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        口腔癌患者應(yīng)用二甲雙胍對KB細胞增殖及凋亡的影響

        2016-12-05 01:25:08仲曉飛杜原宏
        實用癌癥雜志 2016年11期
        關(guān)鍵詞:口腔癌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存活率

        仲曉飛 杜原宏 馬 鐵

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        口腔癌患者應(yīng)用二甲雙胍對KB細胞增殖及凋亡的影響

        仲曉飛 杜原宏 馬 鐵

        目的 研究口腔癌患者應(yīng)用二甲雙胍進行治療,觀察其對KB細胞的增殖以及凋亡的影響。方法 收集生化藥理研究室的人口腔癌KB細胞,采用隨機數(shù)字表法將人口腔癌KB細胞分別采用不同濃度的二甲雙胍進行處理,并觀察24 h、48 h、72 h細胞增殖的情況,采用碘化丙啶(PI)染色進行檢測KB細胞的凋亡情況,采取Western blot方法分別處理不同的時間進行檢測GRP78和Caspase-3蛋白的表達。結(jié)果 經(jīng)過濃度為5 mol的二甲雙胍進行處理的KB細胞24 h、48 h、72 h細胞存活率之間進行比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);采用濃度分別為2.5 mol與 5 mol的二甲雙胍處理,細胞的凋亡率分別為12.13%、25.12%,組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);采用濃度為5 mol的二甲雙胍處理不同的時間,可觀察到GRP78的表達被誘導(dǎo)且Caspase-3蛋白被激活。結(jié)論 二甲雙胍作為新型的抗癌癥輔助藥物,具有良好的抑制人口腔癌KB細胞的增殖、并誘導(dǎo)其凋亡的作用,為臨床治療口腔癌提供了新的治療途徑。

        口腔癌;二甲雙胍;KB細胞;增殖;凋亡

        (ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1782~1784)

        口腔癌是人體頭頸部較好發(fā)的腫瘤之一,這也是一個由多種因素參與并產(chǎn)生的,其中最常見的因素有病毒的感染以及不良的飲食方式等,尤其是吸煙與飲酒的危險因素最大[1-2]。目前在臨床上大多采取手術(shù)進行口腔癌治療,但是由于早期癥狀不明顯,容易被忽視,因此大部分患者確診時處于中晚期,這不僅給治療帶來了一定的難度,也對患者造成了極大的痛苦[3-4]。部分患者聯(lián)合放化療進行治療,但由于個體的差異有些患者會產(chǎn)生藥物的耐藥性,而大大降低治療效果[5]。近年來二甲雙胍逐漸被應(yīng)用于臨床治療口腔癌,并具有一定的效果。本文旨在研究口腔癌患者應(yīng)用二甲雙胍進行治療,觀察KB細胞的增殖以及凋亡的影響。現(xiàn)報告如下。

        1 材料與方法

        1.1 研究材料

        收集我院從2013年7月至2014年8月生化藥理研究室的人口腔癌KB細胞采用隨機數(shù)字表法進行研究。其中生物與化學(xué)試劑包括有:MEM培養(yǎng)基;二甲雙胍;胰蛋白酶;胎牛血清;兔抗人Caspase-3抗體;兔抗人GRP78抗體;鼠抗人β-actin等。

        1.2 研究方法

        1.2.1 細胞增殖與存活率的計算 在含有10%胎牛血清的新鮮MEM培養(yǎng)液中將KB細胞進行接種培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為37 ℃,培養(yǎng)箱中置有5%的CO2。采用MTT法檢測細胞的生長情況,分別加入二甲雙胍藥物濃度為1.25 mmol/L,2.5 mmol/L,5 mmol/L,10 mmol/L,20 mmol/L的新鮮培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)24 h,48 h,72 h,重復(fù)進行3次試驗后計算細胞的存活率。

        1.2.2 細胞凋亡的檢測 采用碘化丙啶染色的方法檢測細胞的凋亡情況。將KB細胞制成單細胞懸液進行接種,分別加入濃度為2.5 mmol/L與5 mmol/L的培養(yǎng)液觀察24 h后進行離心10 min,頻率為1 500 r/min,將上清液棄去,在4 ℃的環(huán)境中加入75%乙醇進行固定一晚,第2天將固定液置于5 ml的EP管中,進行再一次的頻率為1 000 r/min的離心,時間為10 min,再次將上清液棄去,并進行碘化丙啶染色,靜置2 h并避光后進行流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。

        1.2.3 GRP78與Caspase-3的表達 采用濃度為5 mol的二甲雙胍處理不同的時間,觀察GRP78與Caspase-3的表達情況,取成對數(shù)生長期的KB細胞接種于細胞培養(yǎng)板中進行培養(yǎng),并加入濃度為5 mol的二甲雙胍。

        1.3 觀察指標

        觀察二甲雙胍對人口腔癌KB細胞的增殖抑制作用以及凋亡作用。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

        將所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,定性資料采用獨立樣本R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗。按照α=0.05的檢驗水準,以P<0.05為標準進行參照差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 二甲雙胍處理口腔癌KB細胞的增殖抑制作用

        經(jīng)過濃度為5 mol的二甲雙胍進行處理的KB細胞24 h、48 h、72 h細胞存活率分別為67.50%、37.20%、15.61%,處理48 h、72 h的KB細胞存活率與24 h的比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=18.403、55.433,P均<0.05)。

        2.2 二甲雙胍處理口腔癌KB細胞的凋亡作用

        采用濃度分別為2.5 mol與 5 mol的二甲雙胍處理,細胞的凋亡率分別為12.13%、25.12%,組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.567,P<0.05)。

        2.3 二甲雙胍處理口腔癌KB細胞對 GRP78 與Caspase-3的表達所產(chǎn)生的影響作用

        采用濃度為5 mol的二甲雙胍處理不同的時間,可觀察到GRP78的表達被誘導(dǎo)且Caspase-3蛋白被激活。見圖1。

        圖1 經(jīng)二甲雙胍處理口腔癌KB細胞后GRP78與Caspase-3的表達

        2.4 二甲雙胍對于KB細胞集落克隆的抑制作用

        隨著二甲雙胍濃度的增高,口腔癌細胞增殖抑制作用對于集落克隆染色檢測越強。圖2分別表示0 mmol/L,0.25 mmol/L,0.5 mmol/L,1 mmol/L濃度的二甲雙胍。

        2.5 人口腔癌KB細胞線粒體膜電位采用二甲雙胍進行線粒體膜電位檢測試劑盒的檢測結(jié)果

        經(jīng)過24 h的處理后,與陰性對照組進行比較,熒光的轉(zhuǎn)變由紅色向綠色,這表示口腔癌KB細胞線粒體膜電位下降,細胞發(fā)生凋亡。

        3 討論

        在全世界范圍中口腔癌是常見的六大腫瘤,美國疾控中心在2010年統(tǒng)計到全球患有口腔癌的患者大約有50萬人,且死亡率極高[6-7]。處于中晚期的口腔癌患者大多采取手術(shù)聯(lián)合放化療的方式進行治療,雖然治療效果較好,但患者的5年生存率較低[8]。由于口腔的解剖位置較為表淺,大多是由于癌前病變所引起,包括人們的不良生活方式比如吸煙以及飲酒以及食用刺激性較大的實物所導(dǎo)致??谇话┑幕颊叩目谇还δ艹3T獾絿乐氐膿p害,對于患者的飲食、語言交流以及社會交往均帶來了一定的不便[9]。處于早期口腔癌的患者對于其局部功能以及外觀的影響較小,因此早期發(fā)現(xiàn)并進行治療在臨床上具有一定的積極意義。

        二甲雙胍是臨床上廣泛使用的一種降糖藥物,但其除了降血糖的藥理作用之外,還可用于抗腫瘤,能夠有效抑制腫瘤的生長并促進腫瘤細胞的凋亡,具有解除腫瘤的耐藥性以及抗腫瘤血管生成的作用[10-11]。

        本研究經(jīng)過對人口腔癌KB細胞的培養(yǎng)與研究為臨床治療口腔癌提供了新的治療途徑,即找到了腫瘤細胞新的敏感靶點而達到提高治療效果的目的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中最具有代表性的應(yīng)激蛋白之一是GRP78,在應(yīng)激狀態(tài)下如低氧、低糖、低鈣等情況下表達將會增加[12-13],其恢復(fù)細胞功能與保護內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引起的細胞損傷的機制是通過激活未折疊蛋白來參加反應(yīng)[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的中心調(diào)節(jié)者是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78,其在細胞中發(fā)揮著極其重要的作用,比如促進非折疊蛋白質(zhì)的降解并幫助蛋白質(zhì)的折疊與聚集以及控制激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜感受器等方面,UPR的啟動以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)均需要生物標記GRP78來誘導(dǎo);在沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的狀態(tài)下GRP78分別結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的應(yīng)激感受蛋白IREla,ATF6,PERK,且處于無活性的狀態(tài)。有研究結(jié)果表明[15],當(dāng)細胞中的鈣離子缺乏營養(yǎng)與缺氧而處于平衡失調(diào)的狀態(tài)激活未折疊的蛋白而發(fā)生反應(yīng)時通過起始的3條信號通路IRE1,PERK,ATF6,可以使多基因轉(zhuǎn)錄并激活,選擇性的翻譯具有特性的蛋白質(zhì),從而蛋白質(zhì)的翻譯與折疊得以正確進行而來促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的適應(yīng)。當(dāng)細胞中的鈣離子缺乏營養(yǎng)與缺氧而處于平衡失調(diào)的狀態(tài)下,此時的未折疊的蛋白堆積觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài),造成GRP78與應(yīng)激感受蛋白處于分離狀態(tài),所以口腔癌細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑化療耐受的原因之一是GRP78的高表達。

        圖2 不同濃度二甲雙胍對KB細胞集落克隆的抑制作用

        綜上所述,二甲雙胍具有抑制人口腔癌KB細胞的增殖、并誘導(dǎo)其凋亡的作用,作為一種新型的抗癌癥輔助藥物,這為臨床治療口腔癌提供了新的治療途徑,但由于本研究的局限性,二甲雙胍抗腫瘤的用藥濃度以及給藥途經(jīng)對患者所造成的耐受性還需進一步進行探討。

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        (編輯:甘 艷)

        Effect of Metformin on the Proliferation and Apoptosis of KB Cells in Patients with Oral Cancer

        ZHONGXiaofei,DUYuanhong,MATie.

        463HospitalofPLA,Shenyang,110042

        Objective To study the effect of metformin on the proliferation and apoptosis of KB cells in oral cancer patients.Methods KB cells were treated with different concentrations of metformin,and cell proliferation at 24 h,48 h,72 h were observed.The apoptosis of KB cells was detected by PI staining.The expression of GRP78 and Caspase-3 protein were detected by blot Western method.Results The survival rates of KB cells at 24 h,48 h,72 h treated by 5mol metformin had statistically significant difference(P<0.05).The apoptosis rate of KB cells treated by 2.5 mol and 5 mol metformin were 2.13% and 25.12%,respectively,there had statistically significant difference (P<0.05).The expression of GRP78 was induced and Caspase-3 was activated when treated by 5 mol metformin.Conclusion Metformin as a new type of anticancer drugs has a good effect in inhibiting proliferation and inducing apoptosis of KB cells,which provides a new way for clinical treatment of oral cancer.

        Oral cancer;Metformin;KB cells;Proliferation;Apoptosis

        110042 解放軍第四六三醫(yī)院

        10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.012

        R739.85

        A

        1001-5930(2016)11-1782-03

        2015-12-08

        2016-04-05)

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