高英

（遼寧省北鎮(zhèn)市動物疫病預防控制中心，遼寧 北鎮(zhèn) 121300）

細胞工廠培養(yǎng)禽流感（H9亞型）病毒試驗研究

高英

（遼寧省北鎮(zhèn)市動物疫病預防控制中心，遼寧 北鎮(zhèn) 121300）

禽流行性感冒（簡稱禽流感，Avain Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類（包括家禽和野禽）的感染和或疾病綜合征，主要引起禽類的全身性或呼吸系統(tǒng)性疾病，被世界動物衛(wèi)生組織確立為A類傳染病。對各國養(yǎng)禽業(yè)危害很大。

我國通常用雞胚培養(yǎng)禽流感病毒（AIV）來生產(chǎn)AI疫苗，由于雞胚培養(yǎng)病毒存在諸多缺點，我們進行了用細胞培養(yǎng)（AIV）的試驗研究，主要用轉瓶培養(yǎng)細胞、細胞工廠培養(yǎng)細胞來增殖培養(yǎng)（AIV）對比試驗和細胞工廠培養(yǎng)（AIV）的工藝優(yōu)化試驗，取得了很好的效果。

1 材料與方法

1.1 毒 株

H9N2亞型禽流感病毒，由本單位分離并鑒定。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，進口胎牛血清由購自Hyclone，胰酶購自Washington公司，Nunc EasyFill細胞工廠（10層，培養(yǎng)面積6320cm2，工作容量2000mL）購自Thermo Fisher。

1.3 細胞及傳代培養(yǎng)

細胞：MDCK細胞來自哈爾濱獸醫(yī)研究所，在本實驗室已擴增凍存，目前在本實驗室傳至75代，已經(jīng)適應在本實驗室的培養(yǎng)基中生長。

細胞傳代的方法：首先復蘇所選擇的種細胞MDCK到T75的細胞瓶中，生長48h左右，按照1:4的比例進行傳代；然后把6個長滿細胞的T75細胞瓶中的細胞傳到1個10L轉瓶進行培養(yǎng)；48h左右按照1:3的比例進行細胞傳代培養(yǎng)；該過程中使用的培養(yǎng)基為DMEM，血清為胎牛血清，使用量為10%。

收獲轉瓶中的細胞：將轉瓶中所得細胞用PBS洗滌2次，然后加入濃度為0.25%胰酶-EDTA溶液125mL消化，收集細胞。

收獲得細胞經(jīng)計數(shù)后，采用Thermo Scientific Nunc細胞工廠（10層，培養(yǎng)面積6320cm2，工作容量2000mL)對MDCK細胞進行培養(yǎng)；所用的培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基。所用其它試劑包括牛血清、TPCK-胰酶等。細胞接種后在12h、24h、48h取樣觀察細胞在細胞工廠上的生長狀況。

1.4 AIV在細胞工廠中增殖的條件優(yōu)化

為了闡明細胞密度、病毒感染復數(shù)（MOI）和BSA濃度對AIV病毒增殖的影響，采用多因素實驗設計方法，考慮 MOI （0.1、1）、細胞密度（0.5×105細胞/mL，1.0×105細胞/mL）和BSA濃度（0.5%、1%）3個水平試驗因素，在各水平條件下以組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）和血凝價（HA）作為觀測指標，確認AIV病毒滴度在不同增殖條件下的差異。

1.5 收 獲

培養(yǎng)至80%以上的細胞出現(xiàn)致細胞病變效應（CPE）時，收獲。

2 試驗結果

2.1 細胞工廠與轉瓶培養(yǎng)細胞面積比較結果

表1 細胞工廠與轉瓶培養(yǎng)面積比較

2.2 AIV在細胞工廠中增殖條件優(yōu)化結果

通過表2可以看出病毒繁殖效果最差的是4組，在該條件下最大的HA為128，而在1組合2組中，病毒HA最大達到了1024，效果相同，其中2組TCID50優(yōu)于1組，達到了4.78×107TCID50/mL。

因此，病毒繁殖的條件為：細胞密度優(yōu)選5～10萬細胞/mL，H9N2亞型AIV種毒按MOI=1進行接種，病毒維持液為不含血清的DMEM（1%BSA和2μg/mL的TPCK-胰酶），放入38℃溫室培養(yǎng)48～72h。

3 小結

通過試驗研究結果表明，利用細胞工廠培養(yǎng)的H9亞型（AIV）具有較高的免疫原性，批量生產(chǎn)大，降低生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)AI疫苗。

表2 AIV在細胞工廠中增殖條件優(yōu)化結果

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.017