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        口腔癌患者應(yīng)用二甲雙胍對(duì)KB細(xì)胞增殖及凋亡的影響

        2016-12-05 01:25:08仲曉飛杜原宏
        實(shí)用癌癥雜志 2016年11期
        關(guān)鍵詞:口腔癌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存活率

        仲曉飛 杜原宏 馬 鐵

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        口腔癌患者應(yīng)用二甲雙胍對(duì)KB細(xì)胞增殖及凋亡的影響

        仲曉飛 杜原宏 馬 鐵

        目的 研究口腔癌患者應(yīng)用二甲雙胍進(jìn)行治療,觀察其對(duì)KB細(xì)胞的增殖以及凋亡的影響。方法 收集生化藥理研究室的人口腔癌KB細(xì)胞,采用隨機(jī)數(shù)字表法將人口腔癌KB細(xì)胞分別采用不同濃度的二甲雙胍進(jìn)行處理,并觀察24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖的情況,采用碘化丙啶(PI)染色進(jìn)行檢測(cè)KB細(xì)胞的凋亡情況,采取Western blot方法分別處理不同的時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)GRP78和Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)過濃度為5 mol的二甲雙胍進(jìn)行處理的KB細(xì)胞24 h、48 h、72 h細(xì)胞存活率之間進(jìn)行比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);采用濃度分別為2.5 mol與 5 mol的二甲雙胍處理,細(xì)胞的凋亡率分別為12.13%、25.12%,組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);采用濃度為5 mol的二甲雙胍處理不同的時(shí)間,可觀察到GRP78的表達(dá)被誘導(dǎo)且Caspase-3蛋白被激活。結(jié)論 二甲雙胍作為新型的抗癌癥輔助藥物,具有良好的抑制人口腔癌KB細(xì)胞的增殖、并誘導(dǎo)其凋亡的作用,為臨床治療口腔癌提供了新的治療途徑。

        口腔癌;二甲雙胍;KB細(xì)胞;增殖;凋亡

        (ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1782~1784)

        口腔癌是人體頭頸部較好發(fā)的腫瘤之一,這也是一個(gè)由多種因素參與并產(chǎn)生的,其中最常見的因素有病毒的感染以及不良的飲食方式等,尤其是吸煙與飲酒的危險(xiǎn)因素最大[1-2]。目前在臨床上大多采取手術(shù)進(jìn)行口腔癌治療,但是由于早期癥狀不明顯,容易被忽視,因此大部分患者確診時(shí)處于中晚期,這不僅給治療帶來了一定的難度,也對(duì)患者造成了極大的痛苦[3-4]。部分患者聯(lián)合放化療進(jìn)行治療,但由于個(gè)體的差異有些患者會(huì)產(chǎn)生藥物的耐藥性,而大大降低治療效果[5]。近年來二甲雙胍逐漸被應(yīng)用于臨床治療口腔癌,并具有一定的效果。本文旨在研究口腔癌患者應(yīng)用二甲雙胍進(jìn)行治療,觀察KB細(xì)胞的增殖以及凋亡的影響?,F(xiàn)報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1 研究材料

        收集我院從2013年7月至2014年8月生化藥理研究室的人口腔癌KB細(xì)胞采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行研究。其中生物與化學(xué)試劑包括有:MEM培養(yǎng)基;二甲雙胍;胰蛋白酶;胎牛血清;兔抗人Caspase-3抗體;兔抗人GRP78抗體;鼠抗人β-actin等。

        1.2 研究方法

        1.2.1 細(xì)胞增殖與存活率的計(jì)算 在含有10%胎牛血清的新鮮MEM培養(yǎng)液中將KB細(xì)胞進(jìn)行接種培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為37 ℃,培養(yǎng)箱中置有5%的CO2。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,分別加入二甲雙胍藥物濃度為1.25 mmol/L,2.5 mmol/L,5 mmol/L,10 mmol/L,20 mmol/L的新鮮培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)24 h,48 h,72 h,重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)后計(jì)算細(xì)胞的存活率。

        1.2.2 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 采用碘化丙啶染色的方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。將KB細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液進(jìn)行接種,分別加入濃度為2.5 mmol/L與5 mmol/L的培養(yǎng)液觀察24 h后進(jìn)行離心10 min,頻率為1 500 r/min,將上清液棄去,在4 ℃的環(huán)境中加入75%乙醇進(jìn)行固定一晚,第2天將固定液置于5 ml的EP管中,進(jìn)行再一次的頻率為1 000 r/min的離心,時(shí)間為10 min,再次將上清液棄去,并進(jìn)行碘化丙啶染色,靜置2 h并避光后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

        1.2.3 GRP78與Caspase-3的表達(dá) 采用濃度為5 mol的二甲雙胍處理不同的時(shí)間,觀察GRP78與Caspase-3的表達(dá)情況,取成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KB細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng),并加入濃度為5 mol的二甲雙胍。

        1.3 觀察指標(biāo)

        觀察二甲雙胍對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞的增殖抑制作用以及凋亡作用。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        將所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,定性資料采用獨(dú)立樣本R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn)。按照α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn),以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行參照差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 二甲雙胍處理口腔癌KB細(xì)胞的增殖抑制作用

        經(jīng)過濃度為5 mol的二甲雙胍進(jìn)行處理的KB細(xì)胞24 h、48 h、72 h細(xì)胞存活率分別為67.50%、37.20%、15.61%,處理48 h、72 h的KB細(xì)胞存活率與24 h的比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.403、55.433,P均<0.05)。

        2.2 二甲雙胍處理口腔癌KB細(xì)胞的凋亡作用

        采用濃度分別為2.5 mol與 5 mol的二甲雙胍處理,細(xì)胞的凋亡率分別為12.13%、25.12%,組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.567,P<0.05)。

        2.3 二甲雙胍處理口腔癌KB細(xì)胞對(duì) GRP78 與Caspase-3的表達(dá)所產(chǎn)生的影響作用

        采用濃度為5 mol的二甲雙胍處理不同的時(shí)間,可觀察到GRP78的表達(dá)被誘導(dǎo)且Caspase-3蛋白被激活。見圖1。

        圖1 經(jīng)二甲雙胍處理口腔癌KB細(xì)胞后GRP78與Caspase-3的表達(dá)

        2.4 二甲雙胍對(duì)于KB細(xì)胞集落克隆的抑制作用

        隨著二甲雙胍濃度的增高,口腔癌細(xì)胞增殖抑制作用對(duì)于集落克隆染色檢測(cè)越強(qiáng)。圖2分別表示0 mmol/L,0.25 mmol/L,0.5 mmol/L,1 mmol/L濃度的二甲雙胍。

        2.5 人口腔癌KB細(xì)胞線粒體膜電位采用二甲雙胍進(jìn)行線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果

        經(jīng)過24 h的處理后,與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較,熒光的轉(zhuǎn)變由紅色向綠色,這表示口腔癌KB細(xì)胞線粒體膜電位下降,細(xì)胞發(fā)生凋亡。

        3 討論

        在全世界范圍中口腔癌是常見的六大腫瘤,美國(guó)疾控中心在2010年統(tǒng)計(jì)到全球患有口腔癌的患者大約有50萬人,且死亡率極高[6-7]。處于中晚期的口腔癌患者大多采取手術(shù)聯(lián)合放化療的方式進(jìn)行治療,雖然治療效果較好,但患者的5年生存率較低[8]。由于口腔的解剖位置較為表淺,大多是由于癌前病變所引起,包括人們的不良生活方式比如吸煙以及飲酒以及食用刺激性較大的實(shí)物所導(dǎo)致??谇话┑幕颊叩目谇还δ艹3T獾絿?yán)重的損害,對(duì)于患者的飲食、語言交流以及社會(huì)交往均帶來了一定的不便[9]。處于早期口腔癌的患者對(duì)于其局部功能以及外觀的影響較小,因此早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行治療在臨床上具有一定的積極意義。

        二甲雙胍是臨床上廣泛使用的一種降糖藥物,但其除了降血糖的藥理作用之外,還可用于抗腫瘤,能夠有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,具有解除腫瘤的耐藥性以及抗腫瘤血管生成的作用[10-11]。

        本研究經(jīng)過對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞的培養(yǎng)與研究為臨床治療口腔癌提供了新的治療途徑,即找到了腫瘤細(xì)胞新的敏感靶點(diǎn)而達(dá)到提高治療效果的目的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中最具有代表性的應(yīng)激蛋白之一是GRP78,在應(yīng)激狀態(tài)下如低氧、低糖、低鈣等情況下表達(dá)將會(huì)增加[12-13],其恢復(fù)細(xì)胞功能與保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引起的細(xì)胞損傷的機(jī)制是通過激活未折疊蛋白來參加反應(yīng)[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的中心調(diào)節(jié)者是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78,其在細(xì)胞中發(fā)揮著極其重要的作用,比如促進(jìn)非折疊蛋白質(zhì)的降解并幫助蛋白質(zhì)的折疊與聚集以及控制激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜感受器等方面,UPR的啟動(dòng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)均需要生物標(biāo)記GRP78來誘導(dǎo);在沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的狀態(tài)下GRP78分別結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的應(yīng)激感受蛋白IREla,ATF6,PERK,且處于無活性的狀態(tài)。有研究結(jié)果表明[15],當(dāng)細(xì)胞中的鈣離子缺乏營(yíng)養(yǎng)與缺氧而處于平衡失調(diào)的狀態(tài)激活未折疊的蛋白而發(fā)生反應(yīng)時(shí)通過起始的3條信號(hào)通路IRE1,PERK,ATF6,可以使多基因轉(zhuǎn)錄并激活,選擇性的翻譯具有特性的蛋白質(zhì),從而蛋白質(zhì)的翻譯與折疊得以正確進(jìn)行而來促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的適應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞中的鈣離子缺乏營(yíng)養(yǎng)與缺氧而處于平衡失調(diào)的狀態(tài)下,此時(shí)的未折疊的蛋白堆積觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài),造成GRP78與應(yīng)激感受蛋白處于分離狀態(tài),所以口腔癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑化療耐受的原因之一是GRP78的高表達(dá)。

        圖2 不同濃度二甲雙胍對(duì)KB細(xì)胞集落克隆的抑制作用

        綜上所述,二甲雙胍具有抑制人口腔癌KB細(xì)胞的增殖、并誘導(dǎo)其凋亡的作用,作為一種新型的抗癌癥輔助藥物,這為臨床治療口腔癌提供了新的治療途徑,但由于本研究的局限性,二甲雙胍抗腫瘤的用藥濃度以及給藥途經(jīng)對(duì)患者所造成的耐受性還需進(jìn)一步進(jìn)行探討。

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        (編輯:甘 艷)

        Effect of Metformin on the Proliferation and Apoptosis of KB Cells in Patients with Oral Cancer

        ZHONGXiaofei,DUYuanhong,MATie.

        463HospitalofPLA,Shenyang,110042

        Objective To study the effect of metformin on the proliferation and apoptosis of KB cells in oral cancer patients.Methods KB cells were treated with different concentrations of metformin,and cell proliferation at 24 h,48 h,72 h were observed.The apoptosis of KB cells was detected by PI staining.The expression of GRP78 and Caspase-3 protein were detected by blot Western method.Results The survival rates of KB cells at 24 h,48 h,72 h treated by 5mol metformin had statistically significant difference(P<0.05).The apoptosis rate of KB cells treated by 2.5 mol and 5 mol metformin were 2.13% and 25.12%,respectively,there had statistically significant difference (P<0.05).The expression of GRP78 was induced and Caspase-3 was activated when treated by 5 mol metformin.Conclusion Metformin as a new type of anticancer drugs has a good effect in inhibiting proliferation and inducing apoptosis of KB cells,which provides a new way for clinical treatment of oral cancer.

        Oral cancer;Metformin;KB cells;Proliferation;Apoptosis

        110042 解放軍第四六三醫(yī)院

        10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.012

        R739.85

        A

        1001-5930(2016)11-1782-03

        2015-12-08

        2016-04-05)

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