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        骨痹顆粒防治兔骨關節(jié)炎的作用及機制

        2016-11-28 00:44:32周玲玲周學平
        中國老年學雜志 2016年20期
        關鍵詞:骨關節(jié)炎蛋白酶軟骨

        周玲玲 劉 慧 周 聰 耿 姍 周學平

        (南京中醫(yī)藥大學,江蘇 南京 210023)

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        骨痹顆粒防治兔骨關節(jié)炎的作用及機制

        周玲玲 劉 慧 周 聰 耿 姍 周學平

        (南京中醫(yī)藥大學,江蘇 南京 210023)

        目的 觀察骨痹顆粒對兔骨關節(jié)炎(OA)的治療作用機制。方法 兔隨機分為正常對照組、模型組、塞來昔布組及骨痹顆粒2.78,5.56,11.12 g生藥/kg三個劑量組;采用兔關節(jié)腔注射木瓜蛋白酶法建立OA模型,連續(xù)給藥8 w,檢測家兔血清中白細胞介素(IL)-1β、前列腺素(PG)E2、基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1含量及關節(jié)液中誘導型一氧化碳合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)水平,觀察兔關節(jié)病理組織學變化。結果 骨痹顆粒5.56,11.12 g生藥/kg可抑制炎癥因子IL-1β及PGE2的生成,降低MMP-1及MMP-3水平,提高TIMP-1水平,抑制關節(jié)液中iNOS表達及NO釋放,減輕關節(jié)軟骨病變,降低關節(jié)Mankin評分。結論 骨痹顆粒對兔OA具有良好的治療作用,其機制與抑制炎癥介質和炎性因子生成、調節(jié)基質合成與分解代謝平衡有關。

        骨痹顆粒;骨關節(jié)炎;炎性因子;金屬蛋白酶

        骨關節(jié)炎(OA)是機械力學和生物學事件的共同作用下所導致的關節(jié)的軟骨細胞、細胞外基質(ECM),及軟骨下骨的降解和合成作用之間失衡的結果〔1〕,流行病學調查結果顯示50歲以上人群OA致殘率在長期致殘疾病排名中僅次于心血管疾病〔2〕,因此,OA的防治也成為醫(yī)學界研究的熱點。中醫(yī)藥在防治骨關節(jié)疾病方面具有獨特療效,周仲瑛教授結合臨床應用數十年的經驗,采用桑寄生、懷牛膝、川斷等8味中藥,通過現代方法精制成骨痹顆粒,臨床研究證明該藥可有效抑制炎癥,延緩關節(jié)退變,減輕患者痛苦。為了進一步明確其對OA的療效,本課題采用關節(jié)腔注射木瓜蛋白酶建立家兔骨關節(jié)炎的模型,觀察骨痹顆粒對其作用及機制。

        1 材料與方法

        1.1 藥物與試劑 骨痹顆粒由江蘇省植物藥研究與新藥開發(fā)中心提供,含6 g生藥/g;塞來昔布,輝瑞制藥有限公司;兔IL-1β、前列腺素(PG)E2、基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1酶聯免疫分析試劑盒,均購自上海源葉生物科技有限公司;一氧化氮(NO)及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

        1.2 儀器 Synergy HT型酶標儀,美國Bio-Tek公司;TS25-WS型離心機,上海盧湘儀儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 骨關節(jié)炎模型的建立〔3,4〕將兔固定于兔臺,膝關節(jié)備皮,消毒并屈曲右膝關節(jié),于髕韌帶附著點外上方約 0.5 cm處進針,將0.3 ml 1.6%木瓜蛋白酶注入關節(jié)腔內,每隔3 d注射1次,共注射3次。正常對照組注射等體積的生理鹽水。

        1.3.2 分組及給藥 家兔48只,體重2~2.5 kg,由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(蘇)2012-0008。雌雄各半,隨機分為6組:分別為①正常對照組;②模型組;③塞來昔布組:7.67 mg/kg;④骨痹顆粒低劑量組:2.78 g生藥/kg;⑤中劑量組:5.56 g生藥/kg;⑥高劑量組:11.12 g生藥/kg。各組于造模完成后次日開始分別灌胃給予相應的藥物,給藥體積為3 ml/kg,正常對照組和模型組給予等體積生理鹽水,每日1次,共8 w。

        1.3.3 指標檢測 給藥結束后各組家兔心臟取血,離心取血清,ELISA法檢測血清中IL-1β、PGE2、MMP-1、MMP-3、TIMP-1的含量;處死家兔,用注射器抽取1 ml生理鹽水,注入關節(jié)腔,反復屈膝后抽取關節(jié)液,離心后測定關節(jié)液中NO及iNOS含量;取造模側關節(jié)股骨內髁固定,常規(guī)處理,切片,行HE染色作病理組織學檢查,阿爾新蘭染色觀察基質染色情況,并按照Mankin評分標準進行評分〔5〕。

        1.4 統(tǒng)計學方法 采用Graph Pad Prism 5軟件進行單因素方差分析。

        2 結 果

        2.1 骨痹顆粒對OA兔血清中IL-1β、PGE2含量的影響 模型組較正常對照組兔血清中IL-1β、PGE2含量均顯著升高(P<0.01),骨痹顆粒中、高劑量組與模型組比較,血清中IL-1β、PGE2含量均明顯降低(P<0.05,P<0.01),且存在一定的劑量依賴性。見表1。

        表1 骨痹顆粒對OA兔血清IL-1β、PGE2含量的影響

        與正常對照組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.05,3)P<0.01;下表同

        2.2 骨痹顆粒對OA兔血清MMP-1、MMP-3、TIMP-1含量的影響 模型組兔血清中MMP-1、MMP-3含量較正常對照組明顯升高,TIMP-1含量較正常對照組明顯降低(P<0.01),骨痹顆粒中、高劑量組血清MMP-1、MMP-3含量較模型組明顯降低,TIMP-1含量較模型組明顯升高(P<0.05,P<0.01)。見表2。

        表2 骨痹顆粒對兔血清MMP-1、MMP-3、TIMP-1含量的影響

        2.3 骨痹顆粒對OA兔關節(jié)液NO、iNOS含量的影響 模型組兔關節(jié)液NO、iNOS含量較正常對照組明顯升高(P<0.01);骨痹顆粒低劑量組兔關節(jié)液NO含量明顯低于模型組(P<0.05),但iNOS含量變化較模型組無明顯降低;骨痹顆粒中、高劑量組兔關節(jié)液NO 、iNOS含量較模型組均有顯著下降(P<0.01)。見表3。

        表3 骨痹顆粒對兔關節(jié)液NO 、iNOS含量的影響

        2.4 骨痹顆粒對OA兔關節(jié)軟骨病理組織學改變的影響 家兔關節(jié)病理組織學檢查結果顯示:正常對照組兔關節(jié)軟骨結構完整,表面光滑,無裂隙,分層規(guī)則,細胞排列整齊,潮線清晰完整。模型組兔關節(jié)軟骨表面粗糙不平,出現裂隙,分層不清晰,結構紊亂,軟骨細胞中度或重度增生,伴有大量簇集現象,潮線模糊,或被血管穿過。骨痹顆粒低劑量組兔關節(jié)軟骨細胞排列紊亂但層次可分,軟骨細胞輕度至中度增生,部分有簇集現象,局部區(qū)域缺失,潮線紊亂;中劑量組兔關節(jié)軟骨表面較平滑,有少許裂隙排列紊亂但層次可分,軟骨細胞排列整齊,輕度增生,潮線完整,可見多層次潮線;高劑量組兔關節(jié)軟骨表面較平滑,分層基本清楚,細胞輕度增生,潮線清晰可見。見圖1。兔軟骨Mankin評分結果顯示:模型組兔關節(jié)Mankin′s評分較正常對照組明顯升高〔(8.00±1.31)vs(0.00±0.00),P<0.01〕;骨痹顆粒中、高劑量組兔關節(jié)Mankin評分〔(6.25±1.83),(6.13±1.55)〕較模型組明顯降低(P<0.05)。塞來昔布組、骨痹顆粒低劑量組〔(6.57±2.07)、(7.50±1.52)〕與模型組無顯著差異(P>0.05)。

        圖1 各組兔關節(jié)病理組織學改變(HE,×40)

        3 討 論

        OA主要病理改變?yōu)檐浌峭诵行圆∽?、基質降解、骨贅形成等。周仲瑛教授根據數十年臨床經驗確立補腎蠲痹通絡法治療OA〔6〕,據此選藥組成骨痹方。方中桑寄生益肝腎、祛風濕、強筋骨,雞血藤養(yǎng)肝血、柔筋脈、和血絡,兩者共為君藥。懷牛膝、川斷、骨碎補共為臣藥,補肝腎、強筋骨、活血止痛,增強桑寄生補肝腎、強筋骨的功效。千年健和土鱉蟲共為佐藥,祛風濕、破瘀血、壯筋骨、止痛消腫;油松節(jié)祛風濕、通絡止痛,善走骨節(jié)、直達病所為使藥。諸藥合用共奏平補肝腎、蠲痹通絡之功效,可延緩關節(jié)軟骨的退行性變,充分體現治病求本之旨。

        課題首先采用木瓜蛋白酶關節(jié)腔內注射誘發(fā)兔OA,動物可觀察到關節(jié)病變,炎癥性細胞因子過度分泌和金屬蛋白酶水平異常等癥狀,與人骨關節(jié)炎病理變化較為類似。在此基礎上觀察骨痹顆粒的作用,結果顯示其可以減輕兔骨關節(jié)病理組織學改變,降低Mankin評分,表明其對OA的局部病變有較好的作用。細胞因子的合成與分解途徑的失衡是OA關節(jié)軟骨毀損中最為基本的因素,其中IL-1β的大量釋放,可刺激軟骨細胞和滑膜產生MMPs,促進軟骨基質的降解,還可誘導環(huán)氧化酶(COX)-2和iNOS的表達,促進PGE2、NO的合成〔7,8〕。PGE2可增加毛細血管通透性,抑制蛋白多糖合成,激活MMPs,并促進膠原酶產生,導致軟骨基質降解破壞〔9,10〕。此外,PGE2對IL-1β的表達具有正反饋的作用,從而進一步誘導軟骨細胞凋亡〔11〕。高水平的NO在OA可促進PGE2釋放,加重炎癥反應,誘導軟骨細胞凋亡,還能激活多種潛在的膠原酶、明膠酶和組織纖溶酶原激活物,抑制軟骨基質合成,促進Ⅱ型膠原降解,最終導致軟骨進行性退化〔12,13〕。本研究結果顯示,骨痹顆粒能夠明顯抑制OA兔血清中IL-1β、PGE2等炎癥因子的產生,并進一步抑制兔關節(jié)腔內iNOS的過度表達,減少NO的分泌,提示抑制炎癥性細胞因子和炎癥介質的釋放是其治療OA的機制之一。

        細胞外基質主要由膠原與蛋白多糖構成,是軟骨的主要組成部分,在維持軟骨功能方面有著重要的作用,其合成與降解代謝保持動態(tài)平衡〔14〕。MMPs是基質降解的主要介質,其中MMP-1和MMP-3是參與軟骨基質降解的重要介質,并受TIMP-1的調節(jié)〔15〕,目前已作為判斷療效的指標之一。本課題研究結果表明骨痹顆??筛纳苹|代謝平衡,延緩關節(jié)軟骨退變。炎癥因子IL-1β等的升高,也可刺激軟骨及滑膜MMPs表達上調,TIMPs表達下調,導致MMPs/TIMPs的平衡遭到破壞,因此推測骨痹顆粒對MMP的作用除直接作用外,還可能與其抑制炎癥因子的作用相關。

        綜上,骨痹顆??杀WoOA動物的關節(jié)軟骨,延緩軟骨退變的發(fā)生與發(fā)展,抑制炎癥因子的生成,調節(jié)基質代謝平衡,對OA具有良好的防治作用。

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        〔2015-05-25修回〕

        (編輯 苑云杰/曹夢園)

        江蘇省科技廳社會發(fā)展項目(No.BE2011847)

        周玲玲(1974-),女,博士,副教授,碩士生導師,主要從事中藥藥理學、免疫藥理學等方面研究。

        R285.5

        A

        1005-9202(2016)20-4975-03;

        10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.015

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