馬吉鋒 王建東 張俊麗 梁小軍 （寧夏農(nóng)林科學(xué)院草畜工程技術(shù)研究中心 750002)

灘湖后代和雙胎灘公羊多羔主效基因FecB檢測試驗(yàn)

馬吉鋒 王建東 張俊麗 梁小軍 （寧夏農(nóng)林科學(xué)院草畜工程技術(shù)研究中心 750002)

通過對灘羊公羊、湖羊母羊，灘湖F1代公羔、母羔、灘湖F2代公羔、母羔共96只羊進(jìn)行了FecB檢測，結(jié)果表明，灘湖F1代公羔中測定的15只羊中有14個B+型，1個BB型，灘湖F1代母羔中測定的15只羊中有14個B+型，1個BB型，灘湖F2代公羔中測定的9只羊中有3個B+型，灘湖F2代母羔中測定的13只羊中有6個B+型，10只灘羊雙胞胎公羔中有1個B+型。通過對FecB檢測，為下一步灘羊多胎品系選育提供理論依據(jù)。

灘羊；多胎品系；雜交育種；主效基因；檢測

世界綿羊品種庫現(xiàn)有的近700個品種中，僅少數(shù)具有產(chǎn)羔數(shù)多、性成熟早和常年發(fā)情的特點(diǎn)，其余多屬季節(jié)性發(fā)情和一胎單羔。因此，如何有效地提高綿羊的繁殖力成為育種學(xué)家最關(guān)注的熱點(diǎn)之一[1]。Booroola（FecB）基因是在綿羊中識別出的第一個高繁殖力主效基因[2]，具有穩(wěn)定的多胎性。該突變基因被綿羊和山羊遺傳命名委員會正式定名為FecB基因 （Fecundity Booroola），F(xiàn)ecB基因存在3種基因型，相應(yīng)的產(chǎn)羔數(shù)BB型 （突變型）＞B+型＞++型 （野生型）。直到2001年，3個研究團(tuán)隊(duì) （Mulsant et al，2001；Souza et al，2001；Wilson et al，2001）才將該突變定位于綿羊第6號染色體BMPR1B基因，該基因編碼區(qū)內(nèi)部高度保守的胞內(nèi)激酶信號區(qū)域發(fā)生了A746G突變，引起谷氨酰胺變成精氨酸，最終導(dǎo)致綿羊排卵數(shù)增加。當(dāng)前大部分研究都集中在不同綿羊品種中FecB位點(diǎn)的檢測。已證實(shí)該突變存在于我國的小尾寒羊和湖羊等。目前，F(xiàn)ecB突變作為高產(chǎn)羔數(shù)的分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于綿羊育種改良中。2015年10月，灘羊多胎品系選育課題組，采集了育種群中的灘羊公羊、湖羊母羊，灘湖F1代公羔、母羔、灘湖F2代公羔、母羔進(jìn)行了FecB檢測，旨在通過檢測灘湖后代是否攜帶高繁殖力主效基因 （FecB），可以加速灘羊多胎品系的選育步伐。

1 材料

測定羊96只，采血注射器，真空抗凝采血管 （塑料），DNA提取試劑盒，Tagman MGB探針，2×Master Mix，F(xiàn)ecB正向引物，F(xiàn)ecB反向引物，去離子水。

2 方法

采用頸靜脈法采血2～5ml，置于真空抗凝采血管中。對所采集的血液使用DNA提取試劑盒法提取對應(yīng)羊只的DNA樣。FecB引物和探針由英濰捷基公司合成，采用購自ABI公司的universal Master Mix，PCR儀型號為ViiA·7實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)。

反應(yīng)體系：以提取的DNA為模板，以上述合成的探針在熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行以下擴(kuò)增 （6μl反應(yīng)體系）：1μl的基因組 DNA，3μl的 2×Master Mix，10μmol/L 正向引物0.3μl，10μmol/L 反向引物 0.3μl； 10μmol/L探針 P-G 0.15μl，10μmol/L探針 P-A 0.15μl，去離子水補(bǔ)齊至 6μl。 具體步驟如下。

設(shè)置一個空白對照NTC，設(shè)置兩個已知GG型綿羊基因組對照，一個已知AG型綿羊基因組對照，一個已知AA型綿羊基因組對照。

向384孔板或96孔板加入上述反應(yīng)體系。

完成后用封口膜封口，平板離心機(jī)離心。

開啟ABI ViiA·7實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)，設(shè)置參數(shù)，反應(yīng)條件如下：95℃10min，95℃30s，60℃1min，40個循環(huán)。

3 分析結(jié)果

應(yīng)用ViiA7_v1_1 Software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)對照擴(kuò)增結(jié)果，分型產(chǎn)生3種基因型，見附圖。

附圖

4 討論與小結(jié)

增加產(chǎn)羔率是提高繁殖效率的重要方式，自2000年之后，我國陸續(xù)對地方品種及引進(jìn)的綿羊品種開展FecB基因相關(guān)研究，已在多個地方品種中發(fā)現(xiàn)含有FecB突變基因。綿羊多胎基因 （FecB）的位點(diǎn)，被定位在第6號染色體上，具有提高排卵和產(chǎn)羔的生物學(xué)作用。通過BMPR-IB分子標(biāo)記輔助選擇，可以提高對選擇多胎母羊的準(zhǔn)確性。其效應(yīng)表現(xiàn)為：純合型 （BB）多產(chǎn)1.5只羔羊；雜合型 （B+）多產(chǎn)1.0只羔羊；野生型 （++）與地方品種接近。本l試驗(yàn)測定表明，灘湖F1代公羔中測定的15只羊中有14個B+型，1個BB型，灘湖F1代母羔中測定的15只羊中有14個B+型，1個BB型，灘湖F2代公羔中測定的9只羊中有3個B+型，灘湖F2代母羔中測定的13只羊中有6個B+型，10只灘羊雙胞胎公羔中有1個B+型。鐘發(fā)剛[3]等以BMPR-IB基因作為多胎性能的候選基因，檢測結(jié)果表明，多胎性狀由多胎基因（FecB）控制，通過 （BMPR-IB）基因分子標(biāo)記輔助選擇，可加快育種工作進(jìn)程。史洪才等[4]試驗(yàn)表明，BMPR-IB基因FecB突變顯著影響了策勒黑羊的產(chǎn)羔數(shù)，是策勒黑羊多胎性能的主效基因之一。陳曉勇等[5]，王金文等[6]均在培育新品種過程中將FecB基因作為多胎候選基因應(yīng)用到育種實(shí)踐中，提高了育種群母羊產(chǎn)羔數(shù)。

附表 檢測結(jié)果

近幾年來，由于FecB突變能提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)，通過檢測綿羊是否攜帶高繁殖力主效基因 （FecB），可以加速綿羊的選育步伐。FecB基因標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到育種領(lǐng)域，將FecB基因通過分子標(biāo)記選擇技術(shù)導(dǎo)入到新培育品種 （系）。雜合型母羊不僅可以留作種用，而且可優(yōu)先選配帶多胎基因的公羊，這為加快育成灘羊多胎品系開辟了新途徑。

[1]儲明星.綿羊高繁殖力主效基因的研究及應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2008,16（1):1-9.

[2]Piper LR，BM Bindon.The Booroola Merino and the performance of medium non-Peppin crosses at Armidale[J].CSIRO，Melbourne，1982:9-19.

[3]鐘發(fā)剛,王新華,李輝.綿羊BM PR-IB基因作為多胎性能的候選基因在肉用多胎品種 選育中的應(yīng)用研究[J].中國草食動物，2005,25（4):6-7.

[4]史洪才,牛志剛,白杰,等.BMPR-IB基因突變對策勒黑羊產(chǎn)羔數(shù)的影響及其遺傳規(guī)律的研究[J].中國畜牧雜志,2012,48（3):14-17.

[5]陳曉勇,敦偉濤,田樹軍,等.肉羊繁育關(guān)鍵技術(shù)研究示范及應(yīng)用[J].黑龍江動物繁殖,2012,20（1):1-5.

[6]王金文,崔緒奎,王德芹,等.魯西黑頭肉羊多胎品系培育[J].中國草食動物,2011,31（1):13-17.