楊春寧，孫志蓉 ，曲繼旭，劉曉欣，劉文蘭，朱南南，程麗麗

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

?

中 藥 研 究

有機(jī)酸對(duì)甘草呼吸代謝及甘草酸積累的影響

楊春寧，孫志蓉*，曲繼旭，劉曉欣，劉文蘭，朱南南，程麗麗

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

目的：研究丙酮酸和琥珀酸兩種有機(jī)酸對(duì)甘草呼吸代謝及甘草酸積累的影響，從生理學(xué)的角度探討呼吸作用與甘草酸積累之間的關(guān)系。方法：采用溶氧法測(cè)定甘草根系呼吸速率；蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖和淀粉的含量；2,4-二硝基苯肼顯色法測(cè)定丙酮酸的含量；Elisa試劑盒法測(cè)定乙酰輔酶A的含量；高效液相色譜法測(cè)定甘草酸的含量。結(jié)果：丙酮酸和琥珀酸對(duì)甘草的呼吸代謝具有促進(jìn)作用，其作用大小為：琥珀酸組>丙酮酸組>對(duì)照組；對(duì)呼吸底物可溶性糖和淀粉的影響為琥珀酸組比丙酮酸組和對(duì)照組具有更高的積累，分別是對(duì)照組的1.02倍和1.04倍，是丙酮酸組的1.15倍和1.04倍；對(duì)中間物質(zhì)丙酮酸含量具有極顯著影響(P<0.01)，但對(duì)乙酰輔酶A的影響差異不顯著(P>0.05)；對(duì)甘草酸含量具有一定影響，丙酮酸組甘草酸含量高于其他兩組，分別為對(duì)照組和琥珀酸組的1.24倍和1.05倍。結(jié)論：有機(jī)酸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)甘草根系呼吸作用強(qiáng)弱來(lái)調(diào)節(jié)甘草酸的合成積累。

甘草；呼吸代謝；丙酮酸；琥珀酸；甘草酸

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是常用大宗中藥材，廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)及飲料、調(diào)味品、香煙、糖果等行業(yè)，因其需求量不斷增加，野生資源日益減少[1]，人工栽培甘草規(guī)模在逐漸擴(kuò)大。但目前多數(shù)人工栽培甘草中甘草酸的含量達(dá)不到《中國(guó)藥典》規(guī)定的大于2%的要求[2]。在人工栽培甘草方面，雖然已經(jīng)完成了甘草由野生到栽培的馴化工作，且人工栽培甘草的技術(shù)和方法也在不斷成熟和完善[3-6]，但目前影響甘草酸積累的相關(guān)機(jī)制尚不明確，甘草酸含量低的問(wèn)題還沒(méi)有得到解決。植物的呼吸代謝是物質(zhì)與能量代謝的重要途徑[7]，為次生物質(zhì)的生成提供重要的中間物質(zhì)和能量。乙酰輔酶A(CoA)是甘草酸合成的初始供體[8],其主要來(lái)源為呼吸作用中的糖酵解途徑。丙酮酸是細(xì)胞中無(wú)氧呼吸與有氧呼吸的重要中間產(chǎn)物，在有氧條件下，丙酮酸轉(zhuǎn)化為CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)，生成有機(jī)酸和NADH，丙酮酸還是呼吸作用的潛在調(diào)節(jié)因子，丙酮酸等α-酮酸能夠刺激交替氧化酶(AOX)活性增強(qiáng)[9]；琥珀酸是植物體內(nèi)進(jìn)行三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，有研究表明琥珀酸能夠影響植物體的呼吸速率[10]。目前有機(jī)酸對(duì)甘草根系呼吸作用及甘草酸積累影響方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)外源丙酮酸、琥珀酸處理，考察有機(jī)酸對(duì)甘草根系呼吸代謝和甘草酸積累的影響，探討甘草呼吸代謝與甘草酸積累的相關(guān)關(guān)系，為提高人工栽培甘草質(zhì)量提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為甘草當(dāng)年播種苗。種子由內(nèi)蒙古伊克昭盟杭錦旗甘草公司提供。采用無(wú)土栽培法，高溫滅菌后，按蛭石：珍珠巖體積比為4:1的比例充分混勻，裝于塑料花盆中，盆高16 cm，盆外口直徑為25 cm，內(nèi)口直徑為21 cm。將盆按照隨機(jī)數(shù)字法分好組后放入北京中醫(yī)藥大學(xué)培養(yǎng)室內(nèi)，澆透水2天后，播種。當(dāng)?shù)厣喜糠珠L(zhǎng)至20 cm左右時(shí)開(kāi)始間苗，每盆留苗20株。待甘草蘆頭直徑長(zhǎng)至1.0 cm左右時(shí)開(kāi)始進(jìn)行有機(jī)酸處理，分別設(shè)置空白對(duì)照組，丙酮酸組和琥珀酸組3個(gè)處理組，丙酮酸組和琥珀酸組分別施以濃度均為8 mmol/L的丙酮酸鈉和琥珀酸溶液(溶液用鹽酸和NaOH溶液調(diào)pH值至7.5左右)，每7天澆1次，每次1800 mL，空白對(duì)照組以等量清水代替。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘草根系總呼吸強(qiáng)度的測(cè)定

分別在實(shí)驗(yàn)處理后的第1 d、3 d、7 d、14 d和28 d時(shí)，人工氣候室內(nèi)光照處理2 h后采集甘草，選擇甘草中上部主根，剪成長(zhǎng)約1 mm左右根段，將其分成三個(gè)不同的對(duì)照組，每組含20個(gè)根段，每組將根段放入Yaxin-1151生物氧測(cè)定儀葉室內(nèi)，用0.2 M的Tris填充整個(gè)葉室后，將氧電極插入葉室中開(kāi)始進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品測(cè)定4～5 min，每組至少5個(gè)平行。上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程在25℃空調(diào)房中進(jìn)行。

1.2.2 甘草呼吸底物和中間物質(zhì)含量的測(cè)量

可溶性糖和淀粉的含量測(cè)定采用蒽酮比色法[11]加以改進(jìn)。丙酮酸含量測(cè)定采用2，4-二硝基苯肼顯色法[12]加以改進(jìn)。乙酰輔酶A選用植物乙酰輔酶A(A-COA)Elisa 試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 甘草酸含量的測(cè)量

采用周香珍[13]的方法加以改進(jìn)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

采用EXCEL 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和圖表繪制。采用SPSS20.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA方差分析，Kruskal-Wallis H(K)非參數(shù)檢驗(yàn)，LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 有機(jī)酸對(duì)甘草總呼吸強(qiáng)度的影響

有機(jī)酸處理后，甘草的根系呼吸產(chǎn)生相應(yīng)的變化，如圖1所示。不同取樣時(shí)間各處理組甘草根系總呼吸差異較明顯，有機(jī)酸溶液處理后第1 d，各組甘草根系總呼吸速率顯著低于其他時(shí)間的測(cè)定值，第3 d時(shí)，各組處理組的呼吸速率明顯增大。處理第3 d、7 d、14 d和28 d測(cè)定的各組甘草根系呼吸值差異不大(P>0.05)。相同取樣時(shí)間各處理組間甘草根系總呼吸強(qiáng)度也不同，除第1 d外，各處理組間根系呼吸速率大小為：琥珀酸組>丙酮酸組>對(duì)照組。第1 d時(shí)，丙酮酸組>琥珀酸組>對(duì)照組。

圖1 丙酮酸、琥珀酸對(duì)甘草根系總呼吸速率的影響

2.2 有機(jī)酸對(duì)甘草呼吸底物、中間物質(zhì)的影響

2.2.1 有機(jī)酸對(duì)甘草呼吸底物的影響

糖類(lèi)通過(guò)呼吸代謝產(chǎn)生各種有機(jī)酸和能量，是根系呼吸的底物。由表1可見(jiàn)，丙酮酸處理組甘草根系的可溶性糖與對(duì)照組相比有所下降，是對(duì)照組的0.89倍；但淀粉含量與對(duì)照的1.08倍；琥珀酸處理組的可溶性糖和淀粉的含量均高于對(duì)照組，分別是是對(duì)照組的1.02倍和1.04倍。琥珀酸組甘草根系的可溶性糖和淀粉的含量分別為丙酮酸組1.15倍和1.04倍。各處理組甘草根系中可溶性糖和淀粉的含量沒(méi)有顯著性差異。

表1 不同處理組甘草呼吸代謝底物的含量及其方差分析±s)

2.2.2 對(duì)呼吸中間產(chǎn)物的影響

丙酮酸可以通過(guò)乙酰輔酶A和三羧酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的相互轉(zhuǎn)化。因此丙酮酸和乙酰輔酶A是參與整個(gè)生物體基本代謝的中間物質(zhì)。丙酮酸和琥珀酸對(duì)甘草中間產(chǎn)物的影響如表2所示，不同處理組中丙酮酸和乙酶輔酶A含量有差異。各組間丙酮酸含量影響極顯著(P<0.01)，丙酮酸組最高，達(dá)到84.65 μg/g，是對(duì)照組甘草的1.12%；琥珀酸組甘草的丙酮酸含量最低，是空白組和丙酮酸組的90.29%和80.87%。各組間乙酰輔酶A含量差異不顯著(P>0.05)，丙酮酸組甘草中乙酶輔酶A含量較低，其含量為0.55 pmol/g，比對(duì)照組低14.54%；琥珀酸組甘草的乙酰輔酶A含量最高，為0.68 pmol/g，比對(duì)照組高0.05 pmol/g。

表2 不同處理組甘草中間產(chǎn)物的含量及其方差分析±s)

2.3 有機(jī)酸對(duì)甘草酸含量的影響

各處理組甘草中甘草酸含量有差異。丙酮酸組甘草酸含量高于其它兩組，分別為對(duì)照組和琥珀酸組的1.24倍和1.05倍。與對(duì)照組相比，琥珀酸組甘草根系中甘草酸含量略低，為0.240%，是對(duì)照組的0.97倍(見(jiàn)表3)。

表3 不同處理組甘草甘草酸含量及其方差分析表±s)

3 結(jié)論

植物在呼吸代謝中能夠產(chǎn)生多種有機(jī)酸，丙酮酸和琥珀酸均是參與三羧酸循環(huán)(TCA)的重要中間物質(zhì)，并對(duì)植物體的呼吸具有很強(qiáng)的刺激作用[10]。施加外源丙酮酸和琥珀酸能夠?qū)Ω什莸母岛粑a(chǎn)生促進(jìn)作用：除第1 d外，琥珀酸組甘草的根系總呼吸最強(qiáng)，其次為丙酮酸組，對(duì)照組的甘草根呼吸值最小，并且琥珀酸的呼吸作用大于丙酮酸，這與TCA在呼吸作用的所占有較大比例[14]具有一致性。丙酮酸和琥珀酸處理影響了甘草根系總呼吸速率，對(duì)比相同取樣時(shí)間(除第1 d外)，各組間差異趨勢(shì)基本一致：琥珀酸組甘草的根系總呼吸最強(qiáng)，其次為丙酮酸組，對(duì)照組的甘草根呼吸值最小。說(shuō)明這兩種有機(jī)酸對(duì)甘草根系總呼吸具有促進(jìn)作用。

丙酮酸和琥珀酸可以影響甘草根系的呼吸底物和中間物質(zhì)含量，對(duì)呼吸底物具體的影響為：可溶性糖含量丙酮酸組最低，琥珀酸組含量最高，分別為對(duì)照組的0.89倍和1.02倍；淀粉含量丙酮酸組和琥珀酸組均高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的1.06倍和1.12倍。說(shuō)明加入丙酮酸可以增加可溶性糖的消耗，加入琥珀酸能夠增加糖類(lèi)的積累。丙酮酸處理顯著提高甘草根系中丙酮酸的含量，使乙酶輔酶A含量降低；琥珀酸處理使甘草根系中丙酮酸的含量減少，乙酶輔酶A含量升高。丙酮酸處理組丙酮酸含量差異極顯著(P<0.01),且其含量最多為84.65 μg/g，但乙酰輔酶A的含量卻最低為0.55 μg/g。

有機(jī)酸對(duì)甘草酸含量的影響丙酮酸組甘草酸含量高于其他兩組，分別為對(duì)照組和琥珀酸組的1.24倍和1.05倍。與對(duì)照組相比，琥珀酸組甘草根系中甘草酸含量略低，是對(duì)照組的0.97倍。在有氧條件下，丙酮酸分別經(jīng)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體和丙酮酸羧化酶作用下催化形成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A與草酰乙酸結(jié)合進(jìn)入三羧酸循環(huán)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與其他兩組相比，丙酮酸處理組三羧酸循環(huán)增強(qiáng)，乙酰輔酶A含量降低，說(shuō)明丙酮酸處理在提高甘草根系中丙酮酸含量的同時(shí)增強(qiáng)了三羧酸循環(huán)，乙酰輔酶A消耗加快導(dǎo)致自身含量降低。同時(shí)，丙酮酸組甘草酸含量比其他組含量高，說(shuō)明乙酶輔酶A作為甘草酸合成的初始供體，由于處在代謝的“分支點(diǎn)”，其含量高低對(duì)甘草酸積累有影響。

綜上所述，有機(jī)酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)甘草的呼吸作用強(qiáng)弱來(lái)調(diào)節(jié)初生物質(zhì)與次生物質(zhì)的代謝。但是有機(jī)酸影響甘草酸積累的機(jī)理目前還不清楚。三羧酸循環(huán)的強(qiáng)弱可以直觀的反映植物的呼吸耗氧，所以我們推測(cè)：有機(jī)酸對(duì)甘草酸積累的影響，很可能是通過(guò)影響甘草根系呼吸代謝中的三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的。因?yàn)槿人嵫h(huán)一方面可以影響中間物質(zhì)的代謝，另一方面可以影響植物的能量代謝。三羧酸循環(huán)是物質(zhì)與能量的代謝中心，是根系呼吸代謝的重要樞紐，特別對(duì)以根和根莖類(lèi)藥材的中藥活性物質(zhì)的合成具有重要作用，期望通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)三羧酸循環(huán)與甘草酸的關(guān)系，為提高人工栽培甘草中甘草酸的含量提供理論依據(jù)。

[1] 劉洋洋,劉春生,曾斌芳,等.甘草種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J].中草藥,2013,44(24):3593-3598.

[2] 魏勝利,王文全,王繼永,等.我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)野生與栽培甘草的甘草酸含量及其影響因子的初步研究[J].中國(guó)中藥雜志,2012,37(10):1341-1345.

[3] 王文全,吳慶豐.我國(guó)的甘草資源與甘草栽培技術(shù)[J].中藥研究與信息,2001,3(12):18-20.

[4] 曹秀梅.人工甘草變異類(lèi)型的產(chǎn)量質(zhì)量比較[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(6):27-29.

[5] 程新宇,韓亞男,康雪芳.甘草地上部分總黃酮含量測(cè)定方法的篩選[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(2):1-5.

[6] 馬生軍，陳翔，王文全，等.實(shí)時(shí)熒光定量分析不同錳處理對(duì)甘草SQS1基因表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2015,43(1):43-47.

[7] 潘瑞熾.植物生理學(xué)[M].7版.北京:高等教育出版社,2012:147.

[8] 韓軍麗,李振秋,劉本葉,等.植物萜類(lèi)代謝工程[J].生物工程學(xué)報(bào), 2007, 23(4): 561-569.

[9] Millar AH. Specificity of the Organic Acid Activation of Alternative Oxidase in Plant Mitochondria[J]. Plant Physiology,1996,111(2): 613-618.

[10] Ana Zabalza, Joost T van Dongen,Anja Froehlich, et al.Regulation of respiration and Fermentation to Control the Plant Internal Oxygen Concent ration[J].Plant Physiology,2009,149:1087-1098.

[11] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2000.

[12] 文樹(shù)基.基礎(chǔ)生物化學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)[M].西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社,1992.

[13] 周香珍.紫外-可見(jiàn)分光光度法及近紅外光譜技術(shù)在甘草質(zhì)量快速分析中的應(yīng)用研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2012.

[14] James WO,吳相鈺.植物呼吸作用中的反應(yīng)途徑[J].植物生理學(xué)通訊,1957,7(3):60-67.

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81573524)

楊春寧(1990-)，男，北京中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)碩士研究生，主要從事中藥材質(zhì)量及調(diào)控機(jī)制研究工作。

孫志蓉*(1967-)，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥質(zhì)量與開(kāi)發(fā)研究工作。

2016-02-18

R28

A

1002-2406(2016)05-0001-03

修回日期：2016-03-01