徐艷峰，鄧 巍，于 品，朱 華，黃 瀾，徐玉環(huán)，韓云林，喬紅偉，秦 川

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京 100021)

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研究報告

脊髓灰質(zhì)炎疫苗腦內(nèi)法猴體神經(jīng)毒力試驗病理學評價方法的探討

徐艷峰，鄧 巍，于 品，朱 華，黃 瀾，徐玉環(huán)，韓云林，喬紅偉，秦 川

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京 100021)

目的 探討脊髓灰質(zhì)炎疫苗腦內(nèi)法猴體神經(jīng)毒力試驗病理評價方法。方法 采用恒河猴雙側(cè)丘腦內(nèi)注射給藥，觀察21 d后進行解剖，完整取出腦和脊髓，經(jīng)修切后脫水包埋，切片經(jīng)HE染色和沒食子藍染色后在光鏡下觀察，對神經(jīng)組織病變進行評分，根據(jù)分值對病變嚴重程度進行判定。本研究涉及12批實驗中的240動物。結(jié)果 本方法對左右大腦包括針跡在內(nèi)的不同部位、中腦、小腦、腦橋、延髓、頸膨大、腰膨大進行取材，參照脊髓法神經(jīng)毒力試驗病理學評價的半切面評分方法，對雙側(cè)腦干、頸髓和腰髓的病變進行評價并計分，根據(jù)平均分值并結(jié)合具體病變情況分別判定此3個部位的病變程度。本研究中特異性的神經(jīng)系統(tǒng)病變的發(fā)生率15%。各型疫苗病變發(fā)生率相似，輕微病變出現(xiàn)的比例最高。較嚴重的病變主要見于Ⅲ型疫苗。結(jié)論 在腦內(nèi)法神經(jīng)毒力試驗中，用半切面評分方法對病變進行評分，較客觀地反映了神經(jīng)系統(tǒng)病變的情況，方法簡便易行，實用性較強，利于判斷標準的統(tǒng)一，可作為脊髓灰質(zhì)炎疫苗腦內(nèi)法神經(jīng)毒力試驗病理學評價方法的參考。

腦內(nèi)法神經(jīng)毒力試驗； 脊髓灰質(zhì)炎疫苗；病理學評價

脊髓灰質(zhì)炎是一種急性傳染病，傳播廣泛，病原為脊髓灰質(zhì)炎病毒。此病毒常侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，損害脊髓前角運動神經(jīng)細胞，導致肢體松弛性麻痹，多見于兒童，故又名小兒麻痹癥。多數(shù)人感染后為輕癥，少數(shù)重癥患者可發(fā)生癱瘓，甚至因呼吸、循環(huán)衰竭而死亡。目前隨著疫苗的廣泛接種，人類在根除脊髓灰質(zhì)炎方面已經(jīng)取得很大進展，大多數(shù)國家已消除這種疾病。但最近報道此疾病在敘利亞、烏克蘭、以色列等國家重新流行[1]，在我國也有死灰復燃的現(xiàn)象。目前包括我國在內(nèi)的140多個國家仍以口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗作為主要預防措施，因疫苗可能會在某些情況下恢復神經(jīng)毒性而引起脊髓灰質(zhì)炎病變，對其安全性進行恰當評價是非常重要的工作。

根據(jù)《中華人民共和國藥典( 三部)》(2010年版) 及 WHO 的相關(guān)規(guī)定，目前脊髓灰質(zhì)炎疫苗的神經(jīng)毒性評價需通過猴體神經(jīng)毒力試驗進行，主要有兩種方法： 脊髓法和腦內(nèi)法。脊髓法需要將供試品組的病變與同型參考品的病變進行比較；腦內(nèi)法不需與參考品的病變進行比較，但對手術(shù)操作要求較高，結(jié)果判定中單只猴病變的影響較大。兩種方法對于疫苗安全性評價的敏感性基本是一致的[2]，也有報道認為腦內(nèi)法比脊髓法更敏感[3]。目前根據(jù)藥典規(guī)定的方法，腦內(nèi)法只需要總體判定每只動物的病變程度，而未詳細規(guī)定具體的判定標準，因此在不同的機構(gòu)和人員之間易造成偏差。此試驗借鑒脊髓法中的半切面計分法，對腦內(nèi)法的腦干、頸髓及腰髓等部位的病變進行評分，并根據(jù)此三個部位的各自的平均分值對單只動物的病變程度進行判定，旨在提高病變判斷的準確性和一致性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級健康恒河猴，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所北方資源中心【SCXK(京)2014-0011】。年齡1～3周歲，體重1.7 kg～4.5 kg。猴血清經(jīng)1∶4稀釋后證明不含同型別病毒中和抗體，猴血清用間接免疫熒光(DIA)抗體檢查法檢查排除潛在的猴B病毒(BV)和無泡沫病毒病(SFV)。猴結(jié)核菌素試驗為陰性。動物實驗在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物新藥安全研究評價中心進行【SYXK ( 京 ) 2010-0030】。本文所涉及的動物數(shù)量為12批實驗中的240只動物。

1.2 實驗儀器及試劑

Stoelting 51600型腦立體定位儀(美國Stoelting公司)，Leica ASP300全自動組織脫水機，IVS-410推拉式切片機(日本櫻花)，ST5010自動染色機(德國徠卡)，EG1150H+C石蠟包埋機(德國徠卡)，BX51光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。蘇木素及伊紅染色液購自北京利精細化學品有限公司，沒食子藍染料購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 動物實驗

使用腦立體定位儀將微量注射器針頭插入丘腦，在兩側(cè)丘腦分別注入0.5 mL脊髓灰質(zhì)炎疫苗樣品，原倍濃度及10-1濃度各10只。注射后48 h內(nèi)死亡或出現(xiàn)非特異性麻痹癥狀者剔除不計，中途死亡及到期處死動物，做中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理組織學檢查。

1.4 動物解剖及取材

動物在給藥21 d后，進行安樂死并解剖。完整取出腦組織及脊髓，10%甲醛溶液充分固定后，進行取材。取材時首先尋找腦頂葉區(qū)注射點，在注射點前后各取一個切面，以確保取材部位包含針跡。取材部位包括： 額葉、頂葉、注射點、顳葉、枕葉、海馬、基底節(jié)、丘腦(以上部位左右大腦雙側(cè)取材)、中腦、小腦、腦橋、延髓、頸膨大、腰膨大。

1.5 切片制作及觀察

組織塊經(jīng)梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度8 μm～15 μm，進行HE染色及沒食子藍染色，光鏡下檢查。

2 結(jié)果

2.1 病變發(fā)生情況及評價

注： A.輕微病變；B.輕度病變；C.中度病變；D.重度病變圖1 脊髓病變，HE染色Fig.1 Histopathological lesions of the spinal cord. A. Minimal lesion；B. Mild lesion；C. Moderately severe lesion；D. Severe lesion.HE staining.

在12批實驗240只動物中，36只動物出現(xiàn)特異性的神經(jīng)系統(tǒng)病變，發(fā)生率15%。大部分動物病變輕微，僅表現(xiàn)為膠質(zhì)細胞增生、炎細胞浸潤，未見神經(jīng)元損傷，且病變多局限于腦干。小部分表現(xiàn)為不同程度運動神經(jīng)元的損傷，病變部位主要位于腦干(中腦、腦橋、延髓)、頸膨大、腰膨大。出現(xiàn)神經(jīng)元變性、壞死、噬神經(jīng)細胞現(xiàn)象和衛(wèi)星現(xiàn)象，伴有輕重不一的炎性反應如散在的炎細胞浸潤、血管周圍炎細胞袖套狀浸潤、膠質(zhì)細胞增生。腦干及脊髓左右兩側(cè)的病變可有較大差別。病變嚴重的病例在大腦頂葉、丘腦注射針跡周圍也出現(xiàn)血管袖套及少數(shù)神經(jīng)元變性壞死，但病變程度較腦干、頸髓及腰髓等部位為輕，海馬、基底節(jié)區(qū)域因距丘腦針跡較近，亦偶有累及，病變均較輕。額葉、枕葉、顳葉未見特異性病變。參照《中華人民共和國藥典( 三部)》(2010 年版)中脊髓病變的半切面計分法，對病變進行分級和評分。評分標準如下： 0分，未見病變；1分，輕微病變，僅有炎細胞浸潤，未見神經(jīng)元損害；2分，輕度病變，炎細胞浸潤伴有少量的神經(jīng)元損害；3分，中度病變，炎細胞浸潤伴有廣泛的神經(jīng)元損害；4分，重度病變，大量的神經(jīng)元損害，伴或不伴有炎細胞浸潤(圖1,2)。對腦組織的針跡附近病變進行評價時，只對高倍鏡下(40×)距離針跡反應兩個視野范圍以外的病變進行評分，距針跡反應兩個高倍視野范圍內(nèi)的病變計為“0”分。分值計算方法： 腦干(中腦、腦橋、延髓)、頸膨大和腰膨大各個切面左右兩側(cè)分別計分；腦干、頸膨大和腰膨大三個部位分別取各切面雙側(cè)的病變平均值作為這三個部位的病變分值。

部分動物出現(xiàn)腦膜及脊髓膜血管周圍少量炎細胞浸潤，此類病變均較輕，且局限于腦膜和脊髓膜的部分血管周圍，未累及實質(zhì)區(qū)，其是否出現(xiàn)及出現(xiàn)的范圍、嚴重程度與腦和脊髓出現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病變的情況無關(guān)，未對此種病變計分。部分動物出現(xiàn)注射部位附近腦膜出血，亦未計分。

注： A.輕微病變；B.輕度病變；C.中度病變；D.重度病變圖2 脊髓病變，沒食子藍染色Fig.2 Histopathological lesions of the spinal cord. A. Minimal lesion；B. Mild lesion；C. Moderately severe lesion；D. Severe lesion. Gallocyanin staining.

2.2 動物病變程度的判斷

每只動物總的病變程度判斷主要依據(jù)腦干、頸髓及腰髓各自的平均分值，以其中較高的分值，結(jié)合每個切面較重病變的出現(xiàn)情況，作為病變嚴重程度的指標[4]。本研究發(fā)現(xiàn)各型疫苗病變發(fā)生率相似，輕微病變出現(xiàn)的比例最高。較嚴重的病變主要見于Ⅲ型疫苗。病變發(fā)生率和嚴重程度與給予病毒的滴度無關(guān)，有些病毒株在以10-1倍濃度注射時出現(xiàn)病變，而以原倍濃度注射時則未見病變，此結(jié)果與文獻報道一致[5]。

3 討論

目前世界衛(wèi)生組織雖制定計劃用滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗取代口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗，但因受到多種因素的限制只能逐步進行實施[6]?？诜顾杌屹|(zhì)炎疫苗為減毒活疫苗，病毒可在特定環(huán)境下發(fā)生突變，恢復神經(jīng)毒性，引起脊髓灰質(zhì)炎疫苗相關(guān)病例(vaccine-associated paralytic poliomyelitis，VAPP)，并可能在人群中擴散，成為脊髓灰質(zhì)炎傳播的重要危險因素，世界范圍內(nèi)每年有超過200例VAPP，因此對于脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗需進行猴體神經(jīng)毒力試驗檢測其神經(jīng)毒性。目前脊髓灰質(zhì)炎疫苗猴體神經(jīng)毒力實驗可采用脊髓法和腦內(nèi)法兩種方法。脊髓法是把待檢疫苗和參考品直接注射于脊髓，比較待檢疫苗和參考品神經(jīng)系統(tǒng)損傷的差異而判斷疫苗減毒的情況，而腦內(nèi)法將疫苗注射于丘腦，通過觀察神經(jīng)系統(tǒng)的病變，特別腦干及脊髓的運動神經(jīng)元損傷情況，判斷疫苗的神經(jīng)毒性。

藥典中對于脊髓法病理評價方法的規(guī)定較為明確，對于腦內(nèi)法只規(guī)定了神經(jīng)毒力試驗中疫苗是否合格的判斷標準，但對于取材的部位和具體的病變程度的判定并未做詳細規(guī)定，因此不同人員在操作中可能出現(xiàn)診斷標準的差異。本文探討了將脊髓法中的半切面評分法用于腦內(nèi)法病理改變的評價方法，分別對腦組織、脊髓頸膨大和腰膨大的半切面病變進行評分，并對這三個部位的平均病變分值進行計算，根據(jù)分值并參考具體情況進行病變程度的判定。在本試驗中，發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)法出現(xiàn)較明顯中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的動物其病變部位主要位于腦干、頸膨大和腰膨大，而其他部位如丘腦雖可出現(xiàn)病變，但病變程度與腦干及脊髓相比較輕微，可能是由于缺乏對脊髓灰質(zhì)炎病毒敏感的運動神經(jīng)核團所致[5]。因此，在判定動物病變程度的時候，建議腦部的病變程度主要考慮中腦、腦橋和延髓的平均病變。頸髓和胸髓出現(xiàn)病變時，提示病毒已遠途擴散至此部位，因此建議將腦干、頸髓和腰髓的三個部位病變中的最大值作為判斷動物病變嚴重程度的標準。

在對腦干、頸膨大及腰膨大三個部位的多個半切面進行平均值計算時，因不同切面病變程度差異較大，可能會掩蓋個別較重的病變區(qū)，而此區(qū)出現(xiàn)的病變因有神經(jīng)元的損傷已可能引起脊髓灰質(zhì)炎的癥狀。因此對于這三個部位的病變程度的判斷，除主要參考平均分值外，需慎重考慮個別切面較大的值。

本研究發(fā)現(xiàn)各型疫苗出現(xiàn)病變的總比例相似。輕微病變出現(xiàn)比例最高，病變位置多在腦干，很少向脊髓擴散。中度及以上病變主要見于Ⅲ型疫苗，病變在腦干、頸髓和腰髓均較明顯，與此前報道的結(jié)果一致[7]。少數(shù)動物出現(xiàn)注射部位附近腦膜出血，考慮與手術(shù)操作引起的損傷有關(guān)。部分動物出現(xiàn)腦膜及脊髓膜血管周圍少量炎細胞浸潤等病變，考慮為疫苗引起的固有反應，并非疫苗的神經(jīng)毒性所致[8]。

本文探討了腦內(nèi)法脊髓灰質(zhì)炎疫苗的猴體神經(jīng)毒力試驗中，對神經(jīng)系統(tǒng)病變進行評分并判定病變程度的方法，操作簡便易行，實用性較強，有利于統(tǒng)一病理學評價標準，提高診斷的一致性，可作為脊髓灰質(zhì)炎疫苗腦內(nèi)法神經(jīng)毒力試驗病理學評價方法的參考。

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Pathological evaluation of the intrathalamic neurovirulence test of poliomyelitis vaccine in monkeys

XU Yan-feng, DENG Wei, YU Pin, ZHU Hua, HUANG Lan, XU Yu-huan, HAN Yun-lin, QIAO Hong-wei, QIN Chuan

(Institute of Laboratory Animal Sciences, Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health, Key Laboratory of Human Disease Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing Key Laboratory for Animal Models of Emerging and Reemerging Infectious Diseases, Beijing 100021, China)

Objective To investigate the pathological evaluation method of intrathalamic neurovirulence test of poliomyelitis vaccine in monkeys. Methods Two hundred and forty healthy rhesus monkeys age 1-3 years, body weight 1.7-4.5 kg, in 12 lots, were used in this study. The monkeys were injected with poliomyelitis vaccine into bilateral thalamus. The animals were sacrificed after observation for 21 days and specimens of the brain and spinal cord were collected. After dehydration, embedding and sectioning, HE and gallocyanin staining were used for pathological observation. The pathological changes were scored, and the severity of the pathological changes were determined by scoring. Results The sections were taken from bilateral cerebellum (needle tracts included), midbrain, pons, medulla oblongata, cervical enlargement and the lumbar enlargement. The pathological changes were evaluated referring to the hemisection scoring method of intraspinal neurovirulence test. Lesions on both sides of the brain stem, cervical enlargement and lumbar enlargement were scored, and the severity of the lesions at these three regions were determined according to the average score. The total incidence rate of specific neuronal pathological changes was 15%. The incidence rates of lesions caused by different types of vaccines were similar. Most of the lesions were minimal, and severe lesions were seen mainly in the type III vaccine tests. Conclusions In intrathalamic neurovirulence test, scoring of the lesions of nervous system by hemisections can objectively reflect the pathological changes in the nervous system. This method is simple and easy to apply, practical, and can facilitate the unification of diagnostic criteria. We would recommend this method to be used in pathological evaluation in intrathalamic neurovirulence test of poliomyelitis vaccine.

Intrathalamic neurovirulence test; Poliomyelitis vaccine; Pathological evaluation; Rhesus monkeys

衛(wèi)計委行業(yè)基金(201302006)；國際科技專項項目(2015DFG32230)。

徐艷峰( 1972-)，女，助理研究員，研究方向： 毒性病理學。E-mail: xuyanf2009@163.com。

秦川(1959-)，女，教授，博士生導師，研究方向: 病理與病理生理學。E-mail: chuanqin@vip.sina.com。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0001-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.10.001

2016-04-10