李劍靜 植枝林 李軍 潘艷

（1，廣西岑溪市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 543200；2，廣西獸醫(yī)研究所 530001；3，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001）

豬源彭氏變形桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

李劍靜1植枝林1李軍2，3潘艷2，3

（1，廣西岑溪市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 543200；2，廣西獸醫(yī)研究所 530001；3，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001）

以患子宮炎的后備母豬的膿性分泌物為樣本，進(jìn)行病原菌分離，通過培養(yǎng)特性試驗(yàn)、生化試驗(yàn)、16S rRNA同源性比對(duì)和小鼠致病性試驗(yàn)，鑒定其中的一株優(yōu)勢(shì)菌為具有一定致病力的彭氏變形桿菌。24種常用抗菌藥物體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)頭孢曲松、頭孢噻呋、氧氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考敏感，對(duì)阿莫西林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、卡那霉素、林可霉素、大觀霉素、替米考星等藥物耐藥。

豬子宮炎；彭氏變形桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

彭氏變形桿菌（Proteus penneri）屬于腸桿菌科變形桿菌屬的革蘭陰性桿菌，是1種條件致病菌，可引起嚴(yán)重的疾病，在人醫(yī)臨床上最常見的是引起患者敗血癥、尿路感染及呼吸道感染[1]。據(jù)報(bào)道，在人醫(yī)臨床上彭氏變形桿菌的分離率，尿液標(biāo)本為50%，傷口及軟組織滲出液標(biāo)本為25%，血液標(biāo)本為15%[2-4]。彭氏變形桿菌在畜牧業(yè)上的報(bào)道相對(duì)較少，已有的報(bào)道顯示，該菌可感染對(duì)蝦和蛇[5-6]，并且在魚類食品加工過程中容易造成污染，人們食用后可引起感染[7-8]，該菌在食品衛(wèi)生檢測(cè)中具有重要意義。然而，查閱現(xiàn)有的文獻(xiàn)顯示，彭氏變形桿菌在家畜上引起的疾病鮮有報(bào)道。

2016年3月廣西某中小規(guī)模場(chǎng)后備母豬散發(fā)子宮內(nèi)膜炎，為查明病因，無菌取其膿性分泌物進(jìn)行病原菌分離鑒定，經(jīng)過生長(zhǎng)特性、生化特性和16S rRNA同源性比對(duì)，鑒定其中1株優(yōu)勢(shì)菌為彭氏變形桿菌，同時(shí)對(duì)該分離菌進(jìn)行了體外藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)將試驗(yàn)及結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

廣西某中小規(guī)模豬場(chǎng)患子宮炎的母豬，無菌取其膿性分泌物。

1.2 試劑

伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、MHA培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司，兔血培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州安圖綠科生物工程有限公司。革蘭氏染液、微量生化反應(yīng)管和抗菌藥物敏感試驗(yàn)紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。Bacteria Genomic DNA Kit、 Es Taq DNA Polymerase、 dNTP、 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)100bp Ladder、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)和生長(zhǎng)形態(tài)觀察

用接種環(huán)無菌取膿性分泌物分別劃線接種于兔血平板、麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后觀察分離菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性。挑取優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)之后進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.4 生化試驗(yàn)

依據(jù)鏡檢結(jié)果，將優(yōu)勢(shì)菌純培養(yǎng)物接種于微量生化反應(yīng)管，按說明書要求的條件培養(yǎng)，并在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察結(jié)果，參照 《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5 細(xì)菌16S rRNA鑒定

細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增采用通用引物1492R和27F[10]，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。經(jīng)鏡檢的分離菌，取其純培養(yǎng)物，使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以此作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10x Es Taq PCR Buffer 5 ul， dNTP Mix（2.5mM each）4ul， 上下游引物各2ul，模板 DNA 為 6ul， Es Taq DNA Polymerase（5U/ul）0.25ul，RNase-Free Water補(bǔ)足50ul。 反應(yīng)程序參照陳澤祥[10]進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后進(jìn)行目的片段回收純化，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 小鼠毒力試驗(yàn)

用滅菌生理鹽水將受試菌懸液濃度調(diào)至1個(gè)麥?zhǔn)媳葷峁埽?×108CFU/ml）。 取健康昆明小鼠 10 只（20.5±1）g 隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只，試驗(yàn)組小鼠按0.2ml/10g腹腔注射菌液，對(duì)照組小鼠按同樣劑量腹腔注射滅菌生理鹽水。正常喂養(yǎng)，連續(xù)7d觀察小鼠的活動(dòng)、發(fā)病和死亡情況，剖檢死亡小鼠。觀察病變，并取內(nèi)臟器官進(jìn)行接種菌回收、鑒定。

1.7 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用NCCLS(2009)[11]推薦的Kirby-Bauer法的方法。用滅菌生理鹽水將受試菌濃度調(diào)至1個(gè)麥?zhǔn)媳葷峁埽?×108CFU/ml），取0.2ml均勻涂布于MHA平板，稍靜置待平板吸收菌液后貼標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h，用直尺量取各藥敏紙片的抑菌圈，結(jié)果判定參照NCCLS(2009)頒布的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離和形態(tài)學(xué)觀察

從其中1份樣品分離到1株優(yōu)勢(shì)菌，該菌在血平板和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為表面光滑、邊緣整齊、扁平、透明、膜狀的小菌落。鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性小桿菌。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

受試菌不能分解鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶，能分解尿素酶、苯丙氨酸脫氨酶，吲哚陽性，產(chǎn)生H2S，能發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖少產(chǎn)氣，不能水解七葉苷。受試菌的生化特性與 《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中的彭氏變形桿菌生化特性相符。

2.3 16S rRNA同源性比對(duì)結(jié)果

將測(cè)序獲得分離菌的16S rRNA序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行同源性比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)記載的彭氏變形桿菌（GenBank登錄號(hào):JF775423.1）的16S rRNA序列同源性達(dá)98%。

2.4 小鼠致病力試驗(yàn)

試驗(yàn)組小白鼠腹腔接種細(xì)菌懸液后12h，表現(xiàn)為精神沉郁、呼吸困難，食欲飲欲減退，在24h內(nèi)出現(xiàn)死亡，連續(xù)飼養(yǎng)7d內(nèi)，共死亡3只，無菌取死亡小白鼠的心血、肝臟等組織接種于血平板和伊紅美藍(lán)平板，分離到與接種菌一樣的細(xì)菌。對(duì)照組小白鼠表現(xiàn)正常，無死亡。

依據(jù)分離菌的生長(zhǎng)形態(tài)、生化特性、16S rRNA同源性比對(duì)和小鼠致病力試驗(yàn)結(jié)果，鑒定該分離菌為具有一定致病力的彭氏變形桿菌。

2.5 藥敏結(jié)果

體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試菌對(duì)頭孢曲松、頭孢噻呋、氧氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考敏感，對(duì)阿莫西林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、卡那霉素、林可霉素、大觀霉素、替米考星等藥物耐藥（附表）。

附表 分離菌的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

（1）母豬子宮炎發(fā)病率高，表現(xiàn)為生殖道流出膿性分泌物、產(chǎn)后無乳或少乳、發(fā)情不及時(shí)、屢配不孕、產(chǎn)仔數(shù)低等。引起母豬子宮炎的因素多種多樣，自然因素、人為因素、管理因素、飼料因素和疾病因素均可導(dǎo)致母豬患子宮炎，其中多種疾病可引起豬子宮炎，細(xì)菌性感染主要是大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、棒狀桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等，病毒性感染有細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、乙型腦炎病毒、藍(lán)耳病病毒和圓環(huán)病毒等，呈單一感染和混合感染，以多種病原混合感染為主，本次樣品除了分離出彭氏變性桿菌，還有葡萄球菌和鏈球菌。母豬子宮炎給豬場(chǎng)造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，需引起養(yǎng)豬人的重視，做好防治工作。

（2）彭氏變形桿菌是一種條件致病菌，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降時(shí)可造成感染，通過尿液糞便排放可照成飼養(yǎng)環(huán)境和水體污染，因此加強(qiáng)飼養(yǎng)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)水平、提高免疫力，切實(shí)做好飼養(yǎng)環(huán)境消毒等管理工作可減少該條件致病菌引起的感染。此外，該菌在食品加工過程中也容易污染食品，如果這些污染的食品在食用前未進(jìn)行充分加熱，可能會(huì)引起食用者感染，應(yīng)引起關(guān)注。

（3）藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試的24種抗菌藥物，彭氏變形桿菌的敏感率為20.8%（5/24）， 中介率8.3%（2/24），耐藥率70.9%（17/24），表明分離到的彭氏變形桿菌已產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性。細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，與不科學(xué)的使用抗菌藥物密不可分，如不必要的預(yù)防用藥、沒有依據(jù)的用藥和過量使用藥物。而進(jìn)行細(xì)菌分離和體外藥敏試驗(yàn)，可為臨床治療用藥提供科學(xué)參考，避免了憑經(jīng)驗(yàn)亂用抗菌藥物，減少藥物成本，同時(shí)能減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

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廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014GXNSFAA118119），廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃（桂科重14121003-3-1）。

李劍靜（1977-），女，廣西岑溪市人，本科，獸醫(yī)師，研究方向：動(dòng)物疫病防控。

潘艷（1978-），女，廣西南寧市人，博士，副研究員，研究方向：家畜傳染病與分子生物學(xué)。