許常青，陳 偉，方 圓，汪小五，王林定

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KSHV K15P慢病毒載體的構(gòu)建及其滴度測定

許常青1，2，陳 偉1，方 圓1，汪小五1，王林定1

目的 構(gòu)建含卡波肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)ORF K15P基因的慢病毒載體，并對其在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行研究。方法 PCR法擴(kuò)增獲得KSHV K15P基因，限制性內(nèi)切酶Nhe I酶切和無縫克隆法構(gòu)建重組慢病毒載體pCDH-CMV-K15P-GFP，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組慢病毒載體與3種輔助質(zhì)粒pMDL-PRRE、pRSV-Rev和pMD2.g共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞包裝產(chǎn)生慢病毒，Western blot法檢測K15P蛋白的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)酶切及測序鑒定，成功構(gòu)建慢病毒載體，重組慢病毒質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞可見有熒光表達(dá)，說明K15P基因在細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)并且96 h后產(chǎn)生4×106TU/ml滴度為慢病毒。結(jié)論 成功構(gòu)建了KSHV K15P慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-K15P-GFP，獲得高效表達(dá)K15P基因的慢病毒顆粒，為后續(xù)其在細(xì)胞內(nèi)的功能研究奠定實驗基礎(chǔ)。

卡波肉瘤相關(guān)皰疹病毒；K15P基因；慢病毒

卡波肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)，又被稱為人類皰疹病毒8型(human herpesvirus 8，HHV-8)，屬于γ皰疹病毒亞科。華裔科學(xué)家Chang et al[1]于1994年在卡波肉瘤(Kaposi′s sacoma，KS)組織中發(fā)現(xiàn)該病毒，其除了是引起KS的病原體，還與多中心性Castleman病和原發(fā)滲液性淋巴瘤有關(guān)[2]。ORFK15位于KSHV整個基因組的最右端，處于第75個開放閱讀框(ORF 75)和末端重復(fù)序列之間[3]。研究[4]表明K15P在KS的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，尤其是腫瘤的血管新生。該實驗通過構(gòu)建K15P的慢病毒載體，獲得高效表達(dá)K15P的慢病毒，旨在為研究K15P在細(xì)胞內(nèi)的功能及KSHV的致病機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pFJ-K15P、pCDH-CMV-GFP、pMDL-PRRE、pRSV-Rev、pMD2.g 5種質(zhì)粒和HEK293T細(xì)胞、宿主菌DH5α均由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)實驗室保存，其中pFJ-K15P重組質(zhì)粒包含有K15P的全部8個外顯子序列。其中HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM(美國Gibco公司)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Nhe Ⅰ、PCR高保真酶和蛋白質(zhì)預(yù)染Maker(美國Thermo公司);核酸提取試劑盒和凝膠純化試劑盒( 北京天根生化有限公司);ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit(一步法無縫克隆試劑盒)(南京諾唯贊生物科技有限公司); Opti-MEM(美國Gibco公司);Lip2000(美國Invitrogen公司);兔抗GFP多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 pCDH-CMV-K15P-GFP重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

1.3.1 K15P基因的擴(kuò)增 根據(jù)NCBI上K15P基因序列，引物設(shè)計合成由上海生工生物工程有限公司完成，上游引物：5′-AGATTCTAGAGCTAGCGAATGAAGACACTCATATTCTTCT-3′，下游引物： 5′-CCATAATTCGCTAGCTGTTCCTGGGAAATAAAACCT CC-3′； (下劃線部分代表Nhe I的酶切位點)。以已有的pFJ-K15P質(zhì)粒為模板，普通PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總共25 μl，包括pFJ-K15P質(zhì)粒模板1 μl，10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各1 μl，高保真酶1 μl，ddH2O 17.5 μl。PCR反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，此過程共35個循環(huán)；之后72 ℃、10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，以DL 5 000 Maker 為參照，切膠回收目的條帶并測定其濃度。

1.3.2 pCDH-CMV-K15P-GFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用Nhe Ⅰ單酶切pCDH-CMV-GFP質(zhì)粒，于37 ℃ 酶切2 h，將其線性化，切膠回收，并測其濃度。按照ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit的說明書進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后均勻涂布于含有氨芐青霉素(Amp)的平板中，18～24 h后挑取陽性克隆，搖菌過夜并加入終濃度為30%甘油，凍存于-80 ℃冰箱。用試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切初步鑒定，并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.4 慢病毒的包裝及滴度測定

1.4.1 慢病毒的包裝 轉(zhuǎn)染前將HEK 293T細(xì)胞調(diào)整濃度為1×106個/ml加入100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。慢病毒包裝過程如下：1.5 ml離心管中加入500 μl Opti-MEM培養(yǎng)基，依次加入1.6 μg pCDH-CMV-GFP/pCDH-CMV-K15P-GFP、4 μg pMDL-PRRE、2 μg pRSV-Rev、2.4 μg pMD2.g，輕輕混勻，室溫靜置5 min。取另一支1.5 ml離心管加入500 μl Opti-MEM培養(yǎng)基，在其中加入36 μl Lip2000并輕輕混勻。然后混合上述兩管溶液，輕輕混勻，室溫靜置30 min，形成質(zhì)粒-Lip2000復(fù)合物。在靜置期間，將培養(yǎng)皿中原培養(yǎng)液棄去，加入無雙抗無血清的DMEM培養(yǎng)皿。30 min后將質(zhì)粒-Lip2000復(fù)合物輕輕混勻后加入到細(xì)胞中，緩慢搖勻使復(fù)合物分布均勻。6 h后棄去培養(yǎng)基換成10 ml完全培養(yǎng)基。細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后收集上清液，4 ℃、3 000 r/min離心15 min去除細(xì)胞碎片，0.45 μm針式濾器過濾，然后60 000 r/min超速離心2 h收集沉淀，將病毒液分裝，凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.4.2 慢病毒滴度測定 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種1×105個HEK 293T細(xì)胞，加入100 μl的DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后進(jìn)行感染。取50 μl的病毒原液，用培養(yǎng)基按1×10-1～1×10-9比例進(jìn)行梯度稀釋，每個稀釋梯度平行重復(fù)3孔，每孔加入5 μl病毒稀釋液，感染24 h后，每孔換100 μl新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，以利于細(xì)胞的生長。感染96 h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光情況并找出有GFP熒光細(xì)胞(GFP+細(xì)胞)的病毒稀釋梯度，同時記錄下該梯度病毒稀釋液感染的細(xì)胞中各孔中熒光細(xì)胞的數(shù)目，取平均值根據(jù)以下公式計算病毒滴度(BT=TU/ml)：病毒滴度(TU/ml)=(熒光細(xì)胞數(shù)/每孔加入病毒稀釋液體積)×稀釋倍數(shù)。

1.5 Western blot 法檢測K15P蛋白的表達(dá) 將感染K15P重組慢病毒的細(xì)胞裂解、離心收集蛋白上清液并制樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜后，5%脫脂牛奶封閉，以兔抗GFP多克隆抗體為一抗，4 ℃孵育過夜。次日TBST洗膜，加1 ∶5 000的HRP標(biāo)記的山羊抗兔的二抗，室溫孵育2 h，洗膜后曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定 以實驗室保存的質(zhì)粒pFJ-K15P為模板，PCR擴(kuò)增K15P基因片段，在1 500 bp位置附近可見出現(xiàn)目的條帶。見圖1A。根據(jù)ClonExpressTMⅡ One Step Cloning Kit說明書進(jìn)行重組載體的構(gòu)建。經(jīng)Nhe I酶切后出現(xiàn)載體pCDH-CMV-GFP和K15P兩條帶，大小分別為6 947 bp和1 470 bp。見圖1B。重組慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行測序，并與GenBank中的K15P序列進(jìn)行比對，結(jié)果正確，證明重組質(zhì)粒連接成功。

圖1 K15P基因PCR擴(kuò)增及重組慢病毒載體的酶切鑒定

A：K15P基因PCR擴(kuò)增圖；B：重組慢病毒載體酶切鑒定圖；C：重組質(zhì)粒測序報告；M：DNA Marker;1：PCR對照組；2：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約1 500 bp；:3：重組pCDH-CMV-K15P-GFP質(zhì)粒；4：重組pCDH-CMV-K15P-GFP質(zhì)粒Nhe Ⅰ酶切

2.2 慢病毒的包裝及滴度測定 重組慢病毒載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK 293T細(xì)胞中，96 h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，表明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。收集對照組和慢病毒組的細(xì)胞上清液，分別測定對照組病毒滴度為1×107TU/ml，K15P慢病毒組病毒滴度為4×106TU/ml。見圖2。

圖2 慢病毒載體轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞狀態(tài)及慢病毒陽性對照組和重組慢病毒組滴度測定 ×100

A：慢病毒載體和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)48 h；B：慢病毒陽性對照組病毒做10-7稀釋后感染HEK 293T細(xì)胞72 h；C：重組慢病毒組病毒做10-7稀釋后感染HEK 293T細(xì)胞72 h；1：熒光顯微鏡；2：光學(xué)顯微鏡

2.3 慢病毒感染HEK 293T細(xì)胞后K15P蛋白的檢測 將相同體積的對照組和慢病毒組分別感染HEK 293T細(xì)胞，觀察GFP的表達(dá)情況，提取總蛋白，Western blot法檢測K15P蛋白的表達(dá)情況。見圖3。

圖3 Western blot 法檢測HEK 293T細(xì)胞中K15P蛋白的表達(dá)

A：對照組病毒感染細(xì)胞所得樣本；B：慢病毒組病毒感染細(xì)胞所得樣本

3 討論

KSHV又名卡波肉瘤相關(guān)皰疹病毒，為雙鏈DNA病毒，屬于γ皰疹病毒亞科[5]。KS是一種血管性惡性腫瘤， KSHV引起的相關(guān)腫瘤中KS發(fā)病率較高。研究[6]表明KS有4種不同的類型，地域型KS、經(jīng)典型KS、移植型KS和AIDS相關(guān)型KS。KS好發(fā)于皮膚，也可累及黏膜和內(nèi)臟器官，主要表現(xiàn)為全身或者局部出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞來源的高度血管化的贅生物[7]。KS的發(fā)病率通常在非洲及部分歐洲地區(qū)及地中海國家比較高，尤其在非洲撒哈拉沙漠以南地區(qū)更為流行。但近些年來在美洲地區(qū)、臺灣及韓國也出現(xiàn)卡波肉瘤病例[8-9]。我國KS的發(fā)病率較低，因此對KSHV的研究開展較晚，但近些年來，研究[10]顯示我國新疆地區(qū)典型KS發(fā)病率較高，而在其他區(qū)域或民族人群發(fā)病較罕見。

K15基因位于KSHV基因組的最右端，由8個外顯子構(gòu)成，編碼約45 ku，由12個跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成和1個位于細(xì)胞內(nèi)的C端的膜蛋白[3]。K15基因至少存在3種等位基因，分別為P、M和N型，N型僅在非洲南部有發(fā)現(xiàn)，P和M型有33%的同源區(qū)域，而KS病例中主要是P型[11]。位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的C端編碼一個保守的SH 2結(jié)構(gòu)域，能與酪氨酸激酶(Src)和腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子(TRAF)結(jié)合，進(jìn)一步激活JNK、ERK、MAPK等信號通路，發(fā)揮K15促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移和血管新生的作用[12-14]。

與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法比較，慢病毒載體的操作更復(fù)雜，既要和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，還要經(jīng)過病毒包裝，產(chǎn)生具有感染能力的病毒顆粒以感染宿主細(xì)胞，但慢病毒能介導(dǎo)將目的基因整合到宿主基因組中，有助于獲得目的基因長期穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，同時對于難以采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)染效率不高的細(xì)胞，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染就存在弊端，而從理論上說病毒能夠感染所有細(xì)胞，因而慢病毒較脂質(zhì)體更具優(yōu)勢[15]。

本實驗通過成功構(gòu)建慢病毒載體，包裝、濃縮產(chǎn)生高效表達(dá)K15P基因的慢病毒顆粒，感染HEK 293T細(xì)胞，Western blot法檢測到293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的K15P蛋白。本實驗結(jié)果為研究K15P基因在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的功能和KSHV的致病機(jī)制奠定了實驗基礎(chǔ)。

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Construction and the titer determination of lentivirus vector containing KSHV K15P gene

Xu Changqing1,2, Chen Wei1, Fang Yuan1, et al

(1DeptofMicrobiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032;2DeptofClinicalLaboratory,TheThirdPeople’sHospitalofHefei,Hefei230000)

ObjectiveToconstructthelentivirusvectorcontainingKaposisarcoma-associatedherpesvirus(KSHV)ORFK15Pandstudyitsexpressionandfunctionsin293Tcells.MethodsThegeneregionofK15P,whichwasamplifiedbyordinaryPCR,wasclonedintopCDH-CMV-GFPvectorwithNheIrestrictionenzyme.TherecombinantplasmidwasthentransientlytansfectedintoHEK293Tcell.ThepCDH-CMV-K15P-GFPplasmidwasco-transfectedwiththreeassistedplasmidsofpMDL-PRRE,pRSV-Rev,pMD2.gintoHEK293Tcelltoproducelentivirusparticlesafter96handWesternblotwasperformedtodetecttheexpressionofK15Pprotein.ResultsThelentivirusvectorwassuccessfullyconstructedandthetiteroflentiviruswas2×106transducingunits/mlatthetimeof96hoursafterco-transfected.ConclusionK15Pexpressionlentiviralvectorissuccessfullyconstructed.ItbuiltsanexperimentalbasisfortheK15Pfunctionalstudyin293Tcells.

Kaposisarcoma-associatedherpesvirus;K15Pgene;lentivirus

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.005.html

2016-06-02接收

國家自然科學(xué)基金 (編號：81271837)；安徽省高校省級科學(xué)研究項目(編號：KJ2012A161)；安徽醫(yī)科大學(xué)博士科研經(jīng)費資助項目(編號：XJ200914)

1安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，合肥 230032

2合肥市第三人民醫(yī)院檢驗科，合肥 230000

許常青，男，碩士研究生；

王林定，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail: wanglinding@ahmu.edu.cn

R 394.3；R 373.9

A

1000-1492(2016)10-1417-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.005