張?zhí)N，林如輝，李鉆芳，陶靜，陳立典

·專題·

電針神庭、百會(huì)對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬CA1區(qū)環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白及其磷酸化水平的影響①

張?zhí)N1，林如輝2，李鉆芳2，陶靜3，陳立典4

目的 探討電針神庭、百會(huì)治療腦卒中后認(rèn)知功能障礙的機(jī)制。方法 45只Sprague-Daw ley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組15只。后兩組線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈缺血2 h再灌注模型。電針組于造模后24 h開始電針神庭和百會(huì)，共7 d。每天電針后行Morris水迷宮測(cè)試。治療后，取大鼠腦組織TTC染色測(cè)量腦梗死體積，免疫組化檢測(cè)海馬CA1區(qū)環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)及其磷酸化水平(p-CREB)的表達(dá)。結(jié)果 從第4天開始，與模型組相比，電針組大鼠逃避潛伏期及游泳路程縮短(P＜0.05)；穿越平臺(tái)次數(shù)增多(P＜0.05)。電針組大鼠腦梗死體積小于模型組(P＜0.05)；海馬CA1區(qū)CREB、p-CREB表達(dá)量較模型組增加(P＜0.05)。結(jié)論 電針神庭、百會(huì)后，腦缺血再灌注大鼠海馬CA 1區(qū)CREB、p-CREB表達(dá)量增加，從而保護(hù)神經(jīng)元，改善學(xué)習(xí)記憶功能。

腦缺血再灌注；學(xué)習(xí)記憶；電針；環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白；磷酸化；大鼠

[本文著錄格式] 張?zhí)N，林如輝，李鉆芳，等.電針神庭、百會(huì)對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬CA1區(qū)環(huán)磷酸腺苷效

應(yīng)元件結(jié)合蛋白及其磷酸化水平的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2016,22(11):1241-1245.

CITED AS:Zhang Y,Lin RH,Li ZF,etal.Effectsof electroacupuncture at Shenting and Baihuion learning andmemory,and expression of cyclic AMP response elementbinding protein and phosphorylation in ratswith cerebral ischem ia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1241-1245.

卒中后認(rèn)知功能障礙(post-stroke cognitiv impairment,PSCI)是腦卒中患者常見并發(fā)癥[1]，且缺血性腦卒中更易導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[2-3]。環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic AMP response elementbinding protein, CREB)屬于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，表達(dá)于各種組織，參與神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性和病理生理的調(diào)節(jié)過程[4-5]，在長期記憶中起主要作用[6]，磷酸化的CREB (p-CREB)對(duì)神經(jīng)元有重要的保護(hù)作用[7]，參與學(xué)習(xí)記憶過程[8-9]。本研究探討電針干預(yù)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的CREB、p-CREB機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

45只成年雄性清潔級(jí)Sprague-Daw ley大鼠，體質(zhì)量260～280 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK2012-003。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食和飲水，恒溫22℃，濕度50%～70%，光照8:00～20:00。

將大鼠編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取對(duì)應(yīng)隨機(jī)數(shù)字，將隨機(jī)數(shù)字由小到大進(jìn)行編號(hào)，1～15號(hào)為假手術(shù)組、16～30號(hào)為模型組、31～45號(hào)為電針組。

1.2 主要儀器及試劑

華佗牌SDZ-V電針儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。Morris水迷宮：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。TTC：SIGMA公司。β-actin、CREB、p-CREB抗體：ABCAM公司。

1.3 模型制備

大鼠以10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉。徹底暴露頸總動(dòng)脈，分離頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈的主干及分支，結(jié)扎頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處，血管夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處，結(jié)扎頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端，并在離結(jié)扎1～2mm處剪一小口，將線拴插入頸內(nèi)動(dòng)脈，松開血管夾；插入深度大約距頸內(nèi)、外動(dòng)脈的分叉處18～22mm，有阻塞感時(shí)停止，固定線栓。2 h后將線栓緩慢退出。

假手術(shù)組僅將動(dòng)脈分離，然后縫合。

模型制備完畢后采用Longa法[10]對(duì)大鼠進(jìn)行測(cè)試：0分，無神經(jīng)缺失的癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，神經(jīng)缺失癥狀嚴(yán)重，不能行走。0分、4分剔除，重新造模補(bǔ)充。

1.4 干預(yù)方法

假手術(shù)組和模型組不予任何治療。給予同等條件喂養(yǎng)和抓取。

電針組選用華佗牌針灸針(直徑0.25mm，長13 mm)針刺神庭、百會(huì)。大鼠穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]，神庭向上斜刺，深2mm；百會(huì)向前斜刺，深2mm。接SDZ-V電針儀，疏密波，頻率1～20Hz，強(qiáng)度2mA。每次30m in，每天1次，共1周。

1.5 Morris水迷宮

電針第2天開始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。

定位航行實(shí)驗(yàn)時(shí)，每次訓(xùn)練將大鼠從4個(gè)象限依次放入，每個(gè)象限的入水點(diǎn)固定，間隔5min。若大鼠在90 s內(nèi)找到平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留3 s以上，計(jì)為逃避潛伏期；如果90 s內(nèi)沒有完成，則逃避潛伏期計(jì)為90 s。計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算平均路程。均取4個(gè)象限的平均值，共5 d。

空間探索實(shí)驗(yàn)于定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后進(jìn)行。撤掉平臺(tái)，將大鼠從原平臺(tái)所在象限的對(duì)面象限放入水中，計(jì)算90 s內(nèi)大鼠游泳時(shí)穿過平臺(tái)區(qū)的次數(shù)。

1.6 TTC染色

各組分別取7只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3 m l/kg，左心室灌注冰生理鹽水?？焖贁囝^取腦，將組織置于-20℃冰箱速凍30m in。取出組織于冰上切掉嗅球及小腦部分，在視交叉處前后每隔2mm切1片，共切5個(gè)腦片。將腦片置2%TTC溶液中，錫箔紙包裹，37℃水浴15～30m in，用毛筆刷翻動(dòng)腦片，使組織均勻接觸染色液[12]。Image J軟件測(cè)定腦梗死面積

梗死面積=非缺血側(cè)半球面積-缺血側(cè)半球未梗死區(qū)面積

各腦片梗死面積之和乘以厚度為總的梗死體積，計(jì)算腦梗死灶體積與全腦體積比(腦梗死體積百分比)。

1.7 免疫組化染色

各組分別取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3 m l/kg，左心室生理鹽水灌注沖洗，4%多聚甲醛固定。斷頭取腦，4%多聚甲酸后固定。梯度酒精脫

水，二甲苯透明，石蠟包埋。非連續(xù)性切片，厚5 μm?？酒?，脫蠟脫水，10%H2O2室溫孵育10m in，枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)高壓修復(fù)抗原，滴加山羊血清抗原封閉20min，加入CREB(1∶1500)、p-CREB (1∶1000)一抗，4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，室溫孵育20min。DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。采用Image pro-Plus6.0對(duì)圖片進(jìn)行分析，計(jì)算平均光密度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和處理。符合正態(tài)分布方差齊的組間比較采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)用(±s)表示。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

從電針第4天開始，與模型組比較，電針組大鼠經(jīng)過的路程、逃避潛伏期縮短(P＜0.05)；空間探索實(shí)驗(yàn)穿過平臺(tái)次數(shù)增加(P＜0.05)。見表1、表2、表3。

表1 各組逃避潛伏期比較(s)

表2 各組經(jīng)過路程比較(cm)

2.2 TTC染色

電針組梗死體積小于模型組(P＜0.05)。見圖1、表4。

圖1 各組腦組織TTC染色

2.3 CREB、p-CREB表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組CREB、p-CREB表達(dá)減少(P＜0.05)；與模型組比較，電針組 CREB、 p-CREB表達(dá)增加(P＜0.05)。見圖2、表5。

圖2 各組海馬CA1區(qū)CREB、p-CREB表達(dá)(免疫組化染色,bar=100μm)

表3 各組穿過平臺(tái)次數(shù)比較

表4 各組梗死體積百分比比較(%)

表5 各組海馬CA1區(qū)CREB、p-CREB表達(dá)比較(光密度)

3 討論

督脈腧穴百會(huì)、神庭的下方是大腦額葉、頂葉等重要功能腦葉所在。針刺百會(huì)可以減少腦梗死體積[13]，有效緩解各種退行性疾病，改善認(rèn)知功能[14]。神庭穴是元神之府中最中心的地方。二穴合用，對(duì)改善認(rèn)知功能有明顯作用[15]。

本研究顯示，電針神庭、百會(huì)可減輕腦缺血再灌注大鼠的梗死體積，對(duì)腦組織缺血有保護(hù)作用；并能部分恢復(fù)空間學(xué)習(xí)記憶功能。

海馬是缺血缺氧最敏感的區(qū)域[16]，特別是CA1區(qū)，在缺血再灌注后最易遭受二次損傷[17]。海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡后，動(dòng)物可表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)障礙[18]。它的完整性對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶至關(guān)重要[19]。CREB作為一種記憶功能蛋白，與長時(shí)程增強(qiáng)記憶密切相關(guān)[20-21]，其Ser133位磷酸化對(duì)所調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，可促進(jìn)神經(jīng)元存活，突觸增生，神經(jīng)元分化以及學(xué)習(xí)、記憶功能[22-23]。本研究顯示，電針可能通過調(diào)控CREB、p-CREB的表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)元，改善缺血再灌注大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

今后我們需進(jìn)一步深化研究，結(jié)合相關(guān)的機(jī)制，從功能方面進(jìn)行探討，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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Ef fects of Electroacupuncture at Shenting and Baihuion Learning and Memory,and Expression of Cyclic AMP Response Element Binding Protein and Phosphorylation in Ratswith Cerebral Ischem ia-reperfusion

ZHANG Yun1,LINRu-hui2,LIZuan-fang2,TAO Jing3,CHEN Li-dian4
1.ClinicalMedicine Department,Fujian Health College,Fuzhou,Fujian 350101,China;2.Institute of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;3.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;4.Fujian University of TraditionalChineseMedicine,Fuzhou,Fujian 350122,China

Objective To explore the effects of electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)on cognitive dysfunction after stroke.Methods Forty-five Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into control group(n=15),model group(n=15)and electroacupuncture group(n=15).The latter two groupswere occluded theirmiddle cerebral artery for two hours and reperfused.The electroacupuncture group accepted electroacupuncture at Shenting and Baihui24 hours aftermodeling for seven days.They were assessed with Morriswatermaze once a day since the second day of intervention.Theirbrainswere stained with TTC staining tomeasure cerebral infarction volume after treatment,while the expression of cyclic AMP response elementbinding protein(CREB)and phosphorylation(p-CREB)in hippocampal CA1 areawere detected with immunohistochem istry.Results The escape latency and sw imm ing distance of place navigation shortened in the electroacupuncture group compared with those in themodelgroup(P＜0.05)from the fourth day of intervention.The number of cross platform of spatial probe increased(P＜0.05).The infarction volumewas less in the electroacupuncture group than in themodel group(P＜0.05),with increased expression of CREB and p-CREB in hippocampalCA1 area(P＜0.05).Conclusion Electroacupuncture at Shenting and Baihui can increase the expression of CREB and phosphorylation in hippocampal CA1 area in rats after cerebral ischemia-reperfusion,to protect theneurons from ischemiaand improve the learning andmemory function.

cerebral ischem ia-reperfusion;learning and memory;electroacupuncture;cyclic AMP response element binding protein; phosphorylation;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.001

R743.3

A

1006-9771(2016)11-1241-05

2016-05-03

2016-07-19)

2016年福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目(No.科技類JAT160802)。

1.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，福建福州市350101；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州市350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市350122；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州市350122。作者簡介：張?zhí)N(1985-)，女，漢族，湖北宜昌市人，博士，講師，主要研究方向：針刺對(duì)腦血管疾病的研究。E-mail:413295808@qq.com。