孟 霞,劉樹紅，李 霞，豐 平，盧 靜，王學江

( 1. 首都醫(yī)科大學實驗動物部，北京 100069; 2. 首都醫(yī)科大學病理生理教研室，北京 100069)

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槲芪散對肝癌前病變端粒酶活性的調控作用

孟 霞1,劉樹紅2，李 霞2，豐 平2，盧 靜1，王學江2

( 1. 首都醫(yī)科大學實驗動物部，北京 100069; 2. 首都醫(yī)科大學病理生理教研室，北京 100069)

目的 探討端粒酶在肝癌前病變形成和發(fā)展中的作用及方劑槲芪散(HQS)、君藥槲寄生對其活性的調控機制。方法 將大鼠分為模型組、HQS大劑量組[8 g/(kg·d)]、小劑量組[4 g/(kg·d)]、槲寄生堿組[8 mg/(kg·d)] 及正常組。運用經典的Solt-Farber二步法復制大鼠肝癌前病變的模型，采用組織化學方法檢測肝臟組織中γ-谷氨酰轉肽酶活性的表達；免疫熒光的方法檢測肝臟組織中AFP的表達；采用Quantitative Telomerase Detection Kit(QTD Kit)測定肝臟組織中端粒酶的活性；免疫組織化學方法檢測肝臟組織中NF-κB P65蛋白的表達；Western blot的方法測定IκB-α在胞漿蛋白中的含量。結果 HQS和槲寄生總堿治療后，肝臟中γ-GT陽性灶面積、AFP的陽性細胞數均較模型組明顯減少(P<0.05)；同時顯示治療組大鼠肝臟中NF-κB P65的陽性細胞數較模型組相比明顯減少(P<0.05)；治療后IκB-α在胞漿中的蛋白含量與模型組相比有所增加，差異有顯著性(P<0.05)。結論 HQS和槲寄生總堿能夠抑制肝癌前病變組織端粒酶活性的表達，其作用是通過抑制凋亡相關基因NF-κB的過表達，增加IκB-α的表達，進而降低端粒酶的活性。

槲芪散；端粒酶；肝癌前病變； NF-ΚB P65；IκB-α；大鼠

由于端粒酶在惡性腫瘤中的廣泛表達，將端粒酶作為靶點進行腫瘤治療受到重視。中藥通過調控端粒長度和端粒酶活性對腫瘤影響的研究也有了一定的進展。特別是中藥復方可以通過對細胞異變的多階段、多靶點干預作用，調節(jié)細胞凋亡和細胞增殖的平衡[1]。中藥可通過作用于腫瘤基因以及抑制端粒酶活性等方面來誘導腫瘤細胞向正常細胞方向分化[2]，從而達到預防或延緩癌變發(fā)生的目的[3]。

方劑槲芪散(HQS)是國家級名老中醫(yī)錢英教授在臨床應用多年的經驗方，具有抗炎、逆轉肝硬變的顯著臨床治療作用。我們以往的實驗觀察到，HQS可減少肝癌前病變大鼠肝臟中γ-谷氨酰轉肽酶陽性灶的數目和面積，抑制大鼠肝癌前病變灶中原癌基因的表達，阻斷肝癌前病變的發(fā)生發(fā)展；HQS及其從君藥槲寄生中提取的總堿和多糖可以在體外抑制肝癌細胞的增殖，促進其凋亡[4]。為探討HQS、槲寄生總堿及多糖促進肝腫瘤細胞凋亡的機制，我們探究了端粒酶、端粒在肝癌形成過程中的作用，并觀察了HQS、槲寄生總堿、多糖對端粒酶、端粒的影響，以期闡明HQS及槲寄生逆轉肝癌前病變的機制。

1 材料和方法

1.1 中藥HQS的制備

中藥復方HQS由槲寄生、黃芪等八味中草藥組成，所用中藥一次備齊，經鑒定符合藥典用藥規(guī)定，由中日友好醫(yī)院藥劑科制成無糖顆粒備用，4℃保存。槲寄生總堿由北京市中醫(yī)研究所提取制備。

1.2 主要試劑及儀器

羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、胰蛋白酶( trypsin)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)購自Sigma公司; Quantitative Telomerase Detection Kit (QTD Kit)為Allied Biotech, Inc。酶標儀SA1000奧地利Digiscan; Real-time PCR Bio-Rad 3000；Leica Qwin 圖象分析處理系統(tǒng)(Leica)。

1.3 實驗動物及肝癌前病變動物模型復制

實驗所需動物由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2011-0011)。選用6周齡，健康、雄性Wistar大鼠50只，體重110～120 g；動物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物部屏障環(huán)境動物實驗室(實驗動物設施許可證號：SYXK(京)2010-0020)。

1.3.1 肝癌前病變動物模型： 采用Solt-Farber實驗模型的選擇程序。選用6周齡Wistar雄性大鼠，腹腔一次性注射二乙基亞硝胺(DEN)200 mg/Kg體重，作為啟動劑，2周后進入選擇性促進程序，即按經典術式施行大部肝切除術(PH)，再飼以含0.015%二乙酰氨基芴(2-AAF)飼料5周。第7周末，所有實驗大鼠禁食24 h后斷頸椎處死。在每只大鼠肝臟右前葉、右后葉和尾葉規(guī)定部位取肝組織進行檢測。

1.3.2 實驗分組及藥物處理: 實驗分為5組，每組10只動物，即正常組、模型組、槲芪散大劑量(15 g/kg體重/d)治療組、槲芪散小劑量(4g/kg體重/d)治療組、槲寄生總堿治療組(8 mg/kg體重/d)。除正常組外，其余各組在大部肝切除術(PH)1周后，用不同濃度槲芪散開始經胃飼給藥，持續(xù)至實驗結束，連續(xù)給藥3周；正常組以等量生理鹽水灌胃。第7周末，所有實驗大鼠禁食24 h后斷頸椎處死。在每只大鼠肝臟右前葉、右后葉和尾葉固定部位取肝組織，進行各種實驗檢測。

1.4 端粒酶的活性測定

采用Quantitative Telomerase Detection Kit(QTD Kit)進行端粒酶活性檢測。取凍存的各組大鼠肝臟組織在液氮中研磨，加入lysis buffer制備肝組織懸液。陰性對照組：取25 μL的肝組織懸液上清，進行實時定量PCR檢測，滅活端粒酶的活性作為陰性對照。陽性對照：取5個0.5 mL EP管，分別加入8 μL細胞裂解液，1號管加入端粒酶RNA(TSR)2 μL，2～4號管依次按照5:1稀釋，使各管TSR濃度依次為0.1 amol/μL，0.02 amol/μL，0.004 amol/μL，0.0008 amol/μL， 0.00016 amol/μL。嚴格按照端粒酶檢測試劑盒說明進行操作,上樣后進行實時熒光PCR反應:變性( 30 s 95℃), 退火(30 s 60℃),延伸(30 s 72℃),循環(huán)數(35～40循環(huán))。制作標準曲線，作為陽性對照反應的模板。用倍比稀釋的TSR進行實時定量PCR檢測，繪制標準曲線。根據標準曲線計算待測樣品中由端粒酶催化合成的端粒重復序列的拷貝數，由此推算出端粒酶的活性。

1.5 常規(guī)方法制作病理切片

改良的Rutenberg法進行γ-GT陽性灶的組織化學染色；SABC-FITC免疫熒光方法測定大鼠肝臟組織中AFP的表達；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法檢測大鼠肝臟組織中NF-ΚB p65的基因蛋白表達；western blot方法檢測IΚB的蛋白表達。

1.6 統(tǒng)計學方法

數值以mean±s表示，應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，采用F檢驗和χ2檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 病理變化

正常對照組，大鼠肝臟表面光滑，呈紅褐色，質軟，邊緣銳利；模型對照組大鼠肝臟顏色淺淡，表面粗糙，出現(xiàn)散在的灰白色小結節(jié)，直徑在1毫米左右，有的達2毫米，結節(jié)邊緣界限清；治療組較模型組相比肝臟表面點狀結節(jié)明顯減少，僅見少量散在小結節(jié)，肝臟顏色、質地、體積接近正常。鏡下可見正常對照組肝小葉結構清晰完整，肝細胞呈多邊形，肝細胞板以中央靜脈為中心呈放射狀排列(圖1-1A)；模型組肝細胞變性壞死明顯，已出現(xiàn)較為明顯的細胞增生灶，即嗜酸細胞灶、嗜堿細胞灶和透明細胞灶三種。這些病灶內肝細胞變大，有胞漿染色的改變、核亦稍大，有明顯核仁，亦可見到呈核濃縮或溶解的細胞混雜其中，并可見嗜酸小體形成。增生灶細胞密集成團，對附近肝細胞并不產生壓迫現(xiàn)象，但細胞喪失正常肝索結構，血竇不明顯。(圖1-1B)；槲芪散治療大、小劑量組和槲寄生總堿組肝細胞表現(xiàn)為部分細胞的脂肪變性、毛玻璃樣變性，與模型組相比病灶數量明顯減少和病變程度上有所減輕(圖1-1C、1D、1E)。

2.2 γ-GT顯示肝癌前病變

在正常組大鼠肝臟切片上肝細胞中幾乎無γ-GT陽性灶出現(xiàn)，只在匯管區(qū)有少量表達(圖2-2A)；模型組肝組織中出現(xiàn)大量散在的γ-GT陽性灶，呈類圓形、棕紅色，部分病灶周圍肝細胞有明顯的壓迫現(xiàn)象(圖2-2B)。各用藥組陽性灶相對于模型組面積減少、主要集中在匯管區(qū)附近(圖2-2C、2D、2E)。圖3顯示了槲芪散及其君藥槲寄生總堿對DEN誘導的大鼠肝臟中γ-GT的影響，結果顯示與模型組相比，HQS大、小劑量治療組以及槲寄生總堿組都顯著地減少了DEN導致的肝臟中γ-GT陽性灶的面積，以大劑量組的作用更顯著。

2.3 AFP表達

正常組肝臟基本無AFP的表達(圖3-A)；模型組中表達明顯增多,主要定位于胞漿，呈綠色熒光(圖3-B)；HQS大、小劑量治療組和槲寄生總堿組中AFP的陽性細胞數明顯減少(圖3-C、D、E)。

2.4 端粒酶測定結果

正常組中基本無端粒酶活性的表達，模型組中端粒酶活性高表達，經治療后端粒酶活性有所下降(圖4)，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.5 NF-κB P65表達

正常肝臟組織中NF-κB P65基本無表達(圖5-A)；模型組中NF-κB P65在胞核和胞漿中表達顯著增強，呈深棕褐色(圖5-B)，以胞核表達為主；而HQS的大小治療組和槲寄生總堿組的大鼠肝臟中NF-κB P65在胞漿和胞核中均有表達，其中在胞核中的表達顯著減弱(圖5-C、D、E)結果顯示NF-κB P65在HQS大小治療組和槲寄生總堿組中的陽性細胞數與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2.6 IκB-α在胞漿中的蛋白表達

正常肝臟組織胞漿蛋白中有IκB-α蛋白的表達；模型組中IκB-α蛋白的表達有所減少，經HQS大小劑量組和槲寄生總堿組治療后IκB-α蛋白有所增加，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖6)。

3 討論

癌前期肝細胞常伴有生化特性的改變和某些胚胎特性的重新獲得，因此可以作為肝細胞發(fā)生癌變的標志物。肝臟組織化學染色AFP、γ-GT陽性酶變灶即為此標志物。是顯示肝細胞增生病變最敏感而可靠的方法。它們在正常成年大鼠肝臟基本無活性，在癌前肝細胞增生灶中及肝癌細胞則活性增高，這是由于變異肝細胞反分化而類似胚胎期酶生成增多，同時刺激其周圍的正常肝細胞使其合成增多。將它們作為癌變標志物有特異性，是實驗性肝癌研究中檢測癌前病變、觀察癌變程度的常用指標。HQS及其君藥槲寄生堿能夠明顯減少肝癌前病變大鼠肝臟中γ-GT陽性灶的面積和AFP陽性細胞數的表達；與模型組比較差異有顯著性(P<0.005)，說明該藥能有效控制癌前病變的增長，對癌變過程的促癌階段有阻斷作用。這對臨床上延長病人的生存時間(生存率)有較重要的意義。

1A：正常組；1B：模型組 (DEN+2-AAF+PH); 1C：HQS大劑量治療 [8 g/(kg·d)]; 1D：HQS小劑量療組 [4 g/(kg·d)]; 1E：槲寄生總堿組 [8 mg/(kg·d)]. HE染色×200，圖1 槲芪散及其君藥槲寄生總堿對DEN誘導的大鼠肝臟改變。標尺=20 μmNote. IA: Normal control; IB: Model group (DEN+2-AAF+ PH)(1B); IC: High-dose HQS-treatment (8 g/kg·bw) group; ID:Low-dose HQS (4 g/kg b.w.) treatment group; IE: HQS and mistletoe alkali treatment group. Fig.1 DEN induced rat liver alterations treated with Huqi San and mistletoe alkali. HE Staning.

2A： 正常組,(標尺=60μm); 2B：模型組 (DEN+2-AAF+PH); 2C：HQS大劑量治療組 [8g/(kg·d)](標尺=50μm); 2D：HQS小劑量治療組 [4 g/(kg·d)]; 2E：槲寄生總堿組 [8 mg/(kg·d)]. ×100圖2 槲芪散及其君藥槲寄生總堿對DEN誘導的大鼠肝臟γ-GT的表達Note. 2A: Normal control; 2B: Model group (DEN+ 2-AAF+PH); 2C: High-dose HQS (8 g/kg. bw.) group; 2D: Low-dose (4 g/kg b.w.) HQS treatment group; 2E: HQS and mistletoe alkali treatment group. group. The red stained areas are the γ-GT-positive foci. For details see text.Fig.2 γ-GT expression in the rat liver tissues treated with HQS and mistletoe alkali

3A：正常組；3B：模型組(DEN+2-AAF+PH)；3C：HQS大劑量治療組[8 g/(kg·d)]；3D：HQS小劑量治療組[4 g/(kg·d)]；3E：槲寄生總堿組[8 mg/(kg·d)]. 如圖中所示AFP陽性表達為綠色熒光，主要定位于細胞漿，細胞核染為藍色?！?00圖3 槲芪散及其君藥槲寄生總堿對DEN誘導的大鼠肝臟中AFP的表達Note. 3A: Normal control; 3B: Model group (DEN+2-AAF+PH); 3C: High-dose HQS (8 g/kg b.w.)group; 3D: Low-dose HQS (4 g/kg b.wtreatment group; 3E: Mistletoe alkali treatment group.Fig.3 The expression of AFP in the DEN-induced rat liver tissues treated with HQS and mistletoe alkali. Green fluorescence indicates positive intracytoplasmic expression of AFP with blue-stained nuclei.

A：正常組；B：模型組(DEN+2-AAF+PH)；C：HQS小劑量治療組[4 g/(kg·d)]；D：HQS大劑量治療組[8 g/(kg·d)]；E：槲寄生總堿組[8 mg/(kg·d)]。結果用均數±標準差表示. *代表與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。圖4 DEN誘導的大鼠肝臟組織中端粒酶活性的表達Note. A: Normal control; B: Model group (DEN+ 2-AAF+PH); C: Low-dose HQS(4 g/kg b.w.) treatment group; D: High-dose HQS (8 g/kg b.w.) group; E: HQS and Mistletoe alkali treatment group. Results are expressed as means±s. *P<0.05, compared with the model group.Fig.4 Effcct of HQS and mistletoe alkali on the expression of telomerase in DEN-induced rat liver tissues

5A：正常組；5B：模型組(DEN+2-AAF+PH)；5C：HQS大劑量治療組 [8 g/(kg·d)]；5D：HQS小劑量治療組[4 g/(kg·d)]；5E：槲寄生總堿組 [8 mg/(kg·d)].圖5 槲芪散及其君藥槲寄生總堿對DEN誘導的大鼠肝臟中NF-κB P65的表達?！?00，(標尺=20μm)Note. 5A: Normal control; 5B: Model group (DEN+2-AAF+PH); 5C: High-dose HQS (8 g/kg b.w.) treatment group; 5D: Low-dose HQS (4 g/kg.bw) treatment group; 5E: Mistletoe alkali treatment group. Fig.5 Expression of NF-κB P65 in the DEN-induced rat liver treated with HQS and mistletoe alkali

A 正常組;B模型組(DEN+2-AAF+PH);C HQS大劑量治療組[8 g/(kg·d)]; D HQS小劑量治療組[4 g/(kg·d)]; E槲寄生總堿組[8 mg/(kg·d)]. 圖6 槲芪散及其君藥槲寄生總堿對DEN誘導的大鼠肝臟組織胞漿蛋白中IκB-α的表達Note. A: Normal control; B: Model group (DEN+2-AAF+PH); C: High-dose HQS (8g/kg.bw) treatment group; D Low-dose HQS (4 g/kg.bw) treatment group; E: Mistletoe alkali treatment group. Fig.6 HQS and mistletoe alkali enhanced the expression of IκB-α in the liver tissue with DEN-induced alterations.

在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，端粒酶的激活可能是細胞永生化的關鍵環(huán)節(jié)，是惡性腫瘤細胞得以無限增殖的必需條件[5]。端粒酶活性定量檢測方法可從只有10 個細胞的標本中檢測出端粒酶的活性，由于檢測所需組織細胞量少，已廣泛用于端粒酶活性的判斷[6]。端粒酶具有逆轉錄酶的活性，是一種核糖核蛋白酶，能以自身攜帶的RNA為模板，不斷合成新的端粒序列添加到染色體末端，維持端粒不縮短，使細胞永生化，獲得無限增殖的能力[7]。端粒酶與引起腫瘤細胞凋亡的相關基因關系密切，它可能是已知的最為廣譜的惡性腫瘤分子標記物[8]。HQS及其君藥槲寄生堿能夠明顯降低肝癌前病變大鼠肝臟中端粒酶的活性；與模型組比較有顯著性差異(P<0.005)，說明該HQS及槲寄生堿能通過影響端粒酶的活性，進而抑制異型變的肝細胞端粒合成，對癌變過程的促癌階段有阻斷作用。

NF-κB作為一種轉錄刺激因子，主要起介導細胞質和細胞核之間的信號轉導的作用[9]。它的主要包括P50和P65二個亞基，通常與其抑制蛋白IκB結合，以非活性形式存在于細胞質中[10]。IκB-α與P65 亞單位結合時使P65的空間構象改變，從而使與靶DNA結合的關鍵氨基酸殘基被隱蔽，這樣就抑制了NF-κB與靶DNA 調節(jié)區(qū)的特異性結合。當細胞受到胞外信號刺激時，通過一個或多個信號轉導途徑，激活一系列激酶，使IκB降解，NF-κB與IκB發(fā)生解離，并迅速從胞質易位到胞核，在胞核內與相關基因上的κB位點發(fā)生特異性結合，調控相關基因表達[11]。由于IκB-α啟動區(qū)中存在κB 結合位點，NF-κB激活后IκB-α表達相應升高, 以防止NF-κB 過度激活[12]。本研究觀察到端粒酶活性與NF-κB P65、IκB-α的蛋白表達在大鼠肝癌前病變中的分布基本相一致，進一步證實了端粒酶和NF-κB P65、IκB-α參與了槲芪散及其君藥槲寄生總堿阻斷肝癌前病變的過程。我們的實驗結果只能說明端粒酶和NF-κB P65、IκB-α參與了肝癌前病變的形成，通過下調端粒酶的活性，抑制相關基因的表達，從而干預肝癌前病變的形成。但是NF-κB P65、IκB-α在調節(jié)端粒酶的活性的過程中以怎樣的順序依次出現(xiàn)，目前尚不是很清楚。

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Regulatory effect of a Chinese medicine prescription Hu Qi Shan on the telomerase activity in hepatic precancerous lesions in rats

MENG Xia1, LIU Shu-hong2, LI Xia2, FENG Ping2, LU Jing1，WANG Xue-jiang2

(1. Department of Experimental Animals, 2. Department of Pathophysiology, Capital Medical University，Beijing 100069)

Objective To explore the possible mechanism of action of telomerase in hepatic precancerous lesions, and the regulatory effect of a Chinese medicine prescription HU Qi Shan (HQS) and its principal drug mistletoe alkali on the telomerase activity in rat liver tissues. Methods Rat model of hepatic precancerous lesions was established by Solt-Farber two-step protocol. The model rats were randomly divided into 5 groups, including the model group, high-dose HQS [8 g/(kg·d)] group, low-dose HQS [4 g/(kg·d)] group, and mistletoe alkali[8 mg/(kg·d)] group. γ-Glutamy-transpeptidase (γ-GT) was analyzed by immunohistochemistry. AFP was detected by immunofluorescence technique.The telomerase activity was detected using a quantitative telomerase detection kit. The expression of NF-κB P65 was detected by immunohistochemistry. The cytoplasmic protein IκB-α was detected by western blotting. Results After treated with HQS and mistletoe alkali, the areas of γ-GT-positive foci and number of AFP-positive cells in the liver tissus were significantly decreased than those of the model group (P<0.05 for both), the telomerase activity was decreased, the number of NF-κB P65-positive cells was also decreased (P<0.05), whereas the intracytoplasmic expression of IκB-α proteins was significantly increased (P<0.05). Conclusions HQS and mistletoe alkali can suppress the telomerase activity. Its possible mechanism may be through inhibition of the over-expressed apoptosis-related genes such as NF-κB P65 and increase the expression of IκB-α decreasing the telomerase activity.

HQS; Telomerase; Hepatocarcinogenesis; NF-kB; IκB-α; Rat

國家自然科學基金資助項目(81272757)；北京市屬高等學校創(chuàng)新團隊建設與教師職業(yè)發(fā)展計劃項目( IDHT20150502)。

孟霞(1973-)，研究方向：動物實驗及實驗動物管理，E-mail：mengxia@ccmu.edu.cn。

盧靜(1969-)，女，副教授，研究方向：實驗動物模型研究，E-mail: lujing@ccmu.edu.cn；王學江(1957-)，女,教授。研究方向：肝臟腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制研究，E-mail: xjwang@ccmu.edu.cn。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0036-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.10.008

2016-06-20