黃敏欣，洪澤淳，趙文紅*，朱豪，王輝，白衛(wèi)東

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225；2.廣東省食品檢驗所，廣東廣州510000）

紅曲對廣東客家黃酒發(fā)酵及產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響

黃敏欣1，洪澤淳2，趙文紅1*，朱豪1，王輝1，白衛(wèi)東1

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225；2.廣東省食品檢驗所，廣東廣州510000）

該該文研究了紅曲對廣東客家黃酒發(fā)酵及產(chǎn)γ-氨基丁酸（GABA）的影響。研究結(jié)果表明，紅曲糖化力和液化力最高，酯化力較低；酒藥的糖化力和液化力最低；麥曲酯化力高。紅曲對客家黃酒發(fā)酵過程中總糖、總酸、pH、氨基酸態(tài)氮、酒精度、GABA含量影響較大，添加紅曲與麥曲、酒藥共酵的客家黃酒在發(fā)酵過程中微生物的代謝活動旺盛，pH、酒精度較低，總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮含量較高，GABA含量達到最高為257.4 mg/L，是未添加紅曲的黃酒2.16倍。采用紅曲與麥曲、酒藥共酵可提高客家黃酒的營養(yǎng)價值。

紅曲；廣東客家黃酒；發(fā)酵；γ-氨基丁酸

廣東客家黃酒是客家人獨有的民間傳統(tǒng)發(fā)酵型米酒，主要分布在廣東河源、梅州一帶[1]。當?shù)貗D女們在坐月子期間會用客家黃酒熬姜絲和雞肉，普通大眾會將其與桂圓、紅棗和人參同煮，起到調(diào)味以及滋補身體的作用?？图尹S酒釀造用的酒曲含有多種微生物，這些微生物對發(fā)酵起到十分重要的作用[2]。客家黃酒主要特點是以紅曲為主要酒曲，輔以麥曲和酒藥的多菌種混合發(fā)酵[3]，而紹興黃酒使用麥曲釀造，這也是客家黃酒與紹興黃酒的區(qū)別之處。

紅曲是廣東客家黃酒生產(chǎn)的糖化發(fā)酵劑之一[4]，其除了能產(chǎn)生大量天然紅曲色素以外，酶系十分豐富，產(chǎn)生的糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶、酯化酶等起到糖化和酒化作用[5]，并對酒的口感、風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生一定影響。同時，紅曲一直被認為是具有藥用和食用雙重功效的產(chǎn)品，可以產(chǎn)生γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等次級代謝產(chǎn)物[6]。GABA具有提高記憶力、降血壓、活化肝腎及防止動脈硬化等功能[7]。紅曲對客家黃酒發(fā)酵產(chǎn)生的影響需深入研究，經(jīng)紅曲釀制的客家黃酒中GABA具體含量以及利用紅曲進行發(fā)酵時GABA受到哪些影響尚不明確。因此，本研究添加不同的酒曲釀造客家黃酒，檢測黃酒中發(fā)酵過程中相關(guān)物質(zhì)含量的動態(tài)變化，探究紅曲對客家黃酒發(fā)酵和GABA的影響，這對研究酒曲對客家黃酒發(fā)酵的作用具有十分重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

紅曲、麥曲、酒藥：廣東省紫金縣某酒廠提供；糯米：山西豐園食品有限公司；米酒（29度）：廣東石灣酒廠有限公司；GABA標準品、氨基酸混標、鄰苯二甲醛（o-phthalalde-hyde，OPA）衍生劑、磷酸鹽緩沖液：美國Agilent科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：廣州自力色譜科儀有限公司；無水葡萄糖、氫氧化鈉、硫酸銅、冰乙酸、無水碳酸鈉、無水乙酸鈉（分析純）：天津富宇精細化工有限公司；磷酸二氫鈉、酒石酸鉀鈉（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

1100系列高效液相色譜儀：美國Agilent科技有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；LX-C35L自動電熱壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；BS223S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠；TG16-W高速離心機：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；MJ-176NR多功能粉碎機；日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社；VAL1酒精計：上海一恒科技有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1紅曲對客家黃酒發(fā)酵的影響

（1）不同酒曲配方釀造客家黃酒

采用表1的3種酒曲配方，按照客家黃酒生產(chǎn)工藝來釀造黃酒?？图尹S酒生產(chǎn)工藝流程為：

原料→浸米→蒸飯→攤涼→拌曲→前發(fā)酵（7 d，32℃）→加米酒進行后發(fā)酵（23 d，20℃）→壓榨→澄清→煎酒（80℃）→過濾→裝壇→陳釀

表1　客家黃酒的不同酒曲配方Table 1　Different koji formula of Hakka rice wine

（2）客家黃酒發(fā)酵過程中各項指標的測定

客家黃酒中總糖、總酸、pH、氨基酸態(tài)氮、酒精度的測定：按GB/T 13662—2008《黃酒》[9]中的方法進行。

（3）酒曲發(fā)酵性能的測定

試樣在規(guī)定條件下，糖化力以費林法測定所生成的葡萄糖量表示。l g絕干曲在該條件下l h能液化淀粉的克數(shù)，表示液化力的大小，以U表示。在規(guī)定的試驗條件下，大曲中酯化酶催化游離有機酸與乙醇合成酯，再用皂化法測定所生成的總酯（以己酸乙酯計），表示其酯化力。酒曲糖化力、液化力、酯化力測定：按QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[8]進行。

1.3.2紅曲對客家黃酒產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響

高效液相色譜檢測GABA條件：采用紫外檢測檢測器，其檢測波長為340 nm；色譜柱為Agilent氨基酸柱（4.6 mm× 150 mm，3.5 μm），柱溫為40℃；流動相A（NaH2PO4）= 0.02 mol/L（pH值為7.8）；流動相B[甲醇（MeOH）∶乙腈（CH3CN）∶水（H2O）]=45∶45∶10（V/V）梯度洗脫程序見表2。

表2　高效液相色譜梯度洗脫的程序Table 2　Gradient elution program of high performance liquid chromatography

依次吸取0 H2O→5 μL緩沖液→1 μL OPA衍生劑→0 H2O→10 μL酒樣→0 H2O→進樣。

1.3.3數(shù)據(jù)分析與處理

采用SigmaPlot 11.0軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，各組實驗數(shù)據(jù)用X±S（平均數(shù)±標準偏差）表示。

2　結(jié)果與分析

2.1酒曲發(fā)酵性能的分析

表3　不同酒曲的發(fā)酵性能Table 3　Fermentation performance of different koji

不同酒曲的發(fā)酵性能指標見表3。由表3可知，紅曲糖化力和液化力最高，分別達到（746±5.23）U和（0.671±0.003）U，酯化力較低為（8.8±0.009）g/L；酒藥的糖化力和液化力最低，分別為（353±4.15）U和（0.026±0.002）U；麥曲酯化力最高，為（14.3±0.011）g/L。紅曲糖化力和液化力高，微生物分解淀粉為糖的能力強，可提高黃酒總糖含量。麥曲酯化力高，可使產(chǎn)生較多酯類物質(zhì)，香味較濃厚。酒曲復(fù)配優(yōu)勢互補和取長補短，利于曲霉、酵母、細菌等生長繁殖，彌補酶系不足和協(xié)調(diào)糖化發(fā)酵，改善黃酒出酒率和風(fēng)味。

2.2紅曲對客家黃酒發(fā)酵過程中各項指標的影響

廣東客家黃酒發(fā)酵過程中總糖含量、總酸含量、pH和氨基酸態(tài)氮含量以及酒精度是微生物生長代謝和發(fā)酵的重要體現(xiàn)，而酒醪中GABA主要來源于微生物的生長代謝，因此，這些指標可間接說明紅曲微生物的生長代謝情況，從而更好地說明紅曲對客家黃酒產(chǎn)GABA的影響。

2.2.1紅曲對發(fā)酵過程中總糖含量的變化

糖類物質(zhì)能賦予客家黃酒甜味、營養(yǎng)及黏稠感[11]，影響客家黃酒的風(fēng)味，推遲苦味和澀味出現(xiàn)?？图尹S酒中的糖類物質(zhì)經(jīng)淀粉類物質(zhì)水解產(chǎn)生，形成的糖一部分以殘?zhí)切问酱嬖谟诰埔褐校云咸烟菫橹?，其次是麥芽糖和低聚糖等，另一部分則作為營養(yǎng)物被微生物利用，酵母也把糖類物質(zhì)當成營養(yǎng)物來生成酒精。

圖1　紅曲對客家黃酒發(fā)酵過程中總糖含量的影響Fig.1　Effect of red koji on total sugar content in fermentation process of Hakka rice wine

由圖1可知，發(fā)酵初期，酒曲中霉菌等微生物生長和繁殖，可迅速地將原料淀粉進行水解，產(chǎn)生糖類物質(zhì)，因此總糖含量急劇上升。第7天加入白酒后，發(fā)酵醪液被稀釋，同時醪液中糖化菌受抑制，酵母菌發(fā)酵將部分糖分轉(zhuǎn)化為酒精，發(fā)酵醪液總糖下降。到發(fā)酵后期，發(fā)酵醪液中的總糖逐漸趨于平衡，變化開始變小。第30天發(fā)酵結(jié)束時，3號黃酒總糖含量約293.4 g/L，1號黃酒總糖含量約279 g/L，2號黃酒總糖含量約160 g/L。

紅曲的糖化力和液化力最高，微生物分解淀粉為糖的能力強，殘?zhí)呛扛?，因?和3號黃酒總糖含量較高，2號黃酒較低；1號黃酒有麥曲和酒藥參與發(fā)酵，麥曲酯化力高，促進酵母發(fā)酵生成的酒精，進而生成酯類物質(zhì)，因此殘?zhí)遣粩啾唤湍咐?，造成后發(fā)酵過程1號黃酒殘?zhí)橇勘?號黃酒殘?zhí)橇可?。這說明紅曲作為糖化發(fā)酵劑用于客家黃酒的釀造，對糖化發(fā)酵起到重要的作用，能促進淀粉類物質(zhì)水解為低分子的糖類物質(zhì)，供微生物的生長繁殖所利用，有利于微生物代謝來產(chǎn)生更多的代謝產(chǎn)物。

2.2.2紅曲對發(fā)酵過程中總酸含量和pH的變化

紅曲發(fā)酵過程中總酸和pH值的變化見圖2和圖3。由圖2、圖3可知，總酸含量與pH值變化相對應(yīng)，含酸量少則引起酒味淡薄，含酸量太大風(fēng)味也受到影響。廣東客家黃酒中的酸類物質(zhì)主要來源于發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸、微生物呼吸作用產(chǎn)生CO2、酒曲中微生物大量繁殖產(chǎn)生酸類物質(zhì)、酵母發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、蘋果酸及琥珀酸等有機酸，以及原料的帶入等[12]。客家黃酒主酵階段多種微生物參與發(fā)酵，生長旺盛，因此酸類物質(zhì)不斷積累，酒液pH下降。加入大量高濃度白酒后，酒液被稀釋導(dǎo)致pH上升，之后幾天由于酵母繁殖抑制雜菌的侵入和生長以及自身產(chǎn)酸，pH稍下降。發(fā)酵后期，營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，酶活性降低，總酸和pH基本平衡，發(fā)酵過程中1號黃酒總酸范圍為5.4～7.0 g/L，pH值約為3.4，2號黃酒總酸范圍為5.0～6.7 g/L，pH值約為4.1，3號黃酒總酸含量范圍為3.7～4.3 g/L，pH值約為4.3。

圖2　紅曲對客家黃酒發(fā)酵過程中總酸含量的影響Fig.2　Effect of red koji on total acids content in fermentation process of Hakka rice wine

圖3　紅曲對客家黃酒發(fā)酵過程中pH的影響Fig.3　Effect of red koji on pH in fermentation process of Hakka rice wine

紅曲中的微生物能產(chǎn)蛋白酶，將蛋白質(zhì)分解為小分子肽和氨基酸，為微生物生長提供營養(yǎng)物質(zhì)[13]。麥曲也可為黃酒釀造提供多種蛋白酶，包括酸性蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶等。與1號黃酒相比，2號和3號黃酒總酸含量較低，pH值較高，這可能是1號黃酒同時含有紅曲和麥曲，紅曲和麥曲含有的大量微生物繁殖產(chǎn)生酸類物質(zhì)，同時，微生物呼吸作用增強，它們分解蛋白質(zhì)等有機物能力提高，因而產(chǎn)生酸類物質(zhì)較多，而2號和3號黃酒發(fā)酵時微生物種類和數(shù)量少，分解蛋白質(zhì)等有機物能力較弱，因此產(chǎn)生氨基酸、有機酸等酸類物質(zhì)較少。這說明紅曲是客家黃酒發(fā)酵過程中必不可少的酒曲，它與麥曲和酒藥共同作用，能促進蛋白質(zhì)等有機物分解產(chǎn)生氨基酸等酸類物質(zhì)，同時加強微生物的呼吸等生命活動，在一定程度上促進微生物的生長代謝。

2.2.3紅曲對發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

圖4　紅曲對客家黃酒發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4　Effect of red koji on amino acid nitrogen content in fermentation process of Hakka rice wine

氨基酸態(tài)氮含量為判斷發(fā)酵程度的一項指標，它是指以氨基酸形式存在的氮元素含量[14]。紅曲發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化結(jié)果見圖4。由圖4可知，發(fā)酵初期，氨基酸態(tài)氮總量逐漸上升，這是因為在此期間原料等蛋白質(zhì)發(fā)生水解生成了低分子肽和氨基酸。當發(fā)酵時間為12～18 d時，氨基酸態(tài)氮含量變化不大。因為酵母、霉菌等繁殖生長生成低分子肽和氨基酸，同時生成的一些肽和氨基酸被微生物當作營養(yǎng)物而損耗掉。到了發(fā)酵后期，酸度和酒精等因素使酵母菌、霉菌等微生物發(fā)生自溶，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量提高。

由圖4可知，發(fā)酵過程中1號黃酒氨基酸態(tài)氮含量最高，3號黃酒次之，2號黃酒最低。因為1號黃酒和3號黃酒發(fā)酵過程中均有紅曲參加，紅曲中微生物發(fā)酵能力比較強，將原料、糖化發(fā)酵劑等配料中的蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為較多的低分子肽和氨基酸，而后發(fā)酵階段1號黃酒氨基態(tài)氮含量增加程度比3號黃酒高，可能是麥曲中含有的酸性蛋白酶分解蛋白質(zhì)，從而造成發(fā)酵醪液中的氨基酸繼續(xù)積累。這與圖2、圖3中總酸和pH的研究結(jié)論一致。說明紅曲中微生物將蛋白質(zhì)分解為氨基酸的能力較強，能發(fā)酵產(chǎn)生更多的氨基酸，這些氨基酸一部分留于酒液中，一部分作為營養(yǎng)物質(zhì)供微生物的生長繁殖所利用，促進了微生物代謝產(chǎn)物的生成。

2.2.4紅曲對發(fā)酵過程中酒精度的變化

紅曲發(fā)酵過程中酒精度的變化結(jié)果見圖5。發(fā)酵初期，酒曲中微生物大量繁殖，酒精含量增加。加白酒后，酒精度迅速增加，后續(xù)發(fā)酵時，營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，酶活性降低，一部分酒精與有機酸反應(yīng)生成風(fēng)味物質(zhì)，另一部分揮發(fā)到空氣中，酒精度有小幅度波動。當酒精度達一定值時，酵母菌活性受抑制，發(fā)酵趨于平衡。由圖5可知，三種黃酒酒精度變化都呈先上升而后平緩趨勢。發(fā)酵初始，分解淀粉得到的糖主要用于酵母自身生長繁殖，之后酵母菌數(shù)量達到穩(wěn)定狀態(tài)，糖分主要被酵母轉(zhuǎn)化為乙醇，酒精度上升較快。發(fā)酵后期酒精度較高，酵母菌活性受抑制，酒精度趨于平穩(wěn)，發(fā)酵結(jié)束時1號、2號和3號的黃酒酒精度分別為12.5%vol、13.6%vol和10.6%vol。

圖5　紅曲對客家黃酒發(fā)酵過程中酒精度的影響Fig.5　Effect of red koji on alcohol content in fermentation process of Hakka rice wine

紅曲的糖化力和液化力最高，淀粉被分解為糖的能力較高，一部分糖被酵母作為營養(yǎng)物質(zhì)利用，產(chǎn)生酒精。這與圖1的結(jié)論一致，因為麥曲酯化力高，促進酵母發(fā)酵生成乙醇，進而生成酯類物質(zhì)，說明殘?zhí)遣粩啾唤湍咐蒙闪溯^多的乙醇。因此，紅曲促進淀粉等有機物的分解，生成了較多的糖被酵母利用，促進了酵母的代謝活動，有利于其代謝產(chǎn)物的生成。

2.3紅曲對客家黃酒發(fā)酵過程中γ-氨基丁酸含量的影響

圖6　紅曲對客家黃酒發(fā)酵過程中GABA含量的影響Fig.6　Effect of red koji on GABA content in fermentation process of Hakka rice wine

紅曲發(fā)酵過程中GABA的變化結(jié)果見圖6。主發(fā)酵階段，原料蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)不斷被分解，微生物利用這些營養(yǎng)物質(zhì)進行大量繁殖和代謝，產(chǎn)生的GABA明顯增多[15]。加入白酒后，糖化菌等被抑制，且溶液被稀釋，GABA含量下降。到后發(fā)酵到21 d時，氨基酸含量幾乎維持在同一水平，增加不明顯，這可能是在產(chǎn)生GABA的同時，酵母等微生物的生長利用了部分GABA作為營養(yǎng)物質(zhì)。發(fā)酵后期，酸度和酒精度等因素使得霉菌、酵母菌等微生物發(fā)生自溶，因此GABA含量增加。

在黃酒發(fā)酵過程中，紅曲可以起到糖化的作用，紅曲中微生物能提供淀粉酶和蛋白酶等，分解淀粉為糖，分解蛋白質(zhì)為小分子肽和氨基酸，為微生物供給碳源等營養(yǎng)物和能量，促進微生物的代謝活動。1號黃酒和3號黃酒產(chǎn)生了更多的GABA，發(fā)酵結(jié)束時1號黃酒和2號黃酒的GABA含量分別是257.4 mg/L、118.9 mg/L，1號黃酒的GABA含量是2號黃酒的2.16倍，這是因為采用紅曲進行發(fā)酵，紅曲中的微生物耐酸、耐高溫及乙醇，發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)被分解為氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的程度較徹底，因此利用這些營養(yǎng)物質(zhì)來進行生命活動的微生物代謝加強，產(chǎn)生更多的GABA。

3　結(jié)論

紅曲糖化力和液化力最高，酯化力較低；酒藥的糖化力和液化力最低；麥曲酯化力高。在客家黃酒發(fā)酵過程中，紅曲對總糖、總酸、pH、氨基酸態(tài)氮、酒精度、GABA含量的影響較大，添加紅曲與麥曲、酒藥共酵的客家黃酒在發(fā)酵過程中微生物的代謝活動旺盛，pH、酒精度較低，總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮含量較高，GABA含量達到最高為257.4 mg/L，是未添加紅曲的黃酒2.16倍，因此紅曲有利于廣東客家黃酒的發(fā)酵及γ-氨基丁酸的產(chǎn)生，可提高客家黃酒的營養(yǎng)。

廣東客家黃酒發(fā)酵是以紅曲為主，麥曲和酒藥為輔，進行開放式的、多菌種的混合發(fā)酵。因此，除了探討紅曲中各種微生物對客家黃酒產(chǎn)GABA的影響外，還需研究麥曲和酒藥中存在哪些微生物對GABA有影響。黃酒發(fā)酵過程中，微生物的發(fā)酵環(huán)境較復(fù)雜，存在多種微生物共同發(fā)酵，那么微生物之間是否有協(xié)同或者相互抑制作用影響了GABA生成，仍需進一步研究。

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Effect of red koji on fermentation and γ-aminobutyric acid production of Guangdong Hakka rice wine

HUANG Minxin1,HONG Zechun2,ZHAO Wenhong1*,ZHU Hao1,WANG Hui1,BAI Weidong1
(1.College of Light Industry and Food Science,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China; 2.Guangdong Provincial Institute of Food Inspection,Guangzhou 510000,China)

Effect of red koji on fermentation and γ-aminobutyric acid(GABA)production of Guangdong Hakka rice wine were studied.The results showed that saccharification and liquefying power of red koji were the highest,but esterification power was a little lower.The saccharification and liquefying power of Chinese yeast starter were the lowest,while esterification power of wheat koji was high.During fermentation process of Hakka rice wine,the red koji had great effect on total sugar,total acid,pH,amino nitrogen acid,alcohol content and GABA.The microorganisms of the Hakka rice winewiththeinoculumofredkoji,wheatkojiandChineseyeastmixturehadhighmetabolicactivity.The pH and alcohol content was low,while the total sugar,total acid,and amino nitrogen acid content was high,and GABA content reached the highest of 257.4 mg/L,which was 2.16 times of the wine without red koji.The co-fermentation of red koji,wheat koji and Chinese yeast starter could improve the nutritional value of Hakka rice wine.

red koji;Guangdong Hakka rice wine;fermentation;γ-aminobutyric acid

TS262.4

0254-5071（2016）10-0046-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.011

2016-05-24

仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院研究生科技創(chuàng)新基金資助項目（KA151495003）；廣東省產(chǎn)學(xué)研項目（2013B090600157）；廣東省自然科學(xué)基金項目（2014A030313592）；廣東省教育廳重點項目（201509010005）

黃敏欣（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。

趙文紅（1966-），女，教授，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。