閔凡貴，郭 羽，羅 挺，潘金春，劉助紅，黃樹(shù)武，張 鈺

(1. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510663；2. 北京天壇生物制品股份有限公司，北京 100176)

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基于牛分枝桿菌PPD的獼猴全血IFN-γ釋放試驗(yàn)觀察

閔凡貴1，郭 羽2，羅 挺1，潘金春1，劉助紅1，黃樹(shù)武1，張 鈺1

(1. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510663；2. 北京天壇生物制品股份有限公司，北京 100176)

目的 分析全血IFN-γ釋放試驗(yàn)在獼猴分枝桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。方法 首先測(cè)定結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)陽(yáng)性、陰性獼猴血清樣本的基礎(chǔ)IFN-γ含量。然后以PBS為對(duì)照，200 IU bovine-PPD為刺激抗原，分別與TST陰性和陽(yáng)性獼猴肝素抗凝血共培養(yǎng)約24 h，收集血漿，測(cè)定IFN-γ含量。通過(guò)分析抗原刺激前后血漿IFN-γ含量變化和刺激指數(shù)探討全血IFN-γ釋放試驗(yàn)的診斷效能。結(jié)果 TST陽(yáng)性獼猴血清基礎(chǔ)IFN-γ含量明顯高于TST陰性獼猴，但離散度都較大。PPD刺激前后，TST陰性獼猴血漿IFN-γ含量無(wú)明顯變化，而TST陽(yáng)性獼猴血漿IFN-γ含量明顯升高(P<0.01)。刺激指數(shù)結(jié)果顯示，TST陽(yáng)性獼猴明顯高于TST陰性猴(P<0.01)。ROC曲線分析表明，血漿IFN-γ含量和刺激指數(shù)均可作為全血IFN-γ釋放試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)論 本研究基于小樣本量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，全血IFN-γ釋放試驗(yàn)是獼猴分枝桿菌快速診斷的有益補(bǔ)充方法。

獼猴，全血IFN-γ釋放試驗(yàn)，PPD，分枝桿菌

獼猴是目前用量最大的實(shí)驗(yàn)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，已實(shí)現(xiàn)了人工規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)繁育。然而，獼猴的生產(chǎn)繁育卻長(zhǎng)期遭受到多種病原的威脅，其中，分枝桿菌病對(duì)獼猴飼養(yǎng)的影響巨大，以結(jié)核分枝桿菌病最為嚴(yán)重，由于其病原具有強(qiáng)烈的人獸共患性，并且群內(nèi)傳播和種間傳播速度快，傳播途徑多樣，控制其傳播顯得尤為重要，而早期篩查與及時(shí)隔離感染猴為當(dāng)前最有效的控制手段[1]。

目前，實(shí)驗(yàn)猴結(jié)核診斷的金標(biāo)方法是結(jié)核菌素試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)，其次是病原學(xué)診斷，病理學(xué)(活體病理學(xué))診斷應(yīng)用相對(duì)較少。血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷方法也被用于獼猴結(jié)核診斷中，但多數(shù)仍處于研究階段[2-4]。鑒于目前常用的診斷方法缺乏足夠的準(zhǔn)確性以及不能實(shí)現(xiàn)快速診斷，本研究將探討全血IFN-γ釋放試驗(yàn)的可行性。全血IFN-γ釋放試驗(yàn)是基于外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)對(duì)分支桿菌抗原刺激的記憶功能而實(shí)現(xiàn)的，體外抗原刺激活化的PBMC可誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，通過(guò)測(cè)定血漿IFN-γ的增量來(lái)初步判斷機(jī)體是否感染病原。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，全血IFN-γ釋放試驗(yàn)被證實(shí)具有快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，降低了成本要求，成為較好的輔助診斷方法。如能將該技術(shù)充分用于實(shí)驗(yàn)猴的檢測(cè)中，則有望大大提高結(jié)核病的診斷效能。

1 材料和方法

1.1 血清

近年來(lái)，在日常檢疫和監(jiān)督檢測(cè)中收集到TST陽(yáng)性獼猴血清30份，TST陰性獼猴血清70份。上述血清用于測(cè)定基礎(chǔ) IFN-γ含量。

1.2 抗凝血

廣東某獼猴飼養(yǎng)場(chǎng)曾多次檢出TST陽(yáng)性病例，本研究收集到14例陽(yáng)性獼猴肝素抗凝血，參照此前建立的方法進(jìn)一步測(cè)定了PPD抗體[5-6]，結(jié)果全部為陽(yáng)性(A450值為1.62±0.70，cutoff值為0.217)。 在其他獼猴飼養(yǎng)場(chǎng)采集TST陰性且PPD抗體陰性獼猴的肝素抗凝血37頭份。上述抗凝血用于全血IFN-γ釋放試驗(yàn)。

1.3 抗原

Bovituber-PPD，2 mL/瓶，源于Synbiotics Corp.，批號(hào)： Lot 142574。

1.4 全血PPD刺激培養(yǎng)

取24 h內(nèi)的抗凝血2 mL，分別加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，1 mL/孔，每個(gè)樣本2孔，然后依次加入0.1 mL PBS和0.1 mL PPD(200 IU)，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，約24 h，收集血漿300 μL以上，-20℃保存。

1.5 血漿IFN-γ含量測(cè)定

通過(guò)流式細(xì)胞儀，采用luminex?液相芯片技術(shù)測(cè)定血漿中 IFN-γ含量，檢測(cè)試劑盒源于默克密理博(Merck Millipore)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

測(cè)得的數(shù)據(jù)用Excel和SAS 8.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析方法包括隨機(jī)、成對(duì)Student′sttest和ROC曲線分析等。

2 結(jié)果

2.1 血清基礎(chǔ)IFN-γ含量

分別測(cè)定TST陰性和陽(yáng)性獼猴血清樣本的IFN-γ含量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，分別為： 3.08±5.67 pg/mL(n=70，CV=184%)和31.88±85.46 pg/mL(n=30，CV=268%)。與TST陰性獼猴比較，TST陽(yáng)性獼猴血清IFN-γ水平顯著升高(unpairedt-test，P<0.01)。

圖1 TST陽(yáng)性和陰性實(shí)驗(yàn)猴血清IFN-γ含量Fig.1 Basic serum IFN-γ concentrations of TST-positive and -negative macaques

2.2 體外抗原刺激全血誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生情況

圖2 PPD刺激前后血漿IFN-γ含量變化Fig.2 Changes in plasma IFN-γ pre- and post-stimulation by PPD

圖3 PPD全血IFN-γ釋放試驗(yàn)的刺激指數(shù)Fig.3 Stimulation indexes of PPD-based whole blood IFN-γ assay

以等體積PBS為陰性對(duì)照，分析PPD體外刺激全血誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)于TST陰性獼猴，PPD刺激全血不會(huì)誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IFN-γ，血漿IFN-γ含量不會(huì)顯著升高(pairedt-test，P>0.05)；而對(duì)于TST陽(yáng)性獼猴，PPD能顯著刺激PBMC產(chǎn)生IFN-γ，血漿IFN-γ含量顯著升高(pairedt-test，P<0.01)。

圖4 ROC曲線分析Fig.4 Results of ROC curves analysis

2.3 刺激指數(shù)

鑒于TST陰性獼猴基礎(chǔ)血清IFN-γ含量分布離散度較大，通過(guò)分析抗原刺激后的絕對(duì)IFN-γ含量來(lái)判定感染狀態(tài)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。本研究進(jìn)一步探討了全血IFN-γ釋放試驗(yàn)的刺激指數(shù)(stimulation index，SI)，即抗原刺激后和刺激前(PBS對(duì)照)血漿IFN-γ含量的比值。對(duì)TST陰性和陽(yáng)性獼猴SI進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，TST陽(yáng)性獼猴SI明顯高于TST陰性獼猴(unpairedt-test，P<0.01)。

2.4 ROC曲線分析

對(duì)TST陰性和陽(yáng)性獼猴PPD刺激后血漿IFN-γ含量做ROC曲線分析，以陽(yáng)性似然比最大時(shí)對(duì)應(yīng)的IFN-γ含量為cutoff值，結(jié)果顯示，最佳cutoff值為10.19 pg/mL，敏感性為100%，特異性為97.3%，ROC曲線下面積為0.9981(圖4, A)。同樣，對(duì)TST陰性和陽(yáng)性獼猴的刺激指數(shù)做ROC曲線分析，顯示最佳cutoff值為2.230，敏感性為100%，特異性為97.3%，ROC曲線下面積為1.0(圖4, B)。以上述兩種cutoff值判定，本研究選擇的TST陽(yáng)性獼猴均為分支桿菌感染。

3 討論

IFN-γ體外釋放試驗(yàn)包括全血IFN-γ釋放試驗(yàn)和ELISPOT，與TST相比，具有敏感性和特異性高，不受TST操作上的主觀因素的影響，結(jié)果更為客觀可靠，檢測(cè)快速，并且單次TST對(duì)IFN-γ檢測(cè)對(duì)結(jié)果影響不大等優(yōu)點(diǎn)，且該方法只需接觸動(dòng)物一次，有效減少了對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激，具有很大的優(yōu)越性；因此，IFN-γ體外釋放實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是TST理想的補(bǔ)充方法[7]。全血IFN-γ釋放試驗(yàn)相比ELISPOT，進(jìn)一步優(yōu)化了試驗(yàn)程序，不需要分離PBMC，并且降低了對(duì)儀器和試劑的需求。

在結(jié)核病人全血IFN-γ檢測(cè)方面已有商品化試劑盒(QuantiFERON-TB Gold)，并得到了美國(guó)FDA和歐盟CE Mark的雙重認(rèn)可；在牛方面，澳大利亞于1989年率先推出商品化檢測(cè)試劑盒(BovigamTM)，此后被澳大利亞政府確認(rèn)為根除牛結(jié)核計(jì)劃的普檢方法。盡管全血IFN-γ釋放試驗(yàn)在人和牛結(jié)核檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，但是，其敏感性和特異性穩(wěn)定性差，相關(guān)Meta分析的合并敏感性(低于80%)和特異性(低于75%)僅為中等水平[8-10]，尚不能替代TST成為結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可以成為T(mén)ST的有益補(bǔ)充。全血IFN-γ釋放試驗(yàn)在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物結(jié)核診斷方面應(yīng)用不多，主要原因在于試劑盒用量小，而且非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物IFN-γ與人和牛IFN-γ不同，具有種屬特異性，導(dǎo)致試劑盒成本增高。國(guó)外現(xiàn)有的少量研究和病例報(bào)道顯示，全血IFN-γ釋放試驗(yàn)在診斷非人靈長(zhǎng)類分枝桿菌感染方面具有較高的效能[11-13]；目前，國(guó)內(nèi)僅有的1項(xiàng)初步應(yīng)用報(bào)道只顯示出中等的敏感性[14]。由此可見(jiàn)，全血IFN-γ釋放試驗(yàn)在獼猴中的應(yīng)用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。我國(guó)是獼猴生產(chǎn)繁育大國(guó)，開(kāi)展這方面研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究首先分析了獼猴的血清基礎(chǔ)IFN-γ水平，盡管TST陽(yáng)性獼猴血清基礎(chǔ)IFN-γ水平升高，但是離散度大，不足以成為診斷分枝桿菌感染的依據(jù)。然后，分析了PPD體外刺激對(duì)獼猴PBMC誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的情況，結(jié)果表明，PPD刺激TST陰性獼猴不會(huì)誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IFN-γ，血漿IFN-γ含量刺激前后無(wú)顯著性變化；PPD刺激則可以誘導(dǎo)TST陽(yáng)性獼猴PBMC產(chǎn)生大量的IFN-γ，導(dǎo)致血漿IFN-γ含量顯著高于刺激前的測(cè)定值。進(jìn)一步分析顯示，PPD刺激后的IFN-γ絕對(duì)含量和SI均可作為判定分枝桿菌感染的依據(jù)，其中SI的準(zhǔn)確性稍高(ROC曲線下面積比較)。本研究結(jié)果初步證實(shí)，全血IFN-γ釋放試驗(yàn)是適于獼猴分枝桿菌感染診斷的有效補(bǔ)充手段，可以彌補(bǔ)TST的不足。

在刺激抗原用量方面，國(guó)外文獻(xiàn)多數(shù)未提供PPD濃度，國(guó)內(nèi)報(bào)道的PPD終濃度基本不超過(guò)20 μg/mL[15-16]。影響全血IFN-γ釋放試驗(yàn)的因素很多，除了動(dòng)物個(gè)體差異外，還包括PPD來(lái)源、用量、批次和生產(chǎn)廠家等[16]。本研究選擇了Synbiotics Corp.生產(chǎn)的牛分枝桿菌PPD，純度很高，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示200 IU/孔和400 IU/孔無(wú)顯著性差異，故選擇200 IU/孔開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，相比國(guó)產(chǎn)PPD用量偏低。

本研究基于小樣本量取得了較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但仍處于初級(jí)研究階段，尚需要大量臨床樣本來(lái)驗(yàn)證該方法的敏感性與特異性，尤其是TST檢測(cè)假陰性樣本的驗(yàn)證。

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Performance of bovine-PPD based whole blood IFN-γ assay for rhesus macaques

MIN Fan-gui1, GUO Yu2, LUO Ting1, PAN Jin-chun1, LIU Zhu-hong1, HUANG Shu-wu1, ZHANG Yu1

(1. Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663, China； 2. Beijing Tiantan Biological Product Co. Ltd., Beijing 100176)

Objective To assess the potential of whole blood IFN-γ assay for diagnosing mycobacterium in rhesus macaques. Methods Firstly, basic serum IFN-γ concentrations of TST-negative and -positive rhesus macaques were detected. Then, heparinized whole blood from TST-negative and -positive rhesus macaques was incubated with PBS and 200 IU bovine-PPD (tuberculin purified protein derivative) for about 24 h, respectively. The supernatant plasma were harvested and used to determine the concentrations of IFN-γ. The results of plasma IFN-γ concentrations and stimulation index (SI) were used to analyze the diagnostic potential of the whole blood IFN-γ assay. Results The basic serum concentrations of IFN-γ for the TST-positive monkeys were significantly higher than that of the TST-negative macaques, showing a high coefficient of variation. There was no significant effect on the production of IFN-γ in the TST-negative macaques. While significantly elevation of IFN-γ concentrations was found in stimulated plasma of TST-positive macaques (P<0.01). The SI of TST-positive macaques was significantly higher than the TST-negative ones. ROC curve analysis revealed that IFN-γ concentrations and SI could be used as evaluation index of whole blood IFN-γ assay. Conclusions Based on a small sample experiment we have demonstrated that whole blood IFN-γ assay may be one possible auxiliary diagnostic method for tuberculin skin test.

Rhesus macaques；Whole blood IFN-γ assay；Tuberculin purified protein derivative, PPD；Mycobacterium; Diagnosis

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020307005；2015A030302029;2016A030303023)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2013BAK11B01)。

閔凡貴(1980 - )，男，副研究員，碩士，研究方向： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)研究。

張鈺(1970 - )，女，研究員，E-mail: zhangyugzh@hotmail.com。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0005-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.10.002

2016-03-19