曹志梅（山西省太谷縣畜牧獸醫(yī)中心 030800）閆芳（山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學系 030801）

復方恩諾沙星對畜禽主要病菌體外抑菌試驗

曹志梅（山西省太谷縣畜牧獸醫(yī)中心 030800）閆芳（山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學系 030801）

采用紙片擴散法 (K-B法)測定復方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的敏感性大小，采用試管倍比稀釋法測定復方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度 (MBC)。結果表明，病原性大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄菌、雞巴氏桿菌、豬巴氏桿菌、鏈球菌對復方恩諾沙星可溶性粉敏感，復方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的最小抑菌濃度（MIC）為0.0279～3.575μg/ml，最小殺菌濃度為（MBC）為 0.055～7.11μg/ml。

復方恩諾沙星；可溶性粉；化學抗菌藥；最小抑菌濃度（MIC）；最小殺菌濃度（MBC）；畜禽主要病菌；體外；抑菌試驗

復方恩諾沙星可溶性粉主要成分為恩諾沙星和乙酰甲喹。恩諾沙星于1983年由公司合成，因其抗菌廣譜、安全性高而被廣泛應用于獸醫(yī)臨床[1-3]。恩諾沙星是第一種畜禽專用的氟喹諾酮類藥物，抗菌譜廣，殺菌活性強，對革蘭氏陰性菌和陽性菌、細胞內(nèi)病原菌、支原體及一些耐藥菌株有很強的抗菌活性。其通過抑制細菌的DNA合成酶中的回旋酶達到殺菌作用，同時本品對細菌細胞膜具有損傷作用，可以使細菌的內(nèi)容物流失而導致細菌死亡，雙重殺菌作用。乙酰甲喹又名痢菌凈，化學名稱為3-甲基-2-乙?；?N-1，4-二氧喹噁啉，是中國農(nóng)業(yè)科學院中獸醫(yī)研究所研制的化學抗菌藥，具有較廣的抗菌譜和較強的體內(nèi)外抗菌活性。獸醫(yī)臨床上主要用于治療豬痢疾及畜禽消化道細菌感染。本實驗通過測定恩諾沙星對畜禽主要致病菌的敏感性大小、最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），擬為臨床治療疾病時制定更為合理的方案提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

試驗菌株種類，見表1。

1.1.2 供試藥物

復方恩諾沙星可溶性粉，山西奧福萊動物藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號040502，200g，恩諾沙星12g，乙酰甲喹20g。

1.1.3 培養(yǎng)基

MH瓊脂培養(yǎng)基，MH肉湯培養(yǎng)基，鮮血MH瓊脂培養(yǎng)基，血清MH肉湯培養(yǎng)基。

1.1.4 試驗儀器

定性試紙，試管，培養(yǎng)皿，打孔器，鑷子，無菌棉，酒精燈，溫箱。均由本試驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥敏紙片制備

表1 抑菌試驗用菌株

取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6.25mm直徑的圓形小紙片。取圓紙片100片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15～20min高壓滅菌后，放在37℃溫箱或烘箱中1～2d，使完全干燥。在上述含有100片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入藥液0.7ml，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。放37℃溫箱內(nèi)干燥后即加蓋密封，切勿受潮，置陰暗干燥處存放備用[4-6]。

1.2.2 試驗菌液制備

從培養(yǎng)了16～24h的斜面上挑取菌落于滅菌生理鹽水中，并將其懸液濁度調(diào)至0.5號麥氏標準管，直接用此鹽水懸液作為接種物，菌量約1×108cfu/ml[7-9]。

1.2.3 供試藥液配制

精確稱取1g藥物先加入0.1mol/L的NaOH溶液10ml，再加入pH7.2的PBS液32ml， 混勻[10]。

1.2.4 K-B紙片法

用無菌棉拭子蘸取調(diào)好的菌液，并在管壁上擰壓除去多余菌液后置于培養(yǎng)基平板表面反復推涂，以保證細菌在平板表面均勻分布，蓋上平皿蓋在室溫干燥3～5min，用無菌鑷子或紙片分配器放置藥敏紙片，各紙片中心距不小于24mm，紙片據(jù)平板內(nèi)緣應大于15mm。貼完紙片后，在15min內(nèi)將平板反轉(zhuǎn)過來，置于溫箱中，培養(yǎng)24h后觀察結果[11]。

1.2.5 試管倍比稀釋法

藥物的濃度按倍比稀釋來建立，試驗要在無菌條件下于適宜的玻璃試管中進行。試驗中取10支試管排成一列，在第1管中加入1ml藥液和1ml滅菌肉湯。第2～10管均加入1ml滅菌肉湯。第1管混勻后取1ml的量加入到第2管中，混勻后從第2管中取1ml的量加入到第3管中，依次類推到第10管，混勻后取1ml的量棄掉。另取兩管分別加入1ml滅菌肉湯和而不加藥物，其中一管作為細菌生長情況對照，另一管作為空白對照。將2.2.2中制備好的試驗菌液加入到第1～11管中，每管加入量為0.1ml，35℃培養(yǎng)16～24h后肉眼觀察，呈明顯不混濁的試管所含最小的藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC）；繼續(xù)培養(yǎng)至48h，肉眼觀察呈不混濁的試管所含最小的藥物濃度為最小殺菌濃度（MBC）[12-13]。

2 試驗結果

K-B紙片法試驗結果，見表2。最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度 (MBC)試驗結果，見表3。

表2 K-B紙片法試驗結果

3 討論

3.1 影響藥敏試驗結果的因素

藥敏試驗結果易受抗菌藥物紙片含藥量、培養(yǎng)基、接種細菌菌量、培養(yǎng)時間等因素的影響。

抗菌藥物紙片含藥量是影響抑菌圈大小的主要因素，而紙片含藥量又與紙片的重量、吸水性、直徑等有關，首先制備藥敏紙片應選則合格紙片，要求所用濾紙的吸水性好，均勻，不含無關的化學物質(zhì)和色素等，直徑為6.25 mm，制備藥敏紙片時藥物應稱量準確，藥液應搖勻，浸泡應充分，制備好的紙片應妥善保存，保存條件以低溫干燥為佳，最好保存于-20℃，以防藥力降低。藥敏紙片制備后立即用標準敏感菌株作敏感試驗，并記錄其抑菌圈直徑，每次用前應復查1次。

藥敏試驗強調(diào)使用專門培養(yǎng)基MHA，但考慮到本試驗所用的試驗菌株均來自發(fā)病畜禽體內(nèi)分離的病原菌（購自中監(jiān)所），為了能夠使多種細菌都能生長發(fā)育良好，有些細菌如沙門氏菌、巴氏桿菌和鏈球菌等特選用了鮮血MH瓊脂培養(yǎng)基，血清MH肉湯培養(yǎng)基。制備K–B法培養(yǎng)基厚度應為4mm，平皿用直徑90mm的較好。據(jù)報道，做藥敏試驗的培養(yǎng)基厚度相差2mm，抑菌圈直徑最大也會相差2mm，為了防止因培養(yǎng)基厚度而造成的試驗誤差，應嚴格控制每個瓊脂平板的厚度，用直徑為90mm的平皿傾注約15m1普通營養(yǎng)瓊脂液體，保證瓊脂厚度為4mm。

表3 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度(MBC)試驗結果

接種菌量應稀釋到濃度為0.5麥氏比濁管，相當于1×108cfu/ml，若菌稀釋倍數(shù)偏高，菌液濃度偏低，導致接種菌量太少，雖然菌性不變，但抑菌圈直徑常增大，易將耐藥藥物誤判為敏感藥物，相反，若菌料稀釋倍數(shù)偏低，菌液濃度偏高，導致接種菌量太多，抑菌圈直徑常變小，有可能將敏感藥物誤判為耐藥藥物。

細菌培養(yǎng)時間。細菌培養(yǎng)時間過長，細菌能恢復生長，使抑菌圈變小，培養(yǎng)時間過短，抑菌圈還未最終形成，這都可能影響藥敏試驗結果的判定，有可能將敏感藥物與耐藥藥物混淆，因此測定了細菌培養(yǎng)時間，分別制定了不同病原菌觀察結果最佳時間。

總之，在試驗操作的各個環(huán)節(jié)中都應嚴格按照試驗要求進行，盡可能地避免系統(tǒng)誤差，減小隨機誤差，以提高試驗數(shù)據(jù)的可信度。

3.2 結果分析

藥敏試驗的目的是對抗生素臨床治療效果進行預測，查出耐藥性，減少治療錯誤，同時可以根據(jù)敏感、中介、耐藥的提示結合MIC可以方便地制定用藥方案。藥敏試驗時，正確選擇病原菌顯得更為重要，本試驗所用的試驗菌株均來自發(fā)病畜禽體內(nèi)分離的病原菌，可以有效反映復方恩諾沙星可溶性粉的抗菌譜，結果表明其對來源于雞及豬的病原性大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄菌、雞巴氏桿菌、豬巴氏桿菌、病原性鏈球菌均敏感，對雞沙門氏菌不敏感，復方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的最小抑菌濃度（MIC）為0.0279～3.575μg/ml， 最小殺菌濃度為 （MBC）為 0.055～7.11μg/ml。

藥敏試驗是一種體外試驗，細菌在體外對抗生素耐藥，在體內(nèi)也會耐藥，而在體外敏感的體內(nèi)就不一定敏感，所以耐藥是藥敏試驗的正結果。因此，在預側體內(nèi)結果時，耐藥的結果可以確信，而敏感的應保持懷疑。雖然藥敏試驗是藥物在體外的抑菌試驗，結果能否完全代表藥物在動物體內(nèi)的動力學代謝過程及藥物在動物體內(nèi)的抑菌效果有待進一步研究，但可以從側面提供用藥的依據(jù)，指導生產(chǎn)及時準確地控制細菌性疾病。

有條件的養(yǎng)殖場最好開展細菌耐藥性監(jiān)測。用藥物之前最好先做藥敏試驗。用藥要科學合理，劑量要足，療程要夠，防止藥物濃度達不到殺菌濃度而使細菌產(chǎn)生耐藥性。盡量減少預防性投藥，不濫投藥，盡量交換用藥，并注意聯(lián)合用藥，防止交叉耐藥性的產(chǎn)生。搞好消毒，防止耐藥菌株的擴散。

4 結論

復方恩諾沙星可溶性粉對大腸桿菌1555、大腸桿菌216、大腸桿菌1515、綠膿桿菌2087、金黃色葡萄菌547、雞巴氏桿菌458、豬巴氏桿菌437、鏈球菌608敏感，對沙門氏菌cvcc533不敏感。

復方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的最小抑菌濃度（MIC）為 0.0279～3.575μg/ml， 最小殺菌濃度為（MBC）為 0.055～7.11μg/ml。

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