鄭利強，伍亞民，石永江，江瓊

·基礎(chǔ)研究·

黃芪多糖對大鼠脊髓損傷后運動功能和脊髓病理的效果①

鄭利強1，伍亞民2，石永江3，江瓊1

目的 觀察黃芪多糖對脊髓損傷后運動功能和脊髓病理變化的影響。方法 70只成年Sprague-Daw ley大鼠分為正常組(n=10)、損傷組(n=30)和治療組(n=30)，損傷組和治療組內(nèi)再分為7 d、14 d、28 d三個亞組。損傷組和治療組均采用A llen法(10 g×25mm)損傷大鼠T10脊髓。造模成功后，治療組術(shù)后每天腹腔注射黃芪多糖注射液10mg/kg。術(shù)后7 d、14 d、28 d，各亞組分別行BBB評分，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，Nissl染色觀察尼氏小體，鉻花青染色觀察脫髓鞘情況。結(jié)果 術(shù)后各時間點，治療組BBB評分高于損傷組(P＜0.05)。損傷組術(shù)后7 d、14 d損傷部位以壞死組織為主，空洞開始形成；28 d時空洞基本形成，空洞周圍有致密瘢痕。治療組各時間點損傷部位壞死較輕，14 d、28 d時空洞面積縮小。損傷組術(shù)后7 d出現(xiàn)脫髓鞘，并逐漸加重；術(shù)后28 d，損傷中心出現(xiàn)空洞。治療組各時間點脫髓鞘及髓鞘排列疏松情況有所改善。損傷組術(shù)后7 d尼氏小體開始融合，14 d時融合加重，28 d時幾乎完全融合或溶解。治療組各時間點尼氏小體融合程度較輕。結(jié)論 黃芪多糖能減輕脊髓損傷后病理損害，促進運動功能改善。

脊髓損傷；黃芪多糖；運動功能；病理；大鼠

[本文著錄格式] 鄭利強，伍亞民，石永江，等.黃芪多糖對大鼠脊髓損傷后運動功能和脊髓病理的效果[J].中國康復(fù)理論與實踐,2016,22(11):1269-1275.

CITED AS:Zheng LQ,Wu YM,ShiYJ,etal.Effectof astragalus polysaccharide onmotor function and pathology after spinal cord injury in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1269-1275.

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種嚴(yán)重致殘性疾病，導(dǎo)致?lián)p傷平面以下感覺運動功能障礙。隨著現(xiàn)代社會的快速發(fā)展，尤其是建筑業(yè)和交通業(yè)的發(fā)展，脊髓損傷患者數(shù)逐年呈上升趨勢。

黃芪是臨床上治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用中藥之一，已經(jīng)被證實有很好臨床效果。黃芪多糖(astragalus polysaccharide)是黃芪的有效提取物之一，具有保護內(nèi)皮細(xì)胞、抗氧化、緩解脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、延緩細(xì)胞凋亡、提高機體免疫力等作用。研究顯示，黃芪注射液可有效促進神經(jīng)元樣細(xì)胞細(xì)長突起在腦缺血組織中形成，加強網(wǎng)狀細(xì)胞間連接，并促進其向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[1]，對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化有明顯促進作用。神經(jīng)干細(xì)胞可通過增殖、分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子及細(xì)胞外基質(zhì)，促進損傷軸突再生[2-3]，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。本研究觀察黃芪多糖對脊髓損傷后運動功能及其病理變化，為深入研究黃芪多糖對脊髓損傷治療的臨床效果提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年Sprague-Daw ley大鼠70只，雌性，體質(zhì)量(200±20)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物房提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(渝)2012-0005。分為正常組(n=10)、損傷組(n=30)和治療組(n=30)，損傷組和治療組內(nèi)再分為7 d、14 d、28 d三個亞組。

1.2 主要試劑和儀器

黃芪多糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%)：SIGMA公司。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色、尼氏(Nissl)染液試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司。DCR-TRV318紅外攝像機：SONY公司。

1.3 模型制備

大鼠稱重，1%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，背部脫毛，俯臥位固定，常規(guī)消毒。以T10棘突為中心，無菌切開約2 cm，分離皮下筋膜，去除椎骨上肌肉，切開椎板，暴露T10脊髓。采用A llen打擊裝置，強度10 g×25mm，見大鼠雙后肢回縮撲動，鼠尾痙攣性擺動，證明造模成功。逐層縫合皮膚。

術(shù)后予青霉素肌肉注射預(yù)防感染，每次1萬U，每天2次，共3 d。動物置于干燥、新?lián)Q墊料上，自由飲水、進食，保持適宜溫度和濕度。每天擠壓膀胱排尿3次，直至恢復(fù)自主排尿。

1.4 治療方法

損傷組大鼠造模成功后不給予任何治療，治療組造模成功后30m in，予1mg/m l黃芪多糖10m l/kg腹腔注射，以后每天1次，直至預(yù)定時點。

1.5 評定方法

1.5.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分

分別于術(shù)后7 d、14 d、28 d行BBB評分。由熟悉評分標(biāo)準(zhǔn)的2名實驗人員，觀察動物在曠場內(nèi)活動，評估其后肢功能，觀察時間不少于5min。評定人員對分組情況不知情。

1.5.2 HE染色

評分結(jié)束后灌注取材，梯度脫水，OCT包埋，縱行連續(xù)冰凍切片，置于-20℃冰箱待用。

冰凍切片復(fù)溫30m in，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5m in，100%乙醇1m in，95%乙醇1min，80%乙醇1m in，75%乙醇1m in，水洗2m in，蘇木素染色4～5m in，分化30 s，水洗15m in，伊紅染色2min，水洗，95%乙醇Ⅰ2m in，95%乙醇Ⅱ2m in，100%乙醇Ⅰ1m in，100%乙醇Ⅱ1m in，二甲苯Ⅰ透明2min，二甲苯Ⅱ透明2m in，中性樹脂封片，鏡下觀察。

1.5.3 鉻花青染色

冰凍切片60℃烤箱復(fù)溫1 h，二甲苯Ⅰ透明5 m in，二甲苯Ⅱ透明5m in，無水乙醇2min，95%乙醇2m in，70%乙醇2m in，50%乙醇2m in，鉻花青染色10 m in，清水2 m in，氨水分化30 s，水洗2 min，50%乙醇2m in，70%乙醇2m in，95%乙醇2m in，無水乙醇2m in，二甲苯Ⅰ透明2m in，二甲苯Ⅱ透明2 m in，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.5.4 尼氏染色

上述冰凍切片70%乙醇過夜，水洗5min，焦油紫染色10m in，水洗，無水乙醇1m in，二甲苯透明5 m in，中性樹脂封片，鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分

術(shù)后7 d，損傷組與治療組大鼠BBB評分均1～3分；隨后BBB評分升高。治療組各時間點BBB評分

高于損傷組(P＜0.05)。見圖1。

圖1 各組BBB評分比較

2.2 HE染色

正常組脊髓細(xì)胞分布均勻，排列整齊，未見空洞及壞死組織。損傷組7 d時，脊髓損傷中心出現(xiàn)壞死組織，并有較小空洞形成；14 d時，損傷部位主要以壞死組織為主，較7 d時組織壞死明顯加重，空洞變大；28 d時，組織壞死減少，空洞基本形成。治療組脊髓病理變化趨勢與損傷組相同，但各時間點組織壞死程度較輕，14 d、28 d空洞面積明顯縮小。見圖2。

2.3 鉻花青染色

正常組髓鞘主要在脊髓白質(zhì)中表達，分布均勻，排列緊密，未發(fā)現(xiàn)在灰質(zhì)中表達。損傷組7 d時，損傷部位白質(zhì)出現(xiàn)小面積脫髓鞘，且損傷周圍髓鞘排列疏松，呈網(wǎng)狀；14 d時脫髓鞘面積增大，損傷中心白質(zhì)中幾乎未見髓鞘，損傷周圍白質(zhì)中髓鞘排列疏松；28 d時脫髓鞘繼續(xù)加重，有明顯空洞形成。治療組脫髓鞘變化趨勢與損傷組相同，但各時間點脫髓鞘病變較輕，髓鞘排列較為緊湊。見圖3。

2.4 尼氏染色

正常組尼氏小體在神經(jīng)元中結(jié)構(gòu)完整，單個存在。損傷組7 d，尼氏小體開始融合，14 d時融合加重，28 d時幾乎完全融合或溶解。治療組各時間點尼氏小體融合程度較輕。見圖4。

3 討論

脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)一直是醫(yī)學(xué)面臨的重大挑戰(zhàn)。近年來，在不斷加強對脊髓損傷功能修復(fù)實驗研究的同時，國內(nèi)學(xué)者開始注意采用傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)方法，探討中醫(yī)藥對脊髓損傷的救治策略與措施。有研究表明，補陽還五湯可以營養(yǎng)神經(jīng)元，促進神經(jīng)修復(fù)[4]，對脊髓損傷后運動功能恢復(fù)有明顯促進作用[5]。黃芪是該方的主藥，我們推測黃芪在促進脊髓損傷后運動功能恢復(fù)中發(fā)揮主要作用。黃芪多糖是黃芪提取物，在保護內(nèi)皮細(xì)胞、抗血小板聚集、緩解脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、延緩細(xì)胞的凋亡及提高機體免疫力等方面的作用已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可[6-8]。

改善和促進運動功能恢復(fù)是脊髓損傷后康復(fù)的首要目標(biāo)[9]。BBB評分是評價脊髓損傷后后肢運動功能恢復(fù)的行為學(xué)評分方法。本研究顯示，術(shù)后7 d，損傷組與治療組后肢運動功能恢復(fù)較慢，隨后運動功能恢復(fù)較快；黃芪多糖治療后大鼠各時間點BBB評分高于損傷組。

形態(tài)學(xué)觀察顯示，脊髓損傷后1周，損傷中心主要以壞死組織為主，但該階段已經(jīng)開始形成空洞，在損傷后4周空洞基本形成，且周圍有膠質(zhì)瘢痕形成，與既往觀察結(jié)果[10]相同。黃芪多糖治療后，組織壞死程度減輕，空洞有效面積縮小，損傷周圍膠質(zhì)瘢痕出現(xiàn)較晚，與BBB評分結(jié)果基本吻合。

脊髓損傷后功能恢復(fù)的基礎(chǔ)是軸突通過再生，與靶細(xì)胞形成功能性突觸。在特定情況下，軸突通過發(fā)芽、生長、延伸等方式與靶細(xì)胞重建聯(lián)系，實現(xiàn)神經(jīng)再支配、功能再恢復(fù)的過程。髓鞘是包裹在神經(jīng)軸突外的一層膜，主要參與神經(jīng)傳導(dǎo)。髓鞘缺失可導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，引起傳導(dǎo)阻滯[11]。脫髓鞘病變也是脊髓損傷后重要的病理變化[12]。本研究顯示，脊髓損傷大鼠出現(xiàn)脫髓鞘，且髓鞘排列疏松；隨病程延長，損傷程度加重。黃芪多糖治療可改善脫髓鞘狀態(tài)，髓鞘排列較為緊湊。有研究表明，黃芪水溶液可防止小鼠大腦皮質(zhì)和海馬部位神經(jīng)軸突和突觸損傷[13]；黃芪提取物作為一個潛在的神經(jīng)生長促進因子，可以刺激周圍神經(jīng)纖維跨越間隙再生，有助于周圍神經(jīng)軸突的再生[14]。與本研究結(jié)果相似。

圖2 各組脊髓組織HE染色

圖3 各組脊髓組織鉻花青染色

圖4 各組脊髓組織尼氏染色(1000×)

脊髓損傷后，受損部位神經(jīng)元壞死，傳導(dǎo)神經(jīng)斷裂，導(dǎo)致脊髓結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常。研究表明，定向誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化有助于脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)[15]，認(rèn)為脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)主要取決于神經(jīng)元。尼氏小體與神經(jīng)元的功能關(guān)系密切，其數(shù)量反映神經(jīng)元內(nèi)蛋白的合成功能[16]；當(dāng)神經(jīng)元發(fā)生變性壞死時，尼氏小體體積縮小甚至消失。本研究顯示，脊髓損傷后，尼氏小體融合，并逐漸加重，28 d時幾乎完全融合或溶解；黃芪多糖治療可減輕大鼠尼氏小體融合程度。既往研究表明，黃芪多糖對誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有促進增殖作用[17-18]，也可以促進神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化[19-20]；而干細(xì)胞可以增殖分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，促進宿主功能部分恢復(fù)[15,21]。

總之，黃芪多糖對脊髓損傷的恢復(fù)可能有促進作用。但其作用機制尚不清楚，有待進一步研究。

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Effect of Astragalus Polysaccharide on M otor Function and Pathology after SpinalCord Injury in Rats

ZHENG Li-qiang1,WU Ya-min2,SHIYong-jiang3,JIANGQiong1
1.Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.Third Department of Research Institute of Surgery,Daping Hospital,Third Military MedicalUniversity,Chongqing 400042,China;3.Logistical Engineering University of PLAHospital,Chongqing 401331,China

Objective To observe the effectof astragalus polysaccharide onmotor function and pathology after spinal cord injury in rats. Methods Seventy adult Sprague-Daw ley ratswere selected as normal group(n=10),injury group(n=30)and treatment group(n=30),and the injury group and the treatment group were divided into 7 days,14 days,28 days subgroups.The injury group and the treatment group weremodeled with A llen'smode atT10(10 g×25mm).The treatmentgroup was injected with astragalus polysaccharide 10mg/kg per day after injury.They were rated with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scores 7 days,14 daysand 28 daysafter injury,while themorphology was observed with HE staining,Nylon body was observed with Nissl staining,andmyelin sheath was observed with eriochrome cyanine staining.Results The BBB scorewas significantly higher in the treatmentgroup than in the injury group ateach time point(P＜0.05).Therewas a largenumberof necrotic tissue in the injured cordsand cystic cavity began to form 7 and 14 daysafter injury.Cystic cavity formed basically and surrounded with dense scar 28 days after injury.The necrosis and cystic cavity alleviated in the treatment group ateach time point. Demyelination and myelin sheaths loosewere found 7 days after injury,and aggravated with the time.Therewas a cystic cavity in trauma center 28 days after injury.The demyelination andmyelin sheaths loose relieved ateach time point in the treatmentgroup.Nissl bodies began to coalesce 7 days after injury,and aggravated 14 days after injury,coalesced completely 28 daysafter injury.Nisslbody coalesced alleviatively in the treatmentgroup ateach time point.Conclusion Astragaluspolysaccharidemay reduce the damage and promote the recovery ofmotor function after spinal cord injury in rats.

spinal cord injury;astragalus polysaccharide;motor function;pathology;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.006

R651.2

A

1006-9771(2016)11-1269-07

2016-07-13

2016-08-19)

國家自然科學(xué)基金項目(No.30772299)。

1.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶市400016；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所三室，創(chuàng)傷燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室，重慶市400042；3.解放軍后勤工程學(xué)院門診部，重慶市401331。作者簡介：鄭利強(1987-)，男，漢族，河南焦作市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)。通訊作者：江瓊(1964-)，女，漢族，重慶市人，碩士，副教授，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)。E-mail:jq.ok@163.com。