尹　敏，張曉杰，臧恒昌

藥學(xué)

兩種方法檢測(cè)人凝血因子IX的細(xì)菌內(nèi)毒素

尹敏，張曉杰，臧恒昌＊

人凝血因子Ⅸ；動(dòng)態(tài)濁度法；家兔檢查法；細(xì)菌內(nèi)毒素

人凝血因子Ⅸ（human coagulation factorⅨ，F(xiàn)Ⅸ）臨床應(yīng)用于控制與預(yù)防B型血友?。ㄏ忍煨跃乓蜃尤狈ΠY，又稱圣誕節(jié)癥）的出血［1］，包括接受外科手術(shù)時(shí)的出血控制與預(yù)防出血等。人凝血因子Ⅸ作為一種在研的靜脈注射制劑，藥典未收載其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，熱原含量檢測(cè)為制品研發(fā)質(zhì)量控制中必要的一項(xiàng)生物學(xué)安全指標(biāo)［2－4］。熱原檢查方法有家兔法和細(xì)菌內(nèi)毒素法，其中家兔法為活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，能直觀反應(yīng)所有類型熱原物質(zhì)對(duì)機(jī)體的致熱情況，操作繁瑣，無(wú)法定量，制品生產(chǎn)過(guò)程的熱原控制較困難；細(xì)菌內(nèi)毒素法僅能測(cè)定供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，可定量，快速測(cè)定［5］。本文參照國(guó)外藥典及中國(guó)藥典2015年版三部中熱原檢查法、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的動(dòng)態(tài)濁度法，初步建立了家兔法和動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)人凝血因子Ⅸ中熱原的檢測(cè)方法［6－12］。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑BET－48G細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀，ZH－BLENDER型漩渦混合器 （天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠），WRY－2008熱原測(cè)溫儀（上海遼卓科貿(mào)有限公司）。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601－201478，規(guī)格：80 EU/支），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水及動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司批號(hào)1408050，規(guī)格0．6 ml/支），人凝血因子Ⅸ （批號(hào)：2015S01、2015S02、2015S03，規(guī)格：50IU FⅨ/ml）山東泰邦生物制品有限公司研發(fā)中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭白兔，普通級(jí)，體重1．7～3．0 kg，雌雄皆可，家兔按《中國(guó)藥典》2015版通則中熱原檢查法進(jìn)行預(yù)選。飼養(yǎng)條件：溫度17～25℃，濕度40%～70%。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將細(xì)菌內(nèi)毒素工作品用1 ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶，置漩渦混合器上混合15 min，然后逐級(jí)稀釋（每步稀釋不超過(guò)10倍）至最終細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為2．0、0．5、0．125、0．03125 EU/ml四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取0．2ml分別倒入預(yù)先加有0．1 ml動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混勻，37℃BET－48G細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀自動(dòng)檢測(cè)，其中每個(gè)濃度重復(fù)3管，同時(shí)做陰性對(duì)照（NC）2管。以平均反應(yīng)時(shí)間的對(duì)數(shù)（lgT）為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線及可靠性分析結(jié)果見表1。

1.3.2樣品最大稀釋倍數(shù)確認(rèn)取復(fù)溶后的供試品1瓶，含人凝血因子Ⅸ為50 IU/ml（c）。人凝血因子Ⅸ細(xì)菌內(nèi)毒素本公司內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)為＜0．03 EU/IU（L），標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度為0．03125 EU/ml（λ1），供試品的最大稀釋倍數(shù)為（MVD）=cL/λ1為24倍。

1.3.3干擾試驗(yàn)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)毒素濃度的設(shè)置，選擇0．25 EU/ml作為靠近曲線中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（λm）的樣品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將其分別稀釋3、6、12、24、48倍，作為供試品溶液（A液），同時(shí)制備含上述供試品濃度并含內(nèi)毒素濃度為λm（0．25 EU/ml）的溶液（B液）。2．1項(xiàng)下的方式測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計(jì)算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量，并計(jì)算該實(shí)驗(yàn)條件下的回收率，回收率在50%～200%實(shí)驗(yàn)成立。

1.3.4樣品溶液驗(yàn)證試驗(yàn)另取三批樣品，依照以上方法檢查，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人凝血因子Ⅸ中的細(xì)菌內(nèi)毒素（EU/ml）。

1.3.5家兔檢查法按照《中國(guó)藥典》2015年版三部熱原檢查法［13］，選取符合熱原檢查實(shí)驗(yàn)要求的家兔9只，隨機(jī)分成三組，每組3只，分別注射含50 IU/ml的FⅨ溶液，另取符合熱原檢查實(shí)驗(yàn)要求的家兔9只，隨機(jī)分成三組，每組3只，分別注射含50 IU/ml的FⅨ同時(shí)含細(xì)菌內(nèi)毒素10 EU/ml的溶液，注射后測(cè)定3 h內(nèi)家兔體溫變化。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（又稱動(dòng)態(tài)濁度法）

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)中，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作品分別稀釋至 2、0．5、0．125、0．03125 EU/mL進(jìn)行檢測(cè)。利用BET－48G細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀軟件的雙對(duì)數(shù)線性擬合得出，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為L(zhǎng)gT=0．47037－0．03703 LgC（T為反應(yīng)時(shí)間，C為溶液中細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度），相關(guān)系數(shù)r=－0．9976（絕對(duì)值應(yīng)＞0．980），反應(yīng)時(shí)間在590～1800 s，而陰性對(duì)照試驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間＞3600 s，在范圍0．03125～2．0 EU/ml內(nèi)，線性良好。見表1，圖1、2。

表1　標(biāo)準(zhǔn)系列吸光度（OD=0．02）

圖1　標(biāo)準(zhǔn)系列吸光度（OD值）隨時(shí)間變化

圖2　標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2動(dòng)態(tài)濁度法檢定人凝血因子Ⅸ中細(xì)菌內(nèi)毒素及干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果得到三批人凝血因子Ⅸ內(nèi)毒素濃度，2015S01最大為1．401 EU/ml，小于本企業(yè)的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)1．5 EU/ml。三次試驗(yàn)干擾試驗(yàn)（回收率）100．56～117．52%，證明該方法準(zhǔn)確可靠，在24的稀釋倍數(shù)下干擾小。見圖3。

2.2動(dòng)態(tài)濁度法和家兔檢查法檢測(cè)人凝血因子Ⅸ中細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)果3批次樣品在本公司內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)中都符合規(guī)定，其中2015S01動(dòng)態(tài)濁度法細(xì)菌內(nèi)毒素含量為1．404 EU/ml，家兔法升溫最高為 （0．08± 0．08）℃，兩種方法有一定的相關(guān)性。見表2。

圖3　三批試樣吸光度（OD值）隨時(shí)間變化

表2　動(dòng)態(tài)濁度法與家兔法檢測(cè)凝血因子Ⅸ中的細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)果

3　討　論

家兔對(duì)熱原的反應(yīng)與人基本相似，能夠檢測(cè)所有類型的熱原物質(zhì)，并能較好反映外源性熱原引起哺乳動(dòng)物復(fù)雜的升溫過(guò)程。因此家兔法熱原檢查為檢測(cè)熱原質(zhì)的法定方法，但是，在生產(chǎn)過(guò)程控制中，該法因檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，動(dòng)物個(gè)體差異等原因不太適用。鱟試劑動(dòng)態(tài)濁度法是采用專用儀器（細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀）在適當(dāng)波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法，內(nèi)毒素與鱟試劑的C因子反應(yīng)，被激活的凝固酶切斷凝固原蛋白中的精氨酸肽鏈，形成凝固蛋白，在產(chǎn)生凝膠的過(guò)程中發(fā)生濁度變化，用內(nèi)毒素測(cè)定儀檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間。內(nèi)毒素濃度和形成凝膠時(shí)間負(fù)相關(guān)，即內(nèi)毒素濃度越高形成凝膠時(shí)間越短。細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是由一系列酶促放大作用產(chǎn)生的，其干擾因素可能有供試品的酸堿度、金屬離子濃度、非特異性鱟試劑激活物、對(duì)儀器檢測(cè)光源的吸收干擾等［14］。本實(shí)驗(yàn)干擾試驗(yàn)結(jié)果表明：用動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定人凝血因子Ⅸ稀釋液中細(xì)菌內(nèi)毒素，其回收率均在50%～200%，表明此條件下不存在干擾因素，且3批樣品均在規(guī)定的限度0．03 EU/IU（1．5 EU/ml）以下，判為合格。

同凝膠法相比，動(dòng)態(tài)濁度法由于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，最大限度的消除了標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確性的影響，同時(shí)計(jì)算回收率更科學(xué)，對(duì)樣品干擾行為的描述更加準(zhǔn)確；與家兔法熱原檢查相比，操作簡(jiǎn)便，靈明度高，可定量，避免了由于動(dòng)物個(gè)體差異造成的異常結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)毒素限值確定時(shí)采用的標(biāo)準(zhǔn)較嚴(yán)格，為按家兔法注射劑量計(jì)算得出限值的1/3，若內(nèi)毒素結(jié)果＞0．03 EU/IU，應(yīng)采取家兔法進(jìn)行復(fù)核，并引起足夠重視。

［1］顏景斌．人凝血因子Ⅸ突變型研究現(xiàn)狀［J］．遺傳，2005，27（5）：833－838．

［2］趙艷華，馬平，卜鳳榮．凝血因子分子生物學(xué)研究進(jìn)展［J］．生物技術(shù)通訊，1999，10（2）：158．

［3］Yamamoto M，Ochiai H，F(xiàn)ujiwara S，et al．Evaluation of the applicability of the bacterialendotoxin test to antibiotic products［J］．Biologicals，2000，28（3）：155－167．

［4］楊軍，應(yīng)蓮芳，蔣琳，等．凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)注射用重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中細(xì)菌內(nèi)毒素含量［J］．微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2013，41（4）：37－41．

［5］張璘，張繼鵬，趙一歡，等．靜注人免疫球蛋白細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)方法的探討［J］．微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2013，41（2）：23－27．

［6］王莉，高華，蔡彤，等．鱟試劑的研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］．藥物分析雜志，2007，27（6）：938－942．

［7］BP 2011．Vol V［S］．2011：AppednixⅨ C－A 356．

［8］USP 35－NF 30．VolⅠ［S］．2012：Biological Test＜85＞90．

［9］JP 2011［S］．2011：General Test－4．01 Bacterial Endatoxin Test，92．

［10］EP．7．0［S］．2011：Appendix－2．6．14 Bacterial endatoxin，171．

［11］Indian Pharmacopeia 2010．VolⅠ［S］．2010：General Chapter－2．2．3 Bacterial Endatoxin Test，8．

［12］PhInt（Fourth edition）．Vol 2［S］．2006：Methods of Analysis－3．4 Test for Bacterial Endotoxins，1245．

［13］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典［S］．2015年版．三部．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社．

［14］The United States Pharmacopoeia Committee．The United States Pharmacopoeia［R］．23ed．Rockville MD：United States Pharmacopoeia Convention，lne，1995：1696．

［2016－05－12收稿，2016－06－10修回］

［本文編輯：劉一洋］

R965．1

B

10．14172/j．issn1671－4008．2016．11．021

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