王琳，陳雙，徐巖

(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇 無錫，214122)

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固相萃取-超高效液相色譜法測(cè)定黃酒中的有機(jī)酸

王琳，陳雙，徐巖*

(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇 無錫，214122)

確定了氨基酸/多肽和色素是黃酒有機(jī)酸色譜分析的主要干擾因素，篩選了對(duì)干擾因素有較強(qiáng)去除能力的固相萃取(SPE)小柱。建立了固相萃取-超高效液相色譜法(SPE-UPLC)快速測(cè)定黃酒中7種主要有機(jī)酸的方法。黃酒樣品采用流動(dòng)相稀釋，經(jīng)活化后的SCX-SPE小柱凈化處理，并使用ACQUITY UPLC HSS T3柱對(duì)黃酒中的7種主要有機(jī)酸進(jìn)行分離檢測(cè)。流動(dòng)相為20 mmol/L NaH2PO4(pH 2.7)，流速為0.25 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。結(jié)果表明，該方法可在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)7種有機(jī)酸的完全分離，各有機(jī)酸在0.100～37 456.000 mg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)均在0.999 3以上，7種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為94.96%～105.08%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.43%～1.79%(n=5)。該方法具有凈化步驟簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)。采用該檢測(cè)方法對(duì)傳統(tǒng)型黃酒(n=12)和清爽型黃酒(n=6)有機(jī)酸含量比較發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)型黃酒總酸含量顯著(P<0.05)高于清爽型黃酒，且這種差異是由于酒石酸、蘋果酸和乳酸含量的顯著差異(P<0.05)造成的。

超高效液相；固相萃??；有機(jī)酸；傳統(tǒng)型黃酒；清爽型黃酒

黃酒是我國(guó)民族特色酒精飲料，具有酒度低、營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特的特點(diǎn)，深受我國(guó)人民的喜愛，是國(guó)家政策重點(diǎn)扶持的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)。黃酒按照釀造工藝不同可以分為傳統(tǒng)型、清爽型和特型3種，其中以傳統(tǒng)型和清爽型黃酒為主。不同類型黃酒感官特征具有鮮明的差異，傳統(tǒng)型黃酒以口味厚重為特色，而清爽型黃酒則具有口味淡雅柔和的特點(diǎn)[1-2]，但是構(gòu)成不同類型黃酒風(fēng)味差異的物質(zhì)基礎(chǔ)還不清晰。

“無酸不成味”，有機(jī)酸是黃酒中含有的一類重要呈味物質(zhì)，其種類和含量對(duì)黃酒的風(fēng)味品質(zhì)具有決定性的影響[3]。黃酒中有機(jī)酸含量過低容易造成黃酒酒味寡淡、單調(diào)、短口，而含量過高則顯得味酸、刺舌、粗糙[4-5]，同時(shí)黃酒中的有機(jī)酸在平衡黃酒口味和香氣[6]方面也具有重要作用。黃酒中的有機(jī)酸主要有乳酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸等，不同有機(jī)酸感官特征不同，其含量比例的差異對(duì)黃酒風(fēng)味品質(zhì)也會(huì)造成較大的影響[7]。但目前關(guān)于傳統(tǒng)型和清爽型黃酒中有機(jī)酸含量特征的研究還缺乏相關(guān)報(bào)道。

黃酒中有機(jī)酸的分析方法主要有紅外光譜法[8]、分光光度法[9]、CE[10]、GC/GC-MS[11-12]、RP-HPLC[13]、離子排斥色譜技術(shù)[14]等。其中，RP-HPLC法因靈敏度較高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便而被廣泛使用。但是基于HPLC法進(jìn)行有機(jī)酸分析遇到的最常見的問題就是樣品中其他雜質(zhì)的干擾[15]。黃酒作為一種發(fā)酵酒，其化學(xué)成分十分復(fù)雜，除水、乙醇外，還含有大量的氨基酸/多肽[16-17]、色素[18]及糖類等組分，均可能對(duì)有機(jī)酸的色譜分離產(chǎn)生影響。任一平等人首先嘗試采用C18小柱對(duì)黃酒樣品進(jìn)行凈化處理實(shí)現(xiàn)了乳酸、乙酸和琥珀酸的準(zhǔn)確定量[19]；畢麗君等人采用C18小柱對(duì)色酒進(jìn)行色素去除處理，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了7種有機(jī)酸的準(zhǔn)確定量[20]。但目前對(duì)影響黃酒有機(jī)酸色譜分離的主要干擾因素還缺乏系統(tǒng)研究，這也限制了黃酒凈化處理方法的開發(fā)。

本文首先分析了黃酒檢測(cè)中影響有機(jī)酸色譜分離分析的主要干擾因素，進(jìn)而通過不同類型固相萃取柱凈化效果的比較選擇最佳的凈化處理方法，最后建立了一種基于固相萃取一步凈化與UPLC技術(shù)相結(jié)合的快速檢測(cè)黃酒中有機(jī)酸含量的方法。進(jìn)一步采用該方法比較分析了傳統(tǒng)型黃酒和清爽型黃酒有機(jī)酸含量特征及差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)sigma公司)；氨基酸混合物[參照黃酒中主要氨基酸的大致比例天冬氨酸∶谷氨酸∶絲氨酸∶甘氨酸∶精氨酸∶丙氨酸∶纈氨酸∶苯丙氨酸∶異亮氨酸∶亮氨酸∶脯氨酸=2.5∶6∶1∶1∶2∶2∶2∶1∶1∶1.5∶2，(美國(guó)sigma公司)]；多肽混合物[TRYPTONE，(英國(guó)OXOID公司)]；焦糖色素(古越龍山有限公司提供)；NaH2PO4(美國(guó)sigma公司)；甲醇(美國(guó)sigma公司)；葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。SPE小柱型號(hào)及規(guī)格：PRS(丙磺酸；500 mg，3 mL)、SCX(強(qiáng)陽(yáng)離子；500 mg，3 mL)、MCX(混合型陽(yáng)離子；500 mg，3 mL)、WCX(弱陽(yáng)離子；500 mg，3 mL)、C8-SCX(500 mg，3 mL)、Si(硅膠；500 mg，3 mL)、HC-C18(500 mg，3 mL)、Coconut(椰子殼活性炭；500 mg，3 mL)、Celite545(硅藻土；4 g，10 mL)、Alumina-B(堿性氧化鋁；500 mg，3 mL)(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。不同品牌傳統(tǒng)型與清爽型黃酒樣品信息，見表1。

表1 傳統(tǒng)型與清爽型黃酒樣品信息

1.2 主要儀器與設(shè)備

Acquity型超高效液相色譜儀及2966型光電二級(jí)管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；Milli-Q超純水系列(美國(guó)密理博公司)；Visipreep DL型固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)。

1.3 色譜條件

參照文獻(xiàn)[21]通過優(yōu)化確定色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(i.d 2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：20 mmol/L NaH2PO4溶液(pH 2.7)；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，柱溫：30 ℃，流速：0.25 mL/min，進(jìn)樣1 μL。

以此色譜條件將有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中各組分的色譜峰[22]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 黃酒中有機(jī)酸檢測(cè)干擾因素分析

本研究通過分析不同類型雜質(zhì)添加對(duì)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液回收率影響確定黃酒中干擾有機(jī)酸分離檢測(cè)的主要雜質(zhì)類型，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案如下：

方案1：直接分析不經(jīng)處理黃酒中有機(jī)酸的加標(biāo)回收率情況。向成品黃酒(13#半干型黃酒，以下涉及成品黃酒有機(jī)酸回收率所用黃酒樣品均為13#)中添加有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(各有機(jī)酸添加濃度，g/L：草酸0.198、酒石酸0.123、蘋果酸0.069、乳酸0.207、乙酸1.236、檸檬酸0.6、琥珀酸1.068)測(cè)定回收率。成品黃酒中有機(jī)酸本底含量是以優(yōu)化后方法的測(cè)定值。

方案2：考察氨基酸/多肽混合物對(duì)有機(jī)酸測(cè)定的影響。向有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(以流動(dòng)相為溶劑，以13#酒樣有機(jī)酸含量為參照，各有機(jī)酸添加濃度，g/L：草酸0.408、酒石酸0.171、蘋果酸0.405、乳酸3.370、乙酸1.016、檸檬酸0.444、琥珀酸0.949，下同)添加氨基酸/多肽類雜質(zhì)(加入量參照黃酒中的大致比例，氨基酸與多肽質(zhì)量比約為1∶3)總量為6.0 g/L[23-24]，測(cè)定回收率。

方案3：考察焦糖色素對(duì)有機(jī)酸測(cè)定的影響。向有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加焦糖色素(黃酒中的主要色素)測(cè)定回收率，焦糖色素添加濃度1.0 g/L[18]。

方案4：考察糖分對(duì)黃酒有機(jī)酸測(cè)定影響。向有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加葡萄糖測(cè)定回收率，葡萄糖添加濃度100.017 g/L(模擬甜型黃酒總糖(以葡萄糖計(jì))>100 g/L)。

以上設(shè)計(jì)方案樣品檢測(cè)前均經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.4.2 樣品預(yù)處理

待測(cè)黃酒樣品進(jìn)樣前需經(jīng)過以下步驟：首先采用移液管準(zhǔn)確量取黃酒樣品5 mL，流動(dòng)相10 mL充分混勻，其次經(jīng)SPE小柱進(jìn)行凈化處理，凈化處理流程如下：依次用1倍柱體積的純甲醇和水活化小柱，將待凈化的稀釋后黃酒樣品通過SPE小柱進(jìn)行凈化處理，舍去前面1倍柱體積凈化液，剩余凈化液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精確稱取草酸(0.409 g)、酒石酸(0.171 g)、蘋果酸(0.405 g)、乳酸(3.746 g)、乙酸(1.106 g)、檸檬酸(0.444 g)和琥珀酸(0.949 g)，以流動(dòng)相為溶劑溶解定容至100 mL配制成有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液母液，使用時(shí)，采用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，標(biāo)準(zhǔn)品母液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.4 樣品測(cè)定

根據(jù)建立的黃酒有機(jī)酸準(zhǔn)確定量方法對(duì)傳統(tǒng)型和清爽型黃酒樣品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酒中有機(jī)酸檢測(cè)干擾因素分析

本研究分析比較了黃酒中含量較高的組分(氨基酸/多肽、色素、糖分)對(duì)有機(jī)酸分離檢測(cè)的影響，黃酒本底有機(jī)酸含量的測(cè)定采用了SCX-SPE小柱凈化處理。首先對(duì)未經(jīng)凈化處理的黃酒樣品直接進(jìn)行UPLC色譜分析及回收率的測(cè)定，結(jié)果顯示各有機(jī)酸分離度較差，且大部分有機(jī)酸回收率不滿足要求(見圖1，表2)，由此可知黃酒中存在的雜質(zhì)嚴(yán)重干擾了有機(jī)酸的準(zhǔn)確定量。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中添加干擾雜質(zhì)進(jìn)行回收率分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸/多肽類雜質(zhì)對(duì)有機(jī)酸檢測(cè)影響最大，其中蘋果酸和草酸的回收率分別達(dá)到了164.54%和159.75%；其次為色素類雜質(zhì)，酒石酸和蘋果酸的回收率分別達(dá)到了146.34%和143.68%；而糖類雜質(zhì)添加后，各有機(jī)酸的回收率均在95%～110%，未對(duì)有機(jī)酸準(zhǔn)確定量造成影響(表2)。由此可知黃酒中存在的氨基酸/多肽類以及色素類雜質(zhì)對(duì)有機(jī)酸準(zhǔn)確定量的具有較大的影響。

1-草酸；2-酒石酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-乙酸；6-檸檬酸；7-琥珀酸圖1 未經(jīng)SPE小柱凈化處理黃酒樣品有機(jī)酸超高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of organic acids in Chinese rice wine without SPE purify

方案草酸酒石酸蘋果酸乳酸乙酸檸檬酸琥珀酸方案1(黃酒樣品)27.38224.5563.1187.2857.79235.12202.92方案2(氨基酸/多肽)159.75120.13164.54117.50101.36136.56137.43方案3(色素)107.32146.34143.68106.30135.04110.14110.38方案4(糖分)105.35102.39109.1297.5995.0197.9396.62

2.2 基于SPE小柱凈化方法優(yōu)化

為了降低樣品中雜質(zhì)對(duì)有機(jī)酸檢測(cè)的干擾，SPE技術(shù)經(jīng)常用于樣品的凈化處理[25-27]。傳統(tǒng)處理方法一般要經(jīng)過活化、上樣、淋洗、洗脫等繁瑣步驟。為了簡(jiǎn)化樣品凈化處理的流程，本研究提出直接通過SPE過濾吸附除雜對(duì)黃酒樣品進(jìn)行凈化處理的方案。考慮到有機(jī)酸在黃酒中主要以分子或陰離子狀態(tài)存在，因此在SPE小柱的選擇時(shí)，采用陰離子以外的SPE柱對(duì)凈化效果進(jìn)行比較。本研究?jī)?yōu)化比較的SPE小柱型號(hào)見1.1，樣品處理流程參照1.4。

2.2.1 不同SPE小柱氨基酸/多肽及色素類雜質(zhì)去除能力比較

針對(duì)氨基酸/多肽和色素兩類雜質(zhì)對(duì)有機(jī)酸出峰有較大影響的問題 ，選取不同型號(hào)的SPE小柱對(duì),2種雜質(zhì)的去除能力進(jìn)行比較。

表3 SPE小柱凈化黃酒樣品雜質(zhì)去除能力

注：空白為未經(jīng)固相萃取小柱處理。

[28, 29]中的方法分別對(duì)黃酒樣品中水解氨基酸濃度和610 nm波長(zhǎng)下的光密度值進(jìn)行測(cè)定，以比較不同SPE小柱的氨基酸/多肽和色素去除能力。從表3中可以看出，不同型號(hào)SPE小柱均在一定程度上具有氨基酸/多肽及色素吸附的能力，但吸附效果差異較大。其中SCX和MCX對(duì)氨基酸/多肽及色素具有較強(qiáng)的吸附能力，氨基酸/多肽去除率分別為95.28%和82.84%，色素去除率分別為47.57%和51.46%。而其他小柱的氨基酸/多肽和色素去除能力均較低。

2.2.2 黃酒樣品凈化處理后有機(jī)酸回收率測(cè)定

為了進(jìn)一步考察氨基酸/多肽和色素對(duì)黃酒樣品有機(jī)酸測(cè)定的影響及不同SPE小柱的凈化效果，通過不同SPE小柱凈化處理加標(biāo)和未加標(biāo)黃酒樣品(13#)，對(duì)有機(jī)酸回收率測(cè)定結(jié)果見表4。從表4可以看出，SCX-SPE小柱凈化效果最好，各有機(jī)酸回收率均在91%～114%。而經(jīng)MCX-SPE小柱凈化處理，各有機(jī)酸回收率也有了明顯提升，但較SCX效果略差。而經(jīng)其他SPE小柱凈化處理后，有機(jī)酸回收率的測(cè)定結(jié)果不理想，無法實(shí)現(xiàn)有機(jī)酸的準(zhǔn)確定量。比較表2，表3結(jié)果可知，對(duì)氨基酸/多肽和色素去除效果較好的SPE小柱一般能夠獲得較好的有機(jī)酸測(cè)定回收率，這也進(jìn)一步表明氨基酸/多肽和色素可能是影響黃酒有機(jī)酸測(cè)定的主要干擾因素。

表4 SPE小柱凈化處理黃酒樣品7種有機(jī)酸回收率(%)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、最低檢測(cè)限和線性范圍

對(duì)7種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品母液采用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，依照1.3所示色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示7種有機(jī)酸均有較好的分離度，峰形對(duì)稱性好，基線噪音小，標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和線性范圍見表5。各有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)均在0.999 3～1.000 0，說明在此液相條件下各有機(jī)酸組分的峰面積和質(zhì)量濃度線性相關(guān)性很好，可以滿足有機(jī)酸準(zhǔn)確定量的要求。

2.3.2 回收率及精密度

取流動(dòng)相稀釋處理的加標(biāo)和未加標(biāo)黃酒樣品(13#)各5份，SPE小柱型號(hào)為SCX(500 mg，3 mL)，凈化處理流程參照1.4，色譜條件參照1.3。UPLC色譜圖見圖2，各有機(jī)酸的回收率及精密度測(cè)定結(jié)果(n=5)見表6。從圖2可以看出，經(jīng)SCX-SPE小柱處理后，7種目標(biāo)有機(jī)酸的峰形均有了較大改善，基本可以實(shí)現(xiàn)基線分離。各有機(jī)酸的回收率均在94.96%～105.08%之間，RSD為0.43%～1.79%，符合有機(jī)酸準(zhǔn)確定量的要求。

表5 7種有機(jī)酸的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

注：y，峰面積；X，濃度，g/L。

1-草酸；2-酒石酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-乙酸；6-檸檬酸；7-琥珀酸圖2 經(jīng)SCX-SPE小柱凈化處理的黃酒有機(jī)酸超高效液相色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of organic acids in Chinese rice wine with SCX-SPE purifying

有機(jī)酸酒樣濃度/(g·L-1)加標(biāo)濃度/(g·L-1)加標(biāo)檢測(cè)濃度/(g·L-1)回收率/%RSD/%草酸0.1110.1980.32196.260.43酒石酸0.0630.1230.177105.081.31蘋果酸0.1890.2070.41794.961.79乳酸3.3063.846.987102.280.80乙酸1.1611.2362.337102.571.03檸檬酸0.6330.61.185104.051.17琥珀酸0.9511.0682.04698.680.87

2.4 不同類型黃酒中有機(jī)酸含量分析

采用本研究建立的方法對(duì)不同來源的傳統(tǒng)型黃酒樣品(1#～12#)和清爽型黃酒樣品(13#～18#)中有機(jī)酸含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表7。

從表7可以看出，黃酒中含量最高的有機(jī)酸為乳酸(2.290～5.959 g/L)，其次為琥珀酸(1.776～3.228 g/L)及乙酸(0.511～1.306 g/L)。雖然傳統(tǒng)型黃酒中有機(jī)酸總含量顯著高于清爽型黃酒(P<0.05)，但兩種類型黃酒中乙酸、琥珀酸、檸檬酸和草酸的含量接近，并沒有顯著差異。兩種類型黃酒中有機(jī)酸含量的差異主要集中于乳酸、蘋果酸和酒石酸。傳統(tǒng)型黃酒中酒石酸、蘋果酸和乳酸的含量顯著高于清爽型黃酒(P<0.05)，分別是后者的2.78、1.71和1.60倍。這3種有機(jī)酸可能是造成兩種類型黃酒口感差異的重要因素之一，因此可作為區(qū)分傳統(tǒng)型黃酒和清爽型黃酒的特征性組分。乳酸作為黃酒中最主要的有機(jī)酸，其口感柔和，能夠增加酒體醇厚感。乳酸在黃酒釀造過程中主要由搭窩過程中霉菌和浸米發(fā)酵過程中乳酸菌代謝生成[30]，傳統(tǒng)型黃酒較長(zhǎng)浸米時(shí)間和發(fā)酵時(shí)間可能是造成其高乳酸含量的主要原因。蘋果酸酸味清新爽快，呈味持久緩慢且呈味閾值較低(0.087 g/L)，其主要由三羧酸循環(huán)途徑代謝生成，微生物種類及代謝特征的差異均能影響蘋果酸的生成[31]。酒石酸作為兩種類型黃酒中含量差異最大的有機(jī)酸，其在黃酒中的形成途徑還未見相關(guān)報(bào)道，值得進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)考察了黃酒中主要雜質(zhì)組分對(duì)有機(jī)酸測(cè)定的影響，明確了氨基酸/多肽和色素這兩類組分是影響有機(jī)酸的準(zhǔn)確定量的主要因素。

本研究提出了基于SPE一步凈化除雜的策略，建立了一種基于固相萃取一步凈化與UPLC技術(shù)相結(jié)合的快速檢測(cè)黃酒中主要有機(jī)酸的方法。采用SCX-SPE小柱可以有效去除對(duì)有機(jī)酸測(cè)定影響較大的氨基酸/多肽和色素類雜質(zhì)，結(jié)合UPLC能夠在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)黃酒中有機(jī)酸的分離檢測(cè)。該方法具有快速、便捷、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，適合于黃酒樣品有機(jī)酸的準(zhǔn)確測(cè)定。

采用本研究建立的方法對(duì)不同來源傳統(tǒng)型黃酒和清爽型黃酒樣品中有機(jī)酸含量特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)型黃酒中有機(jī)酸總含量顯著高于清爽型黃酒。這種差異主要由酒石酸、蘋果酸和乳酸的含量差異造成。2種類型黃酒中琥珀酸、乙酸、檸檬酸和草酸含量并沒有顯著差異。

表7 傳統(tǒng)型與清爽型黃酒樣品有機(jī)酸含量

注：* 每個(gè)樣品測(cè)定3個(gè)平行，平行間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%。

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Determination of organic acids in Chinese rice wine by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography

WANG Lin,CHEN Shuang,XU Yan*

(State Key Laboratory of Food Science & Technology, Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education; Centre for Brewing Science and Enzyme Biotechnology, School of Biotechnology Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The influence of major components in Chinese rice wine on the chromatographic analysis of organic acids was investigated. Amino acids, polypeptides and pigments were the major impurities which observably interfere with chromatographic separation of organic acids in Chinese rice wine. A method for the simultaneous determination of 7 organic acids in Chinese rice wine was developed by solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography (SPE-UPLC). The sample was purified by the SCX-SPE cartridge after pretreatment, and then separated by ACQUITY UPLC HSS T3 column. 20 mmol/L NaH2PO4(pH 2.7) was used as the mobile phase at a flow rate of 0.25 mL/min. The detection was performed by a diode array detector at 210 nm. The results showed that 7 organic acids were completely separated and determined in 5 min. the linear correlation coefficients were above 0.999 3 in the range of 0.100-37 456.000 mg/L. Under these conditions, the recoveries of 7 organic acids in rice wine were in the range of 94.96%-105.08% with the relative standard deviations (RSDs,n=5) of 0.43%-1.79%. Compared with traditional organic acid SPE’s adsorption and elution operation, this method is feasible, accurate and applicable for the quantitative analysis of organic acids in Chinese rice wine. With this method, we analyzed the differences of the organic acids concentrations between Traditional and Qingshuang Chinese rice wine. The results showed that the total acids in Traditional Chinese rice wine was significantly higher (P<0.05) than those in Qingshuang Chinese rice wine, while the difference was mainly caused by the remarkable difference (P<0.05) in the concentrations of tartaric acid, malic acid and lactic acid.

ultra performance liquid chromatography(UPLC); solid phase extraction(SPE); organic acid; Traditional Chinese rice wine; Qingshuang Chinese rice wine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610024

碩士研究生(徐巖教授為通訊作者,E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31530055、21506074)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2013AA102108)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20140153)

2016-02-24，改回日期：2016-03-30