張忠玉（山東省安丘市興安畜牧獸醫(yī)管理站 262100）

一株牛副流感病毒3型的分離鑒定

張忠玉（山東省安丘市興安畜牧獸醫(yī)管理站 262100）

牛副流感病毒3型是引起牛呼吸道疾病的主要病原之一。本研究從河南省某牛場(chǎng)具有急性呼吸道癥狀的牛鼻腔棉拭子中，應(yīng)用牛腎臟細(xì)胞MDBK進(jìn)行病毒分離，分離的病毒能吸附并凝聚豚鼠紅細(xì)胞，血凝效價(jià)為1:32。對(duì)病毒進(jìn)行提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增HN基因，測(cè)序結(jié)果顯示，分離病毒序列為牛副流感病毒3型。

牛副流感病毒3型；分離；鑒定；RT-PCR

牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）屬于單股負(fù)鏈RNA病毒，該病毒為副黏病毒科副黏病毒亞科呼吸道病毒屬[1]。近年來(lái)，奶牛呼吸道疾病引起的肺炎病例越來(lái)越多，主要原因是牛副流感病毒3型混合細(xì)菌感染以及支原體感染是引起[2-6]。血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)BPIV3總體陽(yáng)性率為77.6%[7]。朱遠(yuǎn)茂等證實(shí)我國(guó)BPIV3流行2個(gè)基因型，即基因C型和A型[8]。本研究從表現(xiàn)呼吸道癥狀的牛鼻拭子中分離一株牛副流感病毒3型，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和培養(yǎng)基

牛腎細(xì)胞（MDBK）由本實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均為Gibco公司產(chǎn)品。MDBK細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，用含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，置于含5%CO2培養(yǎng)箱37°C下培養(yǎng)。

1.2 病料的細(xì)胞接種

將采集牛鼻腔深部鼻液的鼻拭子用300μL滅菌PBS浸泡，3000rpm/min離心5min后，吸取上清液，用0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌后接種MDBK細(xì)胞，37°C孵育1h后用PBS洗細(xì)胞，換成1%血清的DMEM。反復(fù)凍融3次后，接下一代，盲傳3～5代直至出現(xiàn)CPE。

1.3 主要試劑

RNA提取試劑盒購(gòu)自杭州博日公司，PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、LA Taq DNA聚合酶和DNA Maker等均購(gòu)自TaKaRa公司（大連）引物由Invitrogen有限公司（北京）合成。

1.4 病毒滴定（TCID50） 測(cè)定

將分離毒株的第7代細(xì)胞毒進(jìn)行滴定，測(cè)定毒價(jià)。方法為：將病毒液用不含血清的DMEM培養(yǎng)基按10-1～10-8系列稀釋，每個(gè)稀釋度做8個(gè)重復(fù)，每孔接種100μL，每孔加100μLMDBK細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～7d后根據(jù)CPE判定結(jié)果。

1.5 RT-PCR鑒定

根據(jù)發(fā)表的BPIV3的HN基因[8，9]，利用Oligo7設(shè)計(jì)引物， HNF（5'TGGCTGTATTAGAATCCCATC 3'）和 HNR（5'ATAGTACATTATGCCAAGTCC 3'），目的片段大小為803bp。按照說(shuō)明提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。40μL反轉(zhuǎn)錄體系:RNA模板 25μL， Buffer8μL， 反轉(zhuǎn)錄引物 2μL， 2.5mMdNTP4μL，HPRI RNA 酶抑制劑 1μL， 25°C 作用 15min， 42°C 反應(yīng) 1h。PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)于100μL體系中進(jìn)行:ddH2O70μL，LATaq buffer10μL， dNTP（2.5mmol/L）6μL， 上、 下游引物各4μL， 模板 DNA5μL，， 后加 LA-Taq1μL。 反應(yīng)條件： 94°C5min； 94°C45s， 50°C40s， 72°C50s， 30 個(gè) 循 環(huán) ； 72°C10min。取PCR產(chǎn)物5μL于0.8%瓊脂糖凝膠電泳15min，觀察并照相。將PCR產(chǎn)物連直接送往Invitrogen公司（北京）進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用DNAStar軟件分析測(cè)定的序列。

1.6 血凝試驗(yàn)

將出現(xiàn)CPE變化的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，方法參照殷震等編著的 《動(dòng)物病毒學(xué)》。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離

在牛場(chǎng)采集的鼻拭子病料中，PBS浸毒后接種MDBK細(xì)胞培，并在細(xì)胞上盲傳至細(xì)胞病變，可見(jiàn)典型的細(xì)胞變大、變圓現(xiàn)象，皺縮現(xiàn)象，然后局部細(xì)胞開(kāi)始融合，最后融合細(xì)胞壞死、脫落（見(jiàn)圖1A）。對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)72h后生長(zhǎng)良好，鋪滿培養(yǎng)瓶底，未見(jiàn)細(xì)胞發(fā)生病變（見(jiàn)圖1B）。

圖1 A:正常MDBK細(xì)胞；圖1B:接毒后72hCPE

2.2 病毒的滴定（TCID50的測(cè)定）

2.3 病毒的RT-PCR鑒定

按照參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，所得產(chǎn)物為803bp，與預(yù)期結(jié)果相一致（見(jiàn)圖2）。

圖2 病毒HN基因RT-PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

2.4 序列測(cè)定與分析

用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，分離毒株HN基因序列與參考毒株（GenBank accession number:AF178655）基因序列同源性為94.1%。

2.5 血凝和血凝抑制試驗(yàn)

血凝試驗(yàn)結(jié)果為待檢樣本的血凝素效價(jià)為1:32。

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)牛群中爆發(fā)了牛呼吸道傳染病發(fā)病率越來(lái)越高，死亡率也有上升趨勢(shì)，對(duì)養(yǎng)牛羊造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。牛呼吸道疾病是由多種病原引起的，病毒主要包括牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹瀉病毒，此外，混合細(xì)菌會(huì)感染也是牛呼吸道疾病的重要原因。本研究從采集的具有明顯臨呼吸道癥狀的病牛鼻液并料中成功分離出1株BPIV3。

病料應(yīng)采集鼻液，這樣分離病毒的成功率高。本研究用MDBK細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒，出現(xiàn)了明顯的CPE，對(duì)分離病毒傳代3后提取RNA，反轉(zhuǎn)錄和目的基因擴(kuò)增，分離株HN基因片段序列與GenBank中已發(fā)表的毒株序列同源性為949.1%，從分子水平上證明該毒株為BPIV3。RT-PCR診斷方法快速、敏感、特異性強(qiáng)，可以從病料中直接反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增DNA，為BPIV3的診斷提供了有效的手段。BPIV3的分離和鑒定為開(kāi)展相關(guān)診斷試劑研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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張忠玉（1975-），女，漢族，山東省安丘市人，大學(xué)本科，獸醫(yī)師，研究方向:動(dòng)物醫(yī)學(xué)。