高睿琦，唐成林，曹凈，郭全虎，張毅，田源，袁海洲

電針對失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠胰島素樣生長因子1、肌肉生長抑制素及肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響①

高睿琦，唐成林，曹凈，郭全虎，張毅，田源，袁海洲

目的 探討電針延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的可能機(jī)制。方法 49只雄性Sprague-Daw ley大鼠隨機(jī)分為正常組(A組,n= 7)、自然恢復(fù)組(B組,n=21)和電針治療組(C組,n=21)。A組不做處理，其余兩組切斷坐骨神經(jīng)制備失神經(jīng)性骨骼肌萎縮模型。術(shù)后1 d，C組術(shù)側(cè)腓腸肌給予電針足三里、承山治療每天1次。術(shù)后7 d、14 d、21 d分別測定術(shù)側(cè)腓腸肌濕重比，HE染色測定肌纖維直徑及截面積，Western blotting檢測胰島素樣生長因子1(IGF-1)、肌肉生長抑制素(Myostatin)以及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白，RT-PCR檢測IGF-1、Myostatin和PCNA基因表達(dá)。結(jié)果 與A組比較，B組和C組腓腸肌濕重比、肌纖維截面積及直徑均顯著下降(P＜0.001)，但C組顯著高于B組(P＜0.001)。C組IGF-1、PCNA蛋白和基因表達(dá)高于B組(P＜0.05)，Myostatin蛋白和基因表達(dá)低于C組(P＜0.05)。結(jié)論 電針能有效促進(jìn)IGF-1的表達(dá)，抑制M yostatin的表達(dá)，從而促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖。這可能是電針延緩失神經(jīng)性骨骼肌肌萎縮的機(jī)制之一。

失神經(jīng)；骨骼肌萎縮；電針；胰島素樣生長因子1；肌肉生長抑制素；增殖細(xì)胞核抗原；肌衛(wèi)星細(xì)胞；大鼠

[本文著錄格式] 高睿琦，唐成林，曹凈，等.電針對失神經(jīng)骨骼肌萎縮大鼠胰島素樣生長因子1、肌肉生長抑制素及肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2016,22(11):1259-1263.

CITED AS:Gao RQ,Tang CL,Cao J,etal.Effects of electroacupuncture on insulin-like grow th factor-1,myostatin and satellite-cell proliferation in ratswith denervated skeletalmuscleatrophy[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1259-1263.

失神經(jīng)性骨骼肌萎縮的發(fā)生除了神經(jīng)受損，還與靶器官相關(guān)[1]。骨骼肌去神經(jīng)支配后，失去相關(guān)神經(jīng)因子營養(yǎng)，呈廢用性萎縮，如不及時治療，將造成極其嚴(yán)重的肢體功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及勞動能力。研究失神經(jīng)性骨骼肌萎縮的發(fā)病機(jī)制及其防治，已成為醫(yī)學(xué)界的重要任務(wù)。

萎縮的骨骼肌必須依賴肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖和分化來修復(fù)和再生，肌衛(wèi)星細(xì)胞在延緩骨骼肌萎縮的過程中起著至關(guān)重要的作用[2-4]。胰島素樣生長因子1(insulin-like grow th factor-1,IGF-1)作為刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞活性和增殖、再塑肌肉的重要細(xì)胞因子，它的高表達(dá)不僅能導(dǎo)致肌肉肥大，還可抑制骨骼肌萎縮[5]。肌肉生長抑制素(Myostatin)作為骨骼肌生長的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，能抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化。坐骨神經(jīng)損傷后，在腓腸肌萎縮過程中，Myostatin表達(dá)呈顯著升高趨勢[6]。電針作為延緩失神經(jīng)肌萎縮的一種有效手段，在臨床上已得到廣泛認(rèn)可，但其作用機(jī)理尚未完全明確。本研究觀察電針對IGF-1、Myostatin以及增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白和基因表達(dá)的影響，從肌衛(wèi)星細(xì)胞激活角度探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康雄性Sprague-Daw ley大鼠49只，8周齡，體質(zhì)量(250±20)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。醫(yī)學(xué)動物合格證號SCXK渝2012-0002。飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物房，室溫(22±2)℃，相對濕度65%～75%，明暗12 h交替，飲食自由攝取。

1.2 主要試劑與儀器

IGF-1、Myostatin一抗：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。PCNA一抗：美國諾偉司生物技術(shù)公司。TRNzol總RNA提取試劑：北京天根生化科技有限公司。Rever Tre Ace-a-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：TOYOBO公司。華佗牌無菌針灸針(直徑0.30 mm，長13～25 mm)、SDZ-Ⅱ型電子針治療儀：蘇州醫(yī)療用品有限公司。柔軟型實(shí)驗(yàn)大鼠固定器：溫州原上草醫(yī)療科技有限公司。AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。UV-1750型紫外可見光度計(jì)：日本津島公司。電泳儀、CFX PCR儀：美國BIO RAD公司。低溫高速離心機(jī)：SIGMA公司。BX51正置顯微鏡：OLYMPUS公司。

1.3 模型制備及分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，依次編為1～49號。通過計(jì)算機(jī)自動生成49個兩位數(shù)隨機(jī)數(shù)字表，按從左到右、由上而下依次對應(yīng)1～49號大鼠。按隨機(jī)數(shù)字的大小重新排列序號，序號1～7為正常組(A組)，序號8～28為自然恢復(fù)組(B組)，序號29～49為電針治療組(C 組)。

其中B組和C組大鼠予10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺上。無菌條件下右后肢股后外側(cè)切口，沿臀大肌間隙鈍性分離、暴露坐骨神經(jīng)，中段切斷，造成1.0mm神經(jīng)缺損[7]。

1.4 干預(yù)方法

術(shù)后第2天，將C組大鼠固定于柔軟型實(shí)驗(yàn)大鼠固定器[8]上，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》取術(shù)側(cè)足三里、承山兩穴[9]，進(jìn)針5～7mm，連接電針儀。連續(xù)波，頻率5 Hz，強(qiáng)度1.5mA。每天1次，每次10min，連續(xù)治療至取材[10-11]。A組和B組每天定時固定。動物的處置均符合重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 標(biāo)本采集

A組于21 d后取材，B組和C組分別于造模后7 d、14 d、21 d隨機(jī)抓取7只動物取材。大鼠10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉，迅速分離腓腸肌；切取腓腸肌，PBS緩沖液沖洗；將腓腸肌分為兩份，一份迅速放入液氮罐中，-80℃超低溫冰箱儲存待測，另一份4%多聚甲醛固定，石蠟包埋待測。

1.6 檢測方法

1.6.1 腓腸肌濕重比

取材時觀察術(shù)側(cè)腓腸肌萎縮情況，包括肌肉飽滿度、彈性、色澤等。觀察后近端于股骨內(nèi)、外髁起點(diǎn)剪下，遠(yuǎn)端從跟腱止點(diǎn)處剪斷，完整取下雙側(cè)腓腸肌，電子天平稱取腓腸肌濕重，以自身健側(cè)作為對照，計(jì)算腓腸肌濕重比。

1.6.2 肌纖維截面積及直徑

腓腸肌4%多聚甲醛固定，酒精梯度脫水，浸蠟包埋、切片、貼片、脫蠟，HE染色由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織切片室完成，400倍光學(xué)顯微鏡觀察，每張切片隨機(jī)選取5個視野拍照，Image-Pro Plu 6.0圖像分析軟件計(jì)算肌纖維直徑和截面積。

1.6.3 Western blotting

取冰凍腓腸肌組織樣本約50mg，低溫勻漿后提取總蛋白；灌制SDS-PAGE凝膠電泳，取出凝膠，和相同大小的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,

PVDF)置于三層濾紙中間，放入轉(zhuǎn)移槽中，加滿轉(zhuǎn)移液，300mA轉(zhuǎn)膜約90m in；5%脫脂奶粉室溫下封閉約4 h；加入IGF-1、Myostatin、PCNA一抗(1∶1000) 4℃過夜；復(fù)溫后加相應(yīng)二抗(1∶1000)室溫下孵育1～2 h；將PVDF置于化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)1～3 m in，暗室中X光片爆光、顯影及定影，GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)分析圖像計(jì)算相對灰度值。

1.6.4 RT-PCR

冰凍腓腸肌組織樣本約50mg，加入TRNzol1m l充分勻漿，提取總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測總RNA濃度及純度；按ReverTraAce-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30m in，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72℃最終延伸7m in。取PCR產(chǎn)物15μl加入上樣孔，5V/1cm電泳(事先制備好瓊脂糖凝膠)，凝膠成像系統(tǒng)計(jì)算相對熒光強(qiáng)度值。上下游引物序列如下。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肌濕重比

A組腓腸肌肌肉飽滿紅潤、富有彈性。B組和C組術(shù)側(cè)腓腸肌均呈進(jìn)行性萎縮，彈性減弱，色澤欠佳；肌濕重比隨時間逐漸下降，均顯著低于A組(P＜0.001)；各時間點(diǎn)，C組顯著高于B組(P＜0.001)。見表1。

表1 各組各時間點(diǎn)骨骼肌濕重比

2.2 形態(tài)學(xué)

B組與C組隨著時間延長，腓腸肌纖維截面積及直徑呈逐漸下降趨勢(圖1)，均顯著低于A組(P＜0.001)；各時間點(diǎn)，B組均低于C組(P＜0.001)。見表2、表3。

表2 各組各時間點(diǎn)肌纖維截面積(μm2)

表3 各組各時間點(diǎn)肌纖維直徑(μm)

2.3 IGF-1、Myostatin和PCNA表達(dá)

腓腸肌中IGF-1、Myostatin和PCNA蛋白與mRNA表達(dá)呈現(xiàn)相同趨勢。與A組相比，B組IGF-1表達(dá)下降(P＜0.05)，而C組表達(dá)量顯著升高(P＜0.001)；B組和C組Myostatin表達(dá)各時間點(diǎn)均升高(P＜0.05)，C組低于B組(P＜0.001)；B組與C組PCNA表達(dá)各時間點(diǎn)均升高(P＜0.05)，且C組高于B組(P＜0.05)。見圖2、圖3。

圖1 各組各時間點(diǎn)腓腸肌病理改變(HE染色,bar=50μm)

注：a:與A組比較，P＜0.001；b:與B組比較，P＜0.001IGF-1

圖2 各組各時間點(diǎn)骨骼肌IGF-1、Myostatin和PCNA蛋白表達(dá)(Western boltting)

注：a:與A組比較，P＜0.001；b:與B組比較，P＜0.001PCNA

注：與A組比較，a:P＜0.001;c:P＜0.05；b: 與B組比較，P＜0.001IGF-1

圖3 各組各時間點(diǎn)骨骼肌IGF-1、Myostatin和PCNAmRNA表達(dá)(RT-PCR)

注：與A組比較，a:P＜0.001;c:P＜0.05；與B組比較，b:P＜0.001;d:P＜0.05PCNA

3 討論

失神經(jīng)骨骼肌萎縮在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中屬于“痿癥”范疇?！爸勿舄?dú)取陽明”，足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，具有強(qiáng)筋骨、舒筋活血的功能，是治療下肢痿癥的要穴；承山主治下肢痿癥。兩穴配用可改善局部血液循環(huán)，維持肌肉營養(yǎng)，增強(qiáng)肌肉運(yùn)動功能，從而抑制肌肉萎縮。

針灸作為臨床治療失神經(jīng)性肌萎縮的常見手段，效果顯著。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，電針可通過提高神經(jīng)營養(yǎng)因子-3與酪氨酸激酶C的表達(dá)，維持神經(jīng)元存活，促進(jìn)受損神經(jīng)修復(fù)，改善坐骨神經(jīng)損傷大鼠的感覺功能[12]。電針拮抗大鼠坐骨神經(jīng)損傷后腓腸肌萎縮可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子mRNA表達(dá)有關(guān)[13]。絕大部分研究集中于電針對坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，而對于萎縮的骨骼肌研究相對較少[14-16]。研究表明，電針能促進(jìn)骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)腓腸肌損傷的修復(fù)[17]。電針延緩骨骼肌萎縮的治療作用也可能與骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖有關(guān)系。

骨骼肌的生長與退化受IGF-1調(diào)控。IGF-1作為肌肉生長正向調(diào)節(jié)信號，是刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞活性和增殖、再塑肌肉的重要細(xì)胞因子[18]。它促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育、參與組織修復(fù)，對促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成具有顯著作用[19]。Myostatin是骨骼肌生長發(fā)育負(fù)性調(diào)控因子，能抑制IGF-1誘導(dǎo)的肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化，對抗肌肉再生[20-21]。PCNA又稱周期蛋白(Cyclin)[22]，是真核細(xì)胞DNA合成所必須的一種核蛋白，作為細(xì)胞增殖的標(biāo)記蛋白，能反映肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖活性[23-25]。本研究中顯示，電針能有效促進(jìn)IGF-1表達(dá)，抑制Myostatin表達(dá)，從而促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，修復(fù)失神經(jīng)支配的骨骼肌，延緩骨骼肌萎縮的程度。本研究還顯示，B組和C組IGF-1和PCNA表達(dá)均在傷后14 d到達(dá)高峰，隨后有所下降，為臨床尋找電針治療有效介入時間提供一定參考。

綜上所述，電針延緩失神經(jīng)性骨骼肌萎縮的機(jī)制可能與通過調(diào)節(jié)IGF-1和Myostatin的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化有關(guān)。

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Effects of Electroacupuncture on Insulin-like Grow th Factor-1,M yostatin and Satellite-cell Proliferation in Rats with Denervated SkeletalM uscleAtrophy

GAO Rui-qi,TANGCheng-lin,CAO Jing,GUOQuan-hu,ZHANG Yi,TIANYuan,YUANHai-zhou
ChineseMedicalDepartment,Chongqing MedicalUniversity,Chongqing 400016,China

Objective To observe effects and mechanism of electroacupuncture(EA)on denervated skeletalmuscle atrophy.Methods Forty-ninemale Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into normalgroup(group A,n=7),natural recovery group(group B,n=21)and EA group(group C,n=21).The groups B and C,established themodelof denervated skeletalmuscle atrophy by transecting the sciatic nerve of rats,were divided into subgroupsof 7 days,14 days,21 days postoperation,seven in each subgroup.Electroacupuncturewasgiven to the group C at Zusanli(ST36)and Chengshan(BL57)oncea day since 24 hoursaftermodeling.Themusclewetweight ratio of theaffected gastrocnem iuswas determ ined.Cross-sectional area and fiber diameter of the gastrocnem iusweremeasured with HE staining.The expression of insulin-like grow th factor-1(IGF-1),Myostatin and proliferating cellnuclear antigen(PCNA)protein and gene in thegastrocnemiuswere detected withWestern blotting and RT-PCR.Results Thewetweight ratio,cross-sectional area and fiber diameterwere less in the groups B and C than in the group A(P＜0.001),and they weremore in the group C than in the group B(P＜0.001).Compared with the group B,the protein and gene of IGF-1,PCNA increased in the group C(P＜0.05),while the Myostatin decreased(P＜0.05).Conclusion Electroacupuncture can increase the expression of IGF-1 and decrease the expression of M yostatin,to promote the proliferation of satellite cell,whichmay relatewith the prevention of denervated skeletalmuscle atrophy.

denervation;muscle atrophy;electroacupuncture;insulin-like grow th factor-1;Myostatin;proliferating cell nuclear antigen;satellite cell;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.004

R746.4

A

1006-9771(2016)11-1259-05

2016-06-20

2016-08-29)

1.國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81273870)；2.重慶市衛(wèi)計(jì)委中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(No.ZY20150249)。

重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市400016。作者簡介：高睿琦(1990-)，女，漢族，重慶市人，碩士研究生，主要研究方向：針灸推拿機(jī)制研究。通訊作者：唐成林(1966-)，男，碩士，教授，主要研究方向：針灸推拿機(jī)制研究。E-mail:cytcl996@163.com。