孫建華，曲曉軍，王金英，王笑庸，于麗萍

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150020）

納豆激酶微膠囊的研制初探

孫建華1,2，曲曉軍1,2，王金英1,2，王笑庸1,2，于麗萍1,2

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150020）

本文主要就海藻酸鈉對(duì)納豆激酶包埋制備微膠囊的工藝優(yōu)化進(jìn)行初探。經(jīng)過(guò)海藻酸鈉包埋的納豆激酶可以較好地保護(hù)酶的活性，免受外界環(huán)境的影響。同樣，對(duì)于混合多糖的包埋研究發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉/CMC包埋的納豆激酶，有粒徑小、外觀規(guī)則且酶活的回收率高、硬度強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

納豆激酶；海藻酸鈉；微膠囊

納豆激酶是1987年，由日本的須見(jiàn)洋行［1］等人首先從日本一種傳統(tǒng)的發(fā)酵食品——納豆——中分離出來(lái)的，主要是由枯草芽孢桿菌（Bacillus natto）產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶［1,2］發(fā)現(xiàn)并命名的納豆激酶，經(jīng)驗(yàn)證具有較好的溶栓降脂等效果。

本次實(shí)驗(yàn)選用的納豆激酶樣品是復(fù)合酶，本單位制備，其主要成分是納豆激酶，同時(shí)還含有部分蛋白酶、淀粉酶，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，若選擇乳清蛋白及馬鈴薯淀粉等對(duì)其包埋會(huì)被納豆激酶樣品分解。故選用多糖對(duì)本次納豆激酶樣品進(jìn)行包埋，避免被其分解。經(jīng)海藻酸鈉［3］包埋的納豆激酶及納豆激酶微膠囊，對(duì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)及酶活都不會(huì)有太大的影響。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)樣品

納豆激酶干粉：黑龍江省科學(xué)院微生物研究所研制。其他化學(xué)試劑均為分析純、生化純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1.1包埋率及酶活回收率的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中包埋率以及酶活回收率的計(jì)算，見(jiàn)公式（1）以及（2）所示。

式中b-包埋率(%);

m1-包埋的納豆激酶的含量（g）；

m2-包埋的納豆激酶的含量（g）；

h-酶活回收率（%）；

c1-包埋的納豆激酶酶活；

坐在辦公桌前閱讀的可書記，站起來(lái)，慢慢地走到我的身邊，眼神柔和地望著我說(shuō)：“你剛鄉(xiāng)鎮(zhèn)工作，還不太熟悉情況，財(cái)政難啦，機(jī)關(guān)已經(jīng)快揭不開(kāi)鍋了，要不是陳鎮(zhèn)長(zhǎng)把老婆的私房錢拿出來(lái)的，大家怕是要餓肚皮了。”

c2-游離的納豆激酶酶活。

包埋后的納豆激酶含量測(cè)定時(shí)，需用超聲波處理，使納豆激酶從微膠囊中完全釋放，然后按照液體納豆激酶的含量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法采用BCA試劑盒。納豆激酶的活力測(cè)定采用的是纖維蛋白——瓊脂糖平板法。

1.2.1.2海藻酸鈉/CMC包埋納豆激酶的單因素實(shí)驗(yàn)

第一，海藻酸鈉濃度對(duì)包埋納豆激酶的影響。用9.0 mL不同濃度的海藻酸鈉溶液（1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%）與0.10 g納豆激酶溶液，以及1.0 mL的0.40%的羧甲基纖維素鈉（CMC）混合，用磁力攪拌器混合均勻后。然后用2.5mL的注射器打入0.10%的CaCl2溶液中，凝固成小球后，靜置0.5 h，然后濾出小球，換相同濃度的CaCl2溶液繼續(xù)浸泡一定的時(shí)間，再次濾出小球，隨后用蒸餾水沖洗3次，再用濾紙吸干，裝袋，放入4℃層析柜中備用。

第二，羧甲基纖維素鈉濃度對(duì)包埋納豆激酶的影響。用9.0 mL的1.6%的海藻酸鈉溶液與0.10 g納豆激酶溶液，以及1.0 mL不同濃度的羧甲基纖維素鈉溶液（0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%）混合，用磁力攪拌器混合均勻后。然后用2.5 mL的注射器打入0.10%的CaCl2溶液中，凝固成小球后，靜置0.5 h，然后濾出小球，換相同濃度的CaCl2溶液繼續(xù)浸泡一定的時(shí)間，再次濾出小球，隨后用蒸餾水沖洗3次，再用濾紙吸干，裝袋，放入4℃層析柜中備用。

第三，CaCl2溶液的濃度對(duì)包埋納豆激酶的影響。用9.0 mL的1.6%的海藻酸鈉溶液與0.10 g納豆激酶溶液，以及1.0 mL的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液混合，用磁力攪拌器混合均勻后。然后用2.5 mL的注射器打入不同濃度的CaCl2溶液（0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%、0.80%）中，凝固成小球后，靜置0.5 h，然后濾出小球，換相同濃度的CaCl2溶液繼續(xù)浸泡一定的時(shí)間，繼續(xù)固定化，再次濾出小球，隨后用蒸餾水沖洗3次，再用濾紙吸干，放入4℃層析柜中備用。

1.2.1.3海藻酸鈉包埋納豆激酶的正交試驗(yàn)

由1.2.1.2單因素的優(yōu)化條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中選出不同的因素和水平進(jìn)行正交，以期得到最佳的包埋效果。本實(shí)驗(yàn)中選取的因素是海藻酸鈉濃度、羧甲基纖維素鈉濃度以及CaCl2濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并以納豆激酶的酶活回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)選取L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.4混合多糖包埋納豆激酶的酶活大小的比較

采用三種不同的包埋材料對(duì)納豆激酶進(jìn)行包埋，主要是海藻酸鈉與羧甲基纖維素、海藻酸鈉與卡拉膠、殼聚糖這三種不同的材料進(jìn)行復(fù)合。按照一定的操作方法使其對(duì)納豆激酶進(jìn)行包埋，并以相應(yīng)濃度的自由納豆激酶的殘余酶活為相對(duì)酶活100%，三種不同材料的殘余酶活與其的比值為該材料包埋的納豆激酶的相對(duì)酶活。

2　結(jié)果與分析

研究不同濃度的海藻酸鈉對(duì)納豆激酶的包埋率影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，海藻酸鈉包埋納豆激酶的包埋率，隨著海藻酸鈉濃度的逐漸升高也是逐漸上升的，然后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。包埋率最高時(shí)的海藻酸鈉濃度為1.60%。海藻酸鈉濃度低時(shí)，包埋率相應(yīng)較低，主要是因?yàn)榧尤氲募{豆激酶的量達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)，導(dǎo)致有部分納豆激酶未被包上；海藻酸鈉濃度高時(shí)，包埋率也相應(yīng)較低，主要是因?yàn)楹Ｔ逅徕c濃度過(guò)高，會(huì)影響納豆激酶的釋放，從而導(dǎo)致相應(yīng)的包埋率也降低。

圖1　海藻酸鈉濃度對(duì)包埋率的影響Fig.1 The effect of sodium alginate concentration on the embedding rate

研究不同濃度的海藻酸鈉對(duì)納豆激酶酶活回收率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2　海藻酸鈉濃度對(duì)酶活回收率的影響Fig.2 The effect of sodium alginate concentration on the enzyme recovery rate

由圖2可知，隨著海藻酸鈉濃度的增加，酶活回收率呈現(xiàn)的趨勢(shì)是先逐漸升高后下降然后逐漸趨于平緩。并且在海藻酸鈉濃度為1.60%的時(shí)候，酶活回收率為最高91.65%，為所有包埋的海藻酸鈉濃度中的最高值。當(dāng)海藻酸鈉的濃度過(guò)大時(shí)，其溶液黏度很大，所形成的凝膠顆粒的體積過(guò)大，從而影響酶與底物的充分結(jié)合［4］。

研究不同濃度的羧甲基纖維素鈉對(duì)納豆激酶的包埋率的影響，羧甲基纖維素鈉以其優(yōu)良的黏結(jié)力、安全性，故選為包埋納豆激酶的黏結(jié)劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3　羧甲基纖維素鈉濃度對(duì)包埋率的影響Fig.3 The effect of CMC concentration on the embedding rate

由圖3可知，隨著羧甲基纖維素鈉濃度的逐漸升高，其對(duì)納豆激酶的包埋率呈逐漸上升后下降的趨勢(shì)，并且在羧甲基纖維素鈉濃度為0.50%時(shí)，其對(duì)納豆激酶的包埋率為所有濃度的最高值。

研究不同濃度的羧甲基纖維素鈉對(duì)包埋納豆激酶酶活回收率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4　羧甲基纖維素鈉濃度對(duì)酶活回收率的影響Fig.4The effect of CMC concentration on the enzyme recovery rate

由圖4可知，隨著羧甲基纖維素濃度的增加，固定化納豆激酶酶活回收率的變化趨勢(shì)為先上升后下降。在羧甲基纖維素鈉的濃度為0.50%時(shí)，其酶活回收率是最高的。其主要原因是，當(dāng)羧甲基纖維素鈉的濃度過(guò)高時(shí)，導(dǎo)致混合體系的黏度增加，故而使納豆激酶的活力下降。

研究不同濃度的CaCl2對(duì)豆激酶包埋率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5　CaCl2濃度對(duì)包埋酶的影響Fig.5 The effect of CaCl2concentration on the embedding rate

由圖5可知，CaCl2濃度的逐漸升高，海藻酸鈉/CMC包埋納豆激酶的包埋率是呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。并在CaCl2濃度為0.30%時(shí)，包埋納豆激酶的包埋率達(dá)到最高。

研究不同濃度的CaCl2對(duì)包埋納豆激酶酶活回收率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6　CaCl2濃度對(duì)酶活回收率的影響Fig.6The effect of CaCl2concentration on the enzyme recovery

由圖6可知，隨著CaCl2濃度的不斷的增加，納豆激酶的酶活回收率也隨之相應(yīng)的先升高后降低。當(dāng)CaCl2濃度為0.30%時(shí)，其納豆激酶的酶活回收率為77.10%；當(dāng)CaCl2濃度超過(guò)0.30%時(shí)，經(jīng)包埋的納豆激酶的酶活回收率的變化趨勢(shì)逐漸趨于平緩。

經(jīng)海藻酸鈉/CMC包埋的納豆激酶的酶活回收率，隨著CaCl2濃度的變化，其變化趨勢(shì)是大致相同的。CaCl2的濃度主要影響的是所形成的凝膠的交聯(lián)程度，CaCl2溶液的濃度越高，包埋酶顆粒的結(jié)構(gòu)致密程度大大增加，凝膠內(nèi)部的阻力也隨之增大。因此，濃度大的CaCl2溶液會(huì)明顯降低包埋酶的酶活力。

以單因素中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇海藻酸鈉濃度為1.60%、羧甲基纖維素鈉濃度為0.50%和CaCl2濃度為0.30%作為正交實(shí)驗(yàn)較優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)行包埋納豆激酶的正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)的因素如表1所示。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 The factor and level of orthogonal experiment

海藻酸鈉/CMC包埋納豆激酶的正交實(shí)驗(yàn)因素以納豆激酶的酶活回收率作為測(cè)定指標(biāo)，以得到最佳的實(shí)驗(yàn)因素條件。按照L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案以及得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2可知，影響納豆激酶酶活回收率的因素按其影響大小的排序?yàn)椋呼燃谆w維素鈉濃度＞海藻酸鈉濃度＞CaCl2濃度。并且羧甲基纖維素鈉濃度對(duì)酶

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of orthogonal experiment

回收率的影響是最大的，其極差遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他兩個(gè)因素。由正交試驗(yàn)的結(jié)果可知，包埋納豆激酶的最優(yōu)化條件是：海藻酸鈉的濃度為1.80%，羧甲基纖維素鈉的濃度為0.50%，CaCl2的濃度為0.30%。所得包埋酶的酶活回收率為最高，此條件為最佳優(yōu)化條件。

混合多糖包埋納豆激酶的酶活大小的比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7不同包埋材料對(duì)酶活的影響Fig.7 The effect of different materials on enzyme recovery

由圖7可知，經(jīng)過(guò)三種不同材料包埋的納豆激酶的相對(duì)酶活，相差無(wú)幾。三種包埋的相對(duì)酶活的大小比較是：殼聚糖＞海藻酸鈉與羧甲基纖維素鈉＞海藻酸鈉與卡拉膠。但是殼聚糖形成的包埋小球，因其硬度較小，易于受到外界條件的破壞，故還是選擇海藻酸鈉與羧甲基纖維素鈉作為包埋材料。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)選海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉及CaCl2的濃度對(duì)包埋納豆激酶的包埋率和酶活回收率影響條件，篩選出包埋納豆激酶的最優(yōu)工藝條件是：海藻酸鈉的濃度為1.80%，羧甲基纖維素鈉的濃度為0.50%，CaCl2濃度的濃度為0.30%。與其他多糖包埋的納豆激酶比較，海藻酸鈉/CMC包埋的納豆激酶，有以下優(yōu)點(diǎn)：粒徑小、外觀規(guī)則并且酶活的回收率高、硬度強(qiáng)。本研究為納豆激酶今后在藥品及保健品中口服制劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al.A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase)in the vegetable cheese Natto;a typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］.Experientia,1987,43（10）: 1110-1111.

［2］Hsieh C W，Lu W C，Hsieh W C，et al.Improvement of the stability of nattokinaseusing γ-polyglutamic acid as a coating material for microencapsulation［J］.LWT-Food Science and Technology,2009,42（1）：144-149.

［3］張運(yùn)鐸.海藻酸鈉功能特性應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.河南科技（上半月），2011，（09）：56-57.

［4］鄭璐.海藻酸鈉固定化α-淀粉酶的研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

Preliminary Study about Preparation of Natto Kinase Microcapsules

SUN Jian-hua1,2,QU Xiao-jun1,2,WANG Jin-ying1,2，WANG Xiao-yong1,2，YU Li-ping1,2
（1.Institute of Microbiology,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150010,China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences,Haerbin 150020,China)

In this paper,preliminary studies about process optimization of sodium alginate to natto kinase embedding preparation had been performed.It finds out that natto kinase embedded by sodium alginate can preserve the activity of enzymes better and protect the enzymes away from the impact of external environment.Meanwhile,the results of mixed polysaccharide embedding study show that natto kinase embedded by sodium alginate/CMC had some advantages as follows:small grain size,regular appearance,high recovery of enzyme activity and strong hardness.

Natto kinase；Sodium alginate；microcapsule

TQ464.8

A

1674-8646（2016）19-0013-03

2015-07-21

兼具整腸、調(diào)脂及調(diào)節(jié)免疫力的納豆軟膠囊保健食品的研制（KY14BSJH07）

孫建華（1961-），女，學(xué)士，研究員。

于麗萍（1962-），女，學(xué)士，高級(jí)工程師。