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        骨痹顆粒防治兔骨關(guān)節(jié)炎的作用及機(jī)制

        2016-11-28 00:44:32周玲玲周學(xué)平
        中國老年學(xué)雜志 2016年20期
        關(guān)鍵詞:骨關(guān)節(jié)炎蛋白酶軟骨

        周玲玲 劉 慧 周 聰 耿 姍 周學(xué)平

        (南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210023)

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        骨痹顆粒防治兔骨關(guān)節(jié)炎的作用及機(jī)制

        周玲玲 劉 慧 周 聰 耿 姍 周學(xué)平

        (南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210023)

        目的 觀察骨痹顆粒對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎(OA)的治療作用機(jī)制。方法 兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、塞來昔布組及骨痹顆粒2.78,5.56,11.12 g生藥/kg三個(gè)劑量組;采用兔關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶法建立OA模型,連續(xù)給藥8 w,檢測(cè)家兔血清中白細(xì)胞介素(IL)-1β、前列腺素(PG)E2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1含量及關(guān)節(jié)液中誘導(dǎo)型一氧化碳合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)水平,觀察兔關(guān)節(jié)病理組織學(xué)變化。結(jié)果 骨痹顆粒5.56,11.12 g生藥/kg可抑制炎癥因子IL-1β及PGE2的生成,降低MMP-1及MMP-3水平,提高TIMP-1水平,抑制關(guān)節(jié)液中iNOS表達(dá)及NO釋放,減輕關(guān)節(jié)軟骨病變,降低關(guān)節(jié)Mankin評(píng)分。結(jié)論 骨痹顆粒對(duì)兔OA具有良好的治療作用,其機(jī)制與抑制炎癥介質(zhì)和炎性因子生成、調(diào)節(jié)基質(zhì)合成與分解代謝平衡有關(guān)。

        骨痹顆粒;骨關(guān)節(jié)炎;炎性因子;金屬蛋白酶

        骨關(guān)節(jié)炎(OA)是機(jī)械力學(xué)和生物學(xué)事件的共同作用下所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),及軟骨下骨的降解和合成作用之間失衡的結(jié)果〔1〕,流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示50歲以上人群OA致殘率在長期致殘疾病排名中僅次于心血管疾病〔2〕,因此,OA的防治也成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)藥在防治骨關(guān)節(jié)疾病方面具有獨(dú)特療效,周仲瑛教授結(jié)合臨床應(yīng)用數(shù)十年的經(jīng)驗(yàn),采用桑寄生、懷牛膝、川斷等8味中藥,通過現(xiàn)代方法精制成骨痹顆粒,臨床研究證明該藥可有效抑制炎癥,延緩關(guān)節(jié)退變,減輕患者痛苦。為了進(jìn)一步明確其對(duì)OA的療效,本課題采用關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶建立家兔骨關(guān)節(jié)炎的模型,觀察骨痹顆粒對(duì)其作用及機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 藥物與試劑 骨痹顆粒由江蘇省植物藥研究與新藥開發(fā)中心提供,含6 g生藥/g;塞來昔布,輝瑞制藥有限公司;兔IL-1β、前列腺素(PG)E2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒,均購自上海源葉生物科技有限公司;一氧化氮(NO)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

        1.2 儀器 Synergy HT型酶標(biāo)儀,美國Bio-Tek公司;TS25-WS型離心機(jī),上海盧湘儀儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 骨關(guān)節(jié)炎模型的建立〔3,4〕將兔固定于兔臺(tái),膝關(guān)節(jié)備皮,消毒并屈曲右膝關(guān)節(jié),于髕韌帶附著點(diǎn)外上方約 0.5 cm處進(jìn)針,將0.3 ml 1.6%木瓜蛋白酶注入關(guān)節(jié)腔內(nèi),每隔3 d注射1次,共注射3次。正常對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。

        1.3.2 分組及給藥 家兔48只,體重2~2.5 kg,由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(蘇)2012-0008。雌雄各半,隨機(jī)分為6組:分別為①正常對(duì)照組;②模型組;③塞來昔布組:7.67 mg/kg;④骨痹顆粒低劑量組:2.78 g生藥/kg;⑤中劑量組:5.56 g生藥/kg;⑥高劑量組:11.12 g生藥/kg。各組于造模完成后次日開始分別灌胃給予相應(yīng)的藥物,給藥體積為3 ml/kg,正常對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水,每日1次,共8 w。

        1.3.3 指標(biāo)檢測(cè) 給藥結(jié)束后各組家兔心臟取血,離心取血清,ELISA法檢測(cè)血清中IL-1β、PGE2、MMP-1、MMP-3、TIMP-1的含量;處死家兔,用注射器抽取1 ml生理鹽水,注入關(guān)節(jié)腔,反復(fù)屈膝后抽取關(guān)節(jié)液,離心后測(cè)定關(guān)節(jié)液中NO及iNOS含量;取造模側(cè)關(guān)節(jié)股骨內(nèi)髁固定,常規(guī)處理,切片,行HE染色作病理組織學(xué)檢查,阿爾新蘭染色觀察基質(zhì)染色情況,并按照Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分〔5〕。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行單因素方差分析。

        2 結(jié) 果

        2.1 骨痹顆粒對(duì)OA兔血清中IL-1β、PGE2含量的影響 模型組較正常對(duì)照組兔血清中IL-1β、PGE2含量均顯著升高(P<0.01),骨痹顆粒中、高劑量組與模型組比較,血清中IL-1β、PGE2含量均明顯降低(P<0.05,P<0.01),且存在一定的劑量依賴性。見表1。

        表1 骨痹顆粒對(duì)OA兔血清IL-1β、PGE2含量的影響

        與正常對(duì)照組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.05,3)P<0.01;下表同

        2.2 骨痹顆粒對(duì)OA兔血清MMP-1、MMP-3、TIMP-1含量的影響 模型組兔血清中MMP-1、MMP-3含量較正常對(duì)照組明顯升高,TIMP-1含量較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.01),骨痹顆粒中、高劑量組血清MMP-1、MMP-3含量較模型組明顯降低,TIMP-1含量較模型組明顯升高(P<0.05,P<0.01)。見表2。

        表2 骨痹顆粒對(duì)兔血清MMP-1、MMP-3、TIMP-1含量的影響

        2.3 骨痹顆粒對(duì)OA兔關(guān)節(jié)液NO、iNOS含量的影響 模型組兔關(guān)節(jié)液NO、iNOS含量較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01);骨痹顆粒低劑量組兔關(guān)節(jié)液NO含量明顯低于模型組(P<0.05),但iNOS含量變化較模型組無明顯降低;骨痹顆粒中、高劑量組兔關(guān)節(jié)液NO 、iNOS含量較模型組均有顯著下降(P<0.01)。見表3。

        表3 骨痹顆粒對(duì)兔關(guān)節(jié)液NO 、iNOS含量的影響

        2.4 骨痹顆粒對(duì)OA兔關(guān)節(jié)軟骨病理組織學(xué)改變的影響 家兔關(guān)節(jié)病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示:正常對(duì)照組兔關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整,表面光滑,無裂隙,分層規(guī)則,細(xì)胞排列整齊,潮線清晰完整。模型組兔關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙不平,出現(xiàn)裂隙,分層不清晰,結(jié)構(gòu)紊亂,軟骨細(xì)胞中度或重度增生,伴有大量簇集現(xiàn)象,潮線模糊,或被血管穿過。骨痹顆粒低劑量組兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列紊亂但層次可分,軟骨細(xì)胞輕度至中度增生,部分有簇集現(xiàn)象,局部區(qū)域缺失,潮線紊亂;中劑量組兔關(guān)節(jié)軟骨表面較平滑,有少許裂隙排列紊亂但層次可分,軟骨細(xì)胞排列整齊,輕度增生,潮線完整,可見多層次潮線;高劑量組兔關(guān)節(jié)軟骨表面較平滑,分層基本清楚,細(xì)胞輕度增生,潮線清晰可見。見圖1。兔軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果顯示:模型組兔關(guān)節(jié)Mankin′s評(píng)分較正常對(duì)照組明顯升高〔(8.00±1.31)vs(0.00±0.00),P<0.01〕;骨痹顆粒中、高劑量組兔關(guān)節(jié)Mankin評(píng)分〔(6.25±1.83),(6.13±1.55)〕較模型組明顯降低(P<0.05)。塞來昔布組、骨痹顆粒低劑量組〔(6.57±2.07)、(7.50±1.52)〕與模型組無顯著差異(P>0.05)。

        圖1 各組兔關(guān)節(jié)病理組織學(xué)改變(HE,×40)

        3 討 論

        OA主要病理改變?yōu)檐浌峭诵行圆∽?、基質(zhì)降解、骨贅形成等。周仲瑛教授根據(jù)數(shù)十年臨床經(jīng)驗(yàn)確立補(bǔ)腎蠲痹通絡(luò)法治療OA〔6〕,據(jù)此選藥組成骨痹方。方中桑寄生益肝腎、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨,雞血藤養(yǎng)肝血、柔筋脈、和血絡(luò),兩者共為君藥。懷牛膝、川斷、骨碎補(bǔ)共為臣藥,補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、活血止痛,增強(qiáng)桑寄生補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效。千年健和土鱉蟲共為佐藥,祛風(fēng)濕、破瘀血、壯筋骨、止痛消腫;油松節(jié)祛風(fēng)濕、通絡(luò)止痛,善走骨節(jié)、直達(dá)病所為使藥。諸藥合用共奏平補(bǔ)肝腎、蠲痹通絡(luò)之功效,可延緩關(guān)節(jié)軟骨的退行性變,充分體現(xiàn)治病求本之旨。

        課題首先采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射誘發(fā)兔OA,動(dòng)物可觀察到關(guān)節(jié)病變,炎癥性細(xì)胞因子過度分泌和金屬蛋白酶水平異常等癥狀,與人骨關(guān)節(jié)炎病理變化較為類似。在此基礎(chǔ)上觀察骨痹顆粒的作用,結(jié)果顯示其可以減輕兔骨關(guān)節(jié)病理組織學(xué)改變,降低Mankin評(píng)分,表明其對(duì)OA的局部病變有較好的作用。細(xì)胞因子的合成與分解途徑的失衡是OA關(guān)節(jié)軟骨毀損中最為基本的因素,其中IL-1β的大量釋放,可刺激軟骨細(xì)胞和滑膜產(chǎn)生MMPs,促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解,還可誘導(dǎo)環(huán)氧化酶(COX)-2和iNOS的表達(dá),促進(jìn)PGE2、NO的合成〔7,8〕。PGE2可增加毛細(xì)血管通透性,抑制蛋白多糖合成,激活MMPs,并促進(jìn)膠原酶產(chǎn)生,導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解破壞〔9,10〕。此外,PGE2對(duì)IL-1β的表達(dá)具有正反饋的作用,從而進(jìn)一步誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡〔11〕。高水平的NO在OA可促進(jìn)PGE2釋放,加重炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡,還能激活多種潛在的膠原酶、明膠酶和組織纖溶酶原激活物,抑制軟骨基質(zhì)合成,促進(jìn)Ⅱ型膠原降解,最終導(dǎo)致軟骨進(jìn)行性退化〔12,13〕。本研究結(jié)果顯示,骨痹顆粒能夠明顯抑制OA兔血清中IL-1β、PGE2等炎癥因子的產(chǎn)生,并進(jìn)一步抑制兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)iNOS的過度表達(dá),減少NO的分泌,提示抑制炎癥性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放是其治療OA的機(jī)制之一。

        細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原與蛋白多糖構(gòu)成,是軟骨的主要組成部分,在維持軟骨功能方面有著重要的作用,其合成與降解代謝保持動(dòng)態(tài)平衡〔14〕。MMPs是基質(zhì)降解的主要介質(zhì),其中MMP-1和MMP-3是參與軟骨基質(zhì)降解的重要介質(zhì),并受TIMP-1的調(diào)節(jié)〔15〕,目前已作為判斷療效的指標(biāo)之一。本課題研究結(jié)果表明骨痹顆??筛纳苹|(zhì)代謝平衡,延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。炎癥因子IL-1β等的升高,也可刺激軟骨及滑膜MMPs表達(dá)上調(diào),TIMPs表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致MMPs/TIMPs的平衡遭到破壞,因此推測(cè)骨痹顆粒對(duì)MMP的作用除直接作用外,還可能與其抑制炎癥因子的作用相關(guān)。

        綜上,骨痹顆??杀Wo(hù)OA動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨,延緩軟骨退變的發(fā)生與發(fā)展,抑制炎癥因子的生成,調(diào)節(jié)基質(zhì)代謝平衡,對(duì)OA具有良好的防治作用。

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        〔2015-05-25修回〕

        (編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

        江蘇省科技廳社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No.BE2011847)

        周玲玲(1974-),女,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事中藥藥理學(xué)、免疫藥理學(xué)等方面研究。

        R285.5

        A

        1005-9202(2016)20-4975-03;

        10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.015

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