文編輯耿建麗）

Effects of quercetin on the proliferation and apoptosis of A375 human melanoma cells

WEIYan-ping，SHISi-ji，ZHANGRu-xing，etal
DepartmentofDermatology,Jiaozuopeople′sHospital,Jiaozuo454002,China

Objective To study the effect of quercetin on the proliferation and apoptosis of A375 human melanoma cells. Methods Cell counting kit-8 (CCK8) was used to evaluate the proliferative activity of A375 cells which treated with quercetin of 0, 20, 40, 80, 160μmol/L for 24 h, 48 h and 72 h respectively. Subsequently, A375 cells that treated with the same method underwent double staining with annexin V and propidium iodide for the detection of cell apoptosis, and fl uorometric assay for the estimation of Caspase 3, Caspase 8 and Caspase 9 activity, and Western blot for the determination of the levels of p53, Bax and Bcl-2 proteins. Results Within the investigated concentration and time ranges, quercetin signifi cantly inhibited the proliferative activity of A375 cells in a concentrationdependent and time-dependent manner. Compared with blank groups, a signifi cant increase was observed in the early apoptosis rate in A375 cells treated with quercetin of 0, 20, 40, 80, 160 μmol/L for 24 h (11.20±1.68)%, (12.44±1.68)%, (24.55±0.58)% and (47.68±0.79)% vs (3.02±0.49)%, (P＜0.05 or 0.01), as well as in the activity of Caspase 3, 8 and 9 in A375 cells treated with quercetin of 80, 160μmol/L for 24 h (P＜0.05 or 0.01). After 24 h treatment, the protein levels of p53 and Bax were elevated, but Bcl-2 was decreased in A375 cells with the increase of quercetin concentration. Conclusion Quercetin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of A375 cells, and the apoptosis-inducing effect may occur through modulating the express of p53 and Bcl-2/Bax genes.

Melanoma；Quercetin；Apoptosis；Proliferation [JPractDermatol, 2016, 9(3):171-174]

R739.5

A

1674-1293(2016)03-0171-04

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160304

454002焦作，焦作市人民醫(yī)院皮膚性病科（衛(wèi)艷萍，史四季，張如幸，劉秀琴，趙林棟）

衛(wèi)艷萍，碩士研究生，研究方向：皮膚外科E-mail:weiyanping1977716@126.com

趙林棟，E-mail:jz_zld@163.com

（2016-02-16

2016-05-11）