丁 麗，朱 恒，張海宏，楊 洋，韓冬梅，王志東，鄭曉麗， 董 磊，閆洪敏，劉 靜，朱 玲，薛 梅，郭子寬，王恒湘

(1.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院血液科，北京 100142；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3. 中國人民解放軍空軍總醫(yī)院普外科，北京 100142；4. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

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組織塊法分離培養(yǎng)小鼠脾臟間充質(zhì)干細(xì)胞

丁 麗1，朱 恒2，張海宏3，楊 洋1，韓冬梅1，王志東1，鄭曉麗1， 董 磊1，閆洪敏1，劉 靜1，朱 玲1，薛 梅1，郭子寬4，王恒湘1

(1.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院血液科，北京 100142；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3. 中國人民解放軍空軍總醫(yī)院普外科，北京 100142；4. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

目的 通過組織塊培養(yǎng)法，建立一種高效可靠的小鼠脾臟間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增策略。方法 無菌條件下取小鼠脾臟組織充分碾碎，使用膠原酶消化獲得的脾臟基質(zhì)組織，將消化后的組織塊種于培養(yǎng)瓶中，觀察從組織塊中遷移出的細(xì)胞形態(tài)，采用流式細(xì)胞術(shù)分析其表型，并將其做成骨和成脂肪誘導(dǎo)分化。結(jié)果 消化后的脾臟組織塊中遷移遷移出大量梭形纖維樣細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，該種細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44、Sca-1 和CD105，低表達(dá)CD11b、CD34、CD45和Ia。多向分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：小鼠脾臟基質(zhì)組織中遷移出的細(xì)胞具有較好的成脂肪和成骨分化能力。結(jié)論 組織塊法可以分離培養(yǎng)出小鼠脾臟間充質(zhì)干細(xì)胞，所獲得的細(xì)胞純度高，分化能力強(qiáng)，為開展相關(guān)研究提供了良好的細(xì)胞模型。

組織；細(xì)胞培養(yǎng)；脾臟；間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)是一種具有多向分化潛能和高度自我更新能力的干細(xì)胞[1，2]。MSC最早由Friedenstein等[3]等在骨髓中發(fā)現(xiàn)，隨后研究人員陸續(xù)在骨、臍帶、脂肪等多種組織中分離成功。MSC在適宜的條件下可以大量擴(kuò)增，并且分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種組織類型的細(xì)胞，是目前組織工程領(lǐng)域最常用的種子細(xì)胞之一[1]。此外，MSC還具有造血支持能力，能夠調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞分化為多種譜系的造血細(xì)胞，是造血微環(huán)境的重要組成部分[4]。更有意義的是，MSC還能夠調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等的發(fā)育和功能，有助于維持機(jī)體免疫反應(yīng)和免疫穩(wěn)態(tài)[5]。

脾臟是人和動物體內(nèi)重要的造血器官和免疫器官[6]。在人和動物的胚胎發(fā)育早期，脾臟有造血的功能。出生后脾的造血功能基本消失，但在極端條件下，如機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重造血障礙時，脾臟也可重新出現(xiàn)造血功能。此外，某些嚙齒類動物如小鼠的脾臟可以終身造血[6]。脾臟還是重要的免疫器官。脾臟內(nèi)含有大量的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)等免疫細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。其中的樹突狀細(xì)胞能夠攝取機(jī)體內(nèi)的腫瘤抗原或者外源入侵的抗原，加工遞呈給相應(yīng)的T細(xì)胞，促進(jìn)相關(guān)的T細(xì)胞亞群增殖分化，并啟動B細(xì)胞為主的體液免疫，實(shí)現(xiàn)腫瘤清除和病原清除[7]。

值得關(guān)注的是，脾臟內(nèi)造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的發(fā)育分化過程受到脾臟微環(huán)境的調(diào)控[8,9]。MSC及由MSC分化而來的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等不僅為造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞發(fā)育分化提供空間結(jié)構(gòu)，而且表達(dá)多種調(diào)節(jié)因子(如細(xì)胞因子、膜微粒和一氧化氮等)和細(xì)胞間粘附分子，共同構(gòu)成脾臟微環(huán)境，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。因此，分離獲得脾臟MSC，深入開展功能研究，對于了解脾臟基質(zhì)微環(huán)境尤為重要。然而，多年以來有關(guān)脾臟MSC分離培養(yǎng)的策略一直報道不多[10]。鑒于此，我們在參閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，探索了膠原酶消化聯(lián)合組織塊培養(yǎng)法，以期建立出穩(wěn)定、重復(fù)性好、細(xì)胞純度高的小鼠脾臟MSC分離策略，從而為開展脾臟相關(guān)的造血和免疫學(xué)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康C57BL /6 和BALB /cl 小鼠，6～8周齡，雌雄不限，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號[SCXK(京)2012-0001]。

1.2 儀器與試劑

干細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco 公司；β-磷酸甘油、磷酸化維生素C、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤( IBMX)、胰島素、油紅O 染液、II型膠原酶、胰酶、堿性磷酸酶試劑盒購自美國Sigma 公司； MSC 流式表型檢測用抗體: PE-anti-mouse CD11b、PE-anti-mouse CD29、FITC-anti-mouse CD34、PE-anti-mouse CD44、FITC-anti-mouse CD45、PE-anti-mouse CD105、PE-anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)、PE-anti-mouse Ia購自美國Ebioscience 公司；細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶購自美國康寧公司；流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson 公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自英國Thermo 公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

無菌條件下，打開小鼠腹腔取脾臟，在超凈臺內(nèi)以注射器柄將其在培養(yǎng)皿中充分碾碎，以PBS沖去細(xì)胞成分，將獲得的基質(zhì)組織加入0.1%的II型膠原酶液中，37℃條件下以消化1 h, 棄消化液，將消化后的脾臟基質(zhì)組織種入含有10%血清的α-MEM中，3 d 換液，待MSC 爬滿培養(yǎng)瓶后，以胰酶消化，收MSC 分別種入貼附培養(yǎng)瓶和低吸附培養(yǎng)皿中，在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)，拍照。每隔2～3 d 傳代，收取第3～6 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式細(xì)胞分析

參照我們前期發(fā)表的方法采用流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟MSC 的免疫表型[11,12]。簡言之，以胰酶消化收獲第4 代細(xì)胞，制備為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1 × 106細(xì)胞/管。按照說明書要求，分別加入抗小鼠CD11b，CD29，CD34，CD44，CD45，CD105和Sca-1和Ia抗體。4℃避光孵育30 min。洗滌未結(jié)合的抗體后，采用美國Becton Dickinson 流式細(xì)胞儀上機(jī)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WinMDI 2. 9 軟件分析。

1.5 細(xì)胞分化潛能的鑒定

成骨和成脂肪誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)參照以往發(fā)表的方法進(jìn)行[11,12]。簡言之，成骨分化以及染色取第4 代小鼠脾臟MSC，按照5 × 104細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度種于24孔培養(yǎng)板中，誘導(dǎo)體系為高糖DMEM、10%胎牛血清，維生素C 磷酸鹽(50 μmol /L)，β 磷酸甘油(10 mmol /L) 和地塞米松( 10-7mol /L)。7 d 后根據(jù)試劑盒說明書要求進(jìn)行堿性磷酸酶染色。成脂肪分化以及染色收獲第4 代小鼠脾臟MSC，按照3 × 104細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，誘導(dǎo)體系為高糖DMEM，IBMX ( 0.5 μmol /L)，10%胎牛血清，胰島素( 10 ng/mL) 和地塞米松( 10- 6mol /L)。成脂肪誘導(dǎo)的第7 天，染油紅O 判斷分化效率。染色結(jié)果顯微鏡下觀察，照相。

2 結(jié)果

2.1 組織塊法分離獲得的小鼠脾臟MSC具有經(jīng)典的形態(tài)特征

無菌條件下，分離小鼠脾臟，碾碎后得到脾臟基質(zhì)組織(圖1A)，以膠原酶消化為小組織塊(圖1B)。

將膠原酶消化后的脾臟基質(zhì)組織在培養(yǎng)基中靜置止培養(yǎng)3～5 d左右，即可在倒置顯微鏡下觀察到有細(xì)胞從組織塊中爬出(圖2A)。這些細(xì)胞為梭形貼壁生長，經(jīng)過傳遞培養(yǎng)后，生長迅速，并可呈旋渦狀或者紡錘狀密集生長，符合經(jīng)典的MSC形態(tài)和生長特點(diǎn)(圖2B)。

2.2 組織塊法分離獲得的小鼠脾臟MSC具有經(jīng)典的細(xì)胞免疫表型

為了判斷組織塊法分離獲得的小鼠脾臟MSC的細(xì)胞純度，我們進(jìn)一步檢測了其免疫表型。流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果表明，我們分離獲得的小鼠MSC 高表達(dá)間質(zhì)標(biāo)記CD29，CD44，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記Sca-1 和CD105，低表達(dá)造血標(biāo)記CD11b 和CD45，低表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34，低表達(dá)免疫共刺激分子Ia( 圖3)。該結(jié)果表明我們獲得的是一群間質(zhì)來源的非造血干細(xì)胞，且具有較低的免疫原性，符合經(jīng)典的MSC免疫表型特征。

2.3 組織塊法分離獲得的小鼠脾臟MSC具有多譜系分化潛能

為觀察小鼠脾臟MSC的多向分化潛能，我們分別進(jìn)行了成骨和成脂肪誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。堿性磷酸酶是MSC成骨分化過程中的重要指標(biāo)。如圖4A所示，在成骨誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)的小鼠脾臟MSC堿性磷酸酶染色陽性，提示該種類的MSC具有成骨分化潛能。油紅O具有較好的脂肪結(jié)合能力。小鼠脾臟MSC成脂肪誘導(dǎo)7 d后，即可見細(xì)胞中逐漸出現(xiàn)大量脂肪滴，加入油紅O 染色液之后，可觀察到脂肪滴被染為紅色，該結(jié)果表明小鼠脾臟MSC具有良好的成脂肪分化能力( 圖4B)。

A為未消化的脾臟基質(zhì)組織，B為膠原酶消化后的脾臟基質(zhì)組織圖1 分離消化脾臟基質(zhì)組織(A) Undigested spleen mesenchymal tissues; (B) Collagenase-digested spleen mesenchymal tissuesFig.1 Isolation and digestion of spleen mesenchymal tissues

3 討論

脾臟微環(huán)境是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、胚胎造血和出生后病理性造血的重要生理結(jié)構(gòu)。但是脾臟微環(huán)境研究一直缺乏與體內(nèi)環(huán)境相對應(yīng)的細(xì)胞工具。

(A)間充質(zhì)干細(xì)胞從脾臟基質(zhì)組織塊中爬出；(B)為增殖良好的脾臟間充質(zhì)干細(xì)胞圖2 原代培養(yǎng)脾臟間充質(zhì)干細(xì)胞(標(biāo)尺=200 μm)(A) Mesenchymal stem cells migrate from a spleen tissue explant. (B) Highly proliferative spleen mesenchymal stem cells Fig.2 Primary culture of spleen mesenchymal stem cells

圖3 脾臟間充質(zhì)干細(xì)胞的流式免疫表型Fig.3 Immunophenotypes of the spleen mesenchymal stem cells detected by flow cytometry

(A)脾臟間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化后堿性磷酸酶染色，(B)為脾臟間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪分化后油紅O染色圖4 脾臟間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化(標(biāo)尺=200 μm)(A) Osteoblast differentiation of the spleen mesenchymal stem cells. ALP staining; (B) Adipocyte differentiation of the spleen mesenchymal stem cells. Oil-red O staining. Fig.4 Multi-directional differentiation of the spleen mesenchymal stem cells

相關(guān)領(lǐng)域研究人員采用脾臟基質(zhì)細(xì)胞成份來模擬脾臟微環(huán)境，研究其對造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用，取得了較好的發(fā)現(xiàn)。Zhang及其同事從小鼠脾臟中分離獲得CD106陽性的內(nèi)皮樣脾臟基質(zhì)細(xì)胞(ESSCs)來觀察其對DC發(fā)育的影響[13]。相關(guān)研究結(jié)果表明ESSCs能夠促進(jìn)CD11chighIahigh成熟DC增殖并繼續(xù)分化為有免疫負(fù)調(diào)控能力的調(diào)節(jié)性DC，從而打破了成熟DC是終末分化細(xì)胞的定論。而Tang等的進(jìn)一步研究表明脾臟基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)CD34+的造血干細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性DC[14]。

值得關(guān)注的是，目前對于脾臟微環(huán)境的研究側(cè)重于終末分化細(xì)胞(主要是基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等)，而對處于發(fā)育源頭的干細(xì)胞對脾臟微環(huán)境的影響國內(nèi)外文獻(xiàn)卻報道不多。實(shí)際上，MSC是脾臟微環(huán)境的重要參與者。首先， MSC是脾臟微環(huán)境內(nèi)多種支持細(xì)胞的起源細(xì)胞，研究MSC生物學(xué)特性的改變有助于從“源頭”發(fā)現(xiàn)規(guī)律解決問題；其次，MSC能夠不斷自我自我復(fù)制，即自我更新，能夠?yàn)槠⑴K微環(huán)境提供源源不斷的“種子”?；诖?，我們開展了脾臟MSC相關(guān)的研究。

目前關(guān)于小鼠脾臟MSC的報道卻不多。為了建立一種可靠的研究工具，我們在本研究中嘗試采用組織塊聯(lián)合膠原酶消化法分離獲得了小鼠脾臟MSC。從細(xì)胞形態(tài)上看，我們獲得的細(xì)胞具有成纖維樣貼壁生長的特點(diǎn)。從細(xì)胞免疫表型方面看，該細(xì)胞表達(dá)經(jīng)典MSC表面分子。然而，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞免疫表型并不足以判斷一種細(xì)胞是MSC，成纖維細(xì)胞也具有同樣的特點(diǎn)[15]。只有多向分化實(shí)驗(yàn)是判斷MSC的“金標(biāo)準(zhǔn)”[16]，我們的結(jié)果表明該細(xì)胞同時具有成骨和成脂肪分化能力，從而確定了其是脾臟來源的MSC。當(dāng)然，有關(guān)該脾臟MSC的生理和病理特性仍有待于進(jìn)一步深入研究。

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Primary culture of murine spleen-derived mesenchymal stem cells by explant culture

DING Li1, ZHU Heng2, ZHANG Hai-hong3, YANG Yang1, HAN Dong-mei1, WANG Zhi-dong1, ZHENG Xiao-li1, DONG Lei1, YAN Hong-min1, LIU Jing1, ZHU Ling1, XUE Mei1, GUO Zi-kuan4, WANG Heng-xiang1

(1. Department of Hematology, Air Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing, 100142, China; 2. Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing, 100850; 3. Department of General Surgery, Air Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing, 100142; 4. Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing, 100850)

Objective This study aimed to establish a reliable primary culture protocol for preparing murine spleen-derived mesenchymal stem cells (MSCs) by tissue explant culture. Methods Healthy mouse spleens were crushed by syringe handle to harvest spleen mesenchymal tissues. Then the tiny pieces of spleen tissue were digested by collagenase II before seeded into culture flasks. The morphological characteristics of spleen tissue-derived cells were observed under the inverted microscope. Further, the surface antigen profile of the cells was analyzed by flow cytometry (FACS). The cells were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. Results The murine spleen-derived MSCs exhibited a spindle-shaped appearance. The FACS results showed that the spleen-derived MSCs highly expressed CD29, CD44, CD105 and Sca-1, but weakly expressed CD11b, CD34, CD45 and Ia. In addition, the spleen-derived MSCs steadily differentiated into osteoblasts and adipocytes in the induction medium．Conclusions A method of primary culture of murine spleen-derived MSCs by explant culture is successfully established. The harvested MSCs exhibit high purity and cell proliferation ability, and provide a reliable cell model for related researches.

Tissue explant; Cell culture; Spleen; Mesenchymal stem cells; Osteoblast differentiation; Adipocyte differentiation; Mice

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81500083, 81371945, 81572159, 81101342)；空軍總醫(yī)院院級課題( KZ2014023)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(7132133)。

丁麗 (1975-)，女，博士，研究方向：干細(xì)胞與血液病學(xué)。E-mail: dingli7578@163.com。

王恒湘，碩士，主任醫(yī)師，從事血液系統(tǒng)疾病的研究與治療，wanghengxiang123@aliyun.com；郭子寬，博士，研究員，主要從事轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究guozk@bmi.ac.cn；朱恒，博士，副研究員，主要從事干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究，E-mail: zhudingdingabc@163.com。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0056-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.10.011

2016-06-06