張寅英，李 曄

（嘉興市婦幼保健院臨床藥學室，浙江314000）

萬古霉素和利福平聯(lián)用對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性評價*

張寅英，李 曄

（嘉興市婦幼保健院臨床藥學室，浙江314000）

目的 評價萬古霉素與利福平對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的聯(lián)合體外抗菌活性。方法 采用微量肉湯稀釋法分別測定萬古霉素和利福平對30株MRSA的最低抑菌濃度（MIC），考察兩藥單用對MRSA的抗菌活性；以測得的單藥MIC為依據(jù)，采用棋盤法設(shè)計，測定并計算萬古霉素和利福平聯(lián)用對30株MRSA的部分抑菌濃度指數(shù)，考察兩藥聯(lián)用對MRSA的抗菌活性。結(jié)果 30株MRSA對萬古霉素和利福平的耐藥率分別為3.3%、90.0%。兩藥聯(lián)用后絕大部分表現(xiàn)為協(xié)同作用[86.7%（26/30）]，少部分為相加作用[13.3%（4/30）]，未見表現(xiàn)為無關(guān)及拮抗作用者。結(jié)論萬古霉素和利福平單藥對MRSA均表現(xiàn)為部分有效，兩藥聯(lián)用后對MRSA的抗菌活性增強，以協(xié)同作用為主，臨床治療MRSA引起的嚴重感染可考慮根據(jù)藥敏試驗結(jié)果采用萬古霉素和利福平聯(lián)合用藥方案。

甲氧西林抗藥性； 葡萄球菌，金黃色； 萬古霉素/藥理學； 利福平/藥理學

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphlococcusaureus，MRSA）是金黃色葡萄球菌獲得mecA基因后產(chǎn)生的高耐藥性菌株[1]。自1961年首次檢出以來MRSA在全球廣泛傳播，成為醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的重要致病菌[2-4]。目前的臨床指南大多推薦萬古霉素作為治療MRSA感染的首選藥物，但相關(guān)研究表明，已出現(xiàn)耐藥性和與之相關(guān)的治療失敗[5]，迫使人們開始考慮抗MRSA感染的新策略。

利福平是英國MRSA感染防治指南[6]的推薦藥物之一，但單用易產(chǎn)生耐藥性[7]。已有文獻報道，利福平與其他抗生素聯(lián)用對治療金黃色葡萄球菌引起的感染性心內(nèi)膜炎及骨科內(nèi)置物術(shù)后感染具有較好療效[8]。本研究通過考察萬古霉素與利福平對MRSA的單藥和聯(lián)用體外抗菌活性，探討兩藥聯(lián)用抗MRSA感染的可行性，為臨床合理用藥及減少細菌耐藥性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 30株受試MRSA菌株為本院2013~ 2014年臨床分離株，分離方法參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第3版）進行，并經(jīng)頭孢西丁紙片法鑒定為MRSA。標準質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 試劑 利福平及萬古霉素標準品（中國藥品生物制品檢定所）、Muller-Hinton瓊脂（北京三藥科技公司）、Muller-Hinton肉湯（北京奧博星生物技術(shù)公司）、甲醇（北京化學試劑公司）等。

1.1.3 儀器 比濁儀（法國梅里埃公司）、96孔平板（海門申華試驗器材公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器公司）等。

1.2 方法 選取已分純并過夜新鮮培養(yǎng)的MRSA菌落

4~5個接種于Muller-Hinton肉湯中，增菌6 h后菌液用Muller-Hinton肉湯以比濁儀校正濁度至0.5 Mac Farland，再用Muller-Hinton肉湯稀釋至1.5×105cfu/mL。參照2013年版美國臨床和實驗室標準化協(xié)會標準中對制備抗菌藥物貯備液所需的溶劑和稀釋劑的規(guī)定，分別以無菌蒸餾水和甲醇/無菌蒸餾水為溶劑配制萬古霉素和利福平貯備液，質(zhì)量濃度分別為1 920.000、640.000 μg/mL。采用微量肉湯稀釋法[9]測定抗菌藥物最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將萬古霉素和利福平以滅菌Muller-Hinton肉湯倍比稀釋，質(zhì)量濃度為0.063~512.000 μg/mL。將配好的不同質(zhì)量濃度的2種藥物按棋盤法設(shè)計，兩兩組合加入到96孔平板中，每種抗菌藥物加入量為50μL，再在每孔中加入1.5×105cfu/mL菌液100 μL，加樣完成后將平板置于微量震蕩器上震蕩3 min混勻，35℃條件下過夜培養(yǎng)。以無菌生長孔的最低藥物濃度為該藥對該株細菌的MIC，記錄兩藥單用的MIC（MIC萬古霉素單用、MIC利福平單用），并選擇最佳組合效應(yīng)時兩藥聯(lián)用時各自的MIC（MIC萬古霉素聯(lián)用、MIC利福平聯(lián)用），以計算部分抑制濃度（fraction inhibitory concentration，F(xiàn)IC）。FIC=（MIC萬古霉素聯(lián)用/ MIC萬古霉素單用）+（MIC利福平聯(lián)用/MIC利福平單用）。FIC判讀標準：FIC≤0.5為協(xié)同作用；＞0.5～1.0為相加作用；＞1.0～2.0為無關(guān)作用；>2.0為拮抗作用。

2 結(jié) 果

2.1 萬古霉素和利福平單用對MRSA的MIC及耐藥性 萬古霉素對MRSA的MIC范圍較窄，MIC50、MIC90均明顯小于利福平。且MRSA菌株對利福平嚴重耐藥，耐藥率為90.0%，見表1。

表1 萬古霉素和利福平單用對MRSA的MIC及耐藥性（n=30）

2.2 萬古霉素和利福平聯(lián)用對MRSA的MIC及FIC分布 兩藥聯(lián)用后對MRSA的MIC與單用比較，呈整體下降趨勢，見表2。FIC為0.160~1.000 μg/mL，中位FIC為0.460 μg/mL；絕大部分表現(xiàn)為協(xié)同作用[86.7%（26/30）]，少數(shù)為相加作用[13.3%（4/30）]，未見表現(xiàn)為無關(guān)及拮抗作用者。

表2 萬古霉素和利福平聯(lián)用對MRSA的MIC（n=30）

2.3 萬古霉素、利福平單用和聯(lián)用的累積抑菌百分率

萬古霉素與利福平聯(lián)用后與單用比較，累積抑菌率曲線明顯左移，表明兩藥聯(lián)用后抗菌作用相互增強，見圖1。

圖1 萬古霉素、利福平單用和聯(lián)用的累積抑菌百分率（n=30）

3 討 論

MRSA是醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌之一，其在金黃色葡萄球菌中的比例逐年攀升，由其導致的感染對人類健康和醫(yī)療事業(yè)構(gòu)成嚴重威脅。幾乎所有的MRSA均為多重耐藥菌，對包括β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類及氨基糖苷類等在內(nèi)的絕大多數(shù)臨床常用抗菌藥物均表現(xiàn)為耐藥。多肽類抗生素——萬古霉素是有效治療MRSA感染的可選擇藥物之一，能干擾革蘭陽性菌細胞壁合成的最終階段，即干擾粘肽末端D-Ala-D-Ala二肽整合到分裂細胞的細胞內(nèi)而使細菌死亡。有研究發(fā)現(xiàn)，耐藥菌中該二肽發(fā)生改變可使萬古霉素失去作用靶位，從而表現(xiàn)為耐藥[10]。單藥抗MRSA感染的諸多局限性也使臨床治療面臨極大挑戰(zhàn)。

本研究測定的30株MRSA對利福平的耐藥率為90.0%，略低于林德峰等[9]的研究結(jié)果，可能與不同地區(qū)對利福平的使用頻率的差異有關(guān)，且利福平對30株MRSA的MIC呈兩極分布現(xiàn)象，表現(xiàn)為極為敏感（MIC≤0.125 μg/mL）或嚴重耐藥（MIC≥64.000 μg/mL），其原因可能與利福平單用極易產(chǎn)生耐藥性有關(guān)[7]，故一般不推薦利福平單用治療MRSA感染。而另一方面，30株MRSA對萬古霉素的耐藥率為3.3%，也警示臨床萬古霉素耐藥菌株的出現(xiàn)已非個別現(xiàn)象。本研究體外藥敏試驗結(jié)果表明，單用萬古霉素對30株MRSA的MIC90為2.000 μg/mL，而聯(lián)用利福平后MIC90下降至0.250 μg/mL。單用利福平對30株MRSA的MIC90為64.000 μg/mL，而聯(lián)用利福平后MIC90下降至16.000 μg/mL，提示萬古霉素和利福平聯(lián)用后對MRSA的體外抗菌活性較單用兩藥時明顯提高。而萬古霉素與利福平聯(lián)用后與單用比較，累積抑菌率曲線明顯左移，也表明兩藥聯(lián)用后抗菌作用相互增強。從作用機制來看，萬古霉素干擾細菌細胞壁合成，利福平則為抑制菌體多聚酶活性，阻止細菌mRNA的形成，從而阻斷菌體蛋白質(zhì)的合成。兩藥作用于細菌生長繁殖過程的不同階段，可能是導致其聯(lián)用抗菌作用增加的原因之一，但具體機制仍有待于進一步研究。臨床對由MRSA所致的感染可根據(jù)藥敏試驗結(jié)果制定給藥方案，結(jié)合病情和個體情況可考慮聯(lián)用萬古霉素和利福平進行治療。

[1] MoneckeS，CoombsG，ShoreAC，etal.Afieldguidetopandemic，epidemic and sporadic clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. PLoS One，2011，6（4）：e17936.

[2] Garza-González E，Dowzicky MJ.Changes in staphylococcus aureussusceptibility across Latin America between 2004 and 2010[J].Braz J Infect Dis，2013，17（1）：13-19.

[3] Lee BY，Singh A，David MZ，et al.The economic burden of communityassociated methicillin-resistant Staphylococcus aureus（CA-MRSA）[J]. Clin Microbiol Infect，2013，19（6）：528-536.

[4] Chen CJ，Huang YC.New epidemiology of Staphylococcus aureus infection in Asia[J].Clin Microbiol Infect，2014，20（7）：605-623.

[5] van Hal SJ，F(xiàn)owler VG Jr.Is it time to replace vancomycin in the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections?[J].Clin Infect Dis，2013，56（12）：1779-1788.

[6] Gould FK，Brindle R，Chadwick PR，et al.Guidelines（2008）for the prophylaxis and treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）infections in the United Kingdom[J].J Antimicrob Chemother，2009，63（5）：849-861.

[7] Tang HJ，Chen CC，Cheng KC，et al.In vitro efficacies and resistance profiles of rifampin-based combination regimens for biofilm-embedded methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Antimicrob Agents Chemother，2013，57（11）：5717-5720.

[8] 陳華燕，徐愛飛，周道政，等.利福平聯(lián)合其他抗生素對骨科內(nèi)置物術(shù)后感染常見致病菌的體外抗菌活性觀察[J].山東醫(yī)藥，2013，53（36）：36-38.

[9] 林德峰，于旭紅，白艷，等.米諾環(huán)素與利福平聯(lián)用對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌活性[J].中國臨床藥理學雜志，2010，26（11）：813-816.

[10]Liu C，Bayer A，Cosgrove SE，et al.Clinical practice guidelines by the infectious diseases society of america for the treatment of methicillinresistant Staphylococcus aureus infections in adults and children[J].Clin Infect Dis，2011，52（3）：e18-55.

Evaluation on in vitro antibacterial activity of vancomycin combined with rifampin against MRSA*

Zhang Yinying，Li Ye
（Clinical Pharmacy Room，Jiaxing Municipal Maternity and Child Health Care Hospital，Jiaxing，Zhejiang 314000，China）

Objective To evaluate the in vitro antibacterial activity of combination of vancomycin and rifampin against methicillin-resistant staphylococcus aureus（MRSA）.Methods The minimal inhibitory concentration（MIC）of vancomycin and rifampin on 30 strains of MRSA was respectively detected by using the broth dilution method；with the detected single drug MIC as the basis，the fraction inhibitory concentration（FIC）of the combination of vancomycin plus rifampin against 30 strains of MRSA was detected by adopting the checkerboard design.The antibacterial activity of combination of these two drugs on MRSA was investigated.Results The resistant rate of 30 strains of MRSA to vancomycin and rifampin was 3.3%and 90%respectively.Most manifestations of 2-drug combined medication were the synergic action[86.7%（26/30）]and the minority were the additive action [13.3%（4/30）]，neither non-correlative nor antagonism action was seen.Conclusion Single vancomycin and rifampin to MRSA manifest the partial effect，after their combination，the antibacterial activity to MRSA is enhanced，which is mainly synergic action. Clinically treating severe infection caused by MRSA can adopt the combination scheme of vancomycin and rifampin according to the drug susceptibility test results.

Methicillin resistance； Staphylococcus aureus； Vancomycin/pharmacology； Rifampin/pharmacology

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.22.002

A

1009-5519（2016）22-3423-03

2016-07-07）

浙江省嘉興市科技局一般科技計劃項目（2014AY21047）。

張寅英（1987-），碩士研究生，主要從事臨床藥學工作。