劉云云，向卉芬，曹云霞

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ANXA5單核苷酸多態(tài)性rs2306413在中國漢族人群中不明原因性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究

劉云云，向卉芬，曹云霞

目的 探討膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)基因內(nèi)含子2單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點rs2306413與中國漢族人群不明原因性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)之間的關(guān)系。方法 采用病例-對照研究的方法，對213例URSA患者和170例健康對照者ANXA5基因內(nèi)含子2區(qū)域的SNP位點rs2306413進行等位基因頻率和基因型分布分析。數(shù)據(jù)檢驗方法采用Pearsonχ2檢驗。結(jié)果rs2306413的等位基因在病例組和對照組中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)；rs2306413在病例組和

不明原因性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；膜聯(lián)蛋白A5；單核苷酸多態(tài)性；關(guān)聯(lián)分析

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrentspontaneousabortion,RSA)一般被定義為：與同一配偶連續(xù)發(fā)生的2次或2次以上的自然流產(chǎn)[1]。RSA是臨床上比較常見的妊娠并發(fā)癥，發(fā)生率大約為全部妊娠女性的1%～5%[2]。其病因復(fù)雜多樣，目前已知的病因包括染色體異常、生殖道解剖異常、內(nèi)分泌和免疫因素、感染因素等。流行病學(xué)研究[3]顯示，約有近半數(shù)的RSA患者，即便對上述已知的病因進行全面、仔細(xì)的排查后，仍不能確定其發(fā)病原因。這部分患者則被稱為不明原因性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplainedrecurrentspontaneousabortion，URSA)。RSA有較高的發(fā)病率，而臨床上目前尚沒有統(tǒng)一有效的治療方法，給育齡期婦女的身心及其家庭帶來了極大的打擊。因此，對于RSA進行病因?qū)W研究，以便有的放矢地制定統(tǒng)一、有效的診療方法顯得尤為重要。膜聯(lián)蛋白A5(annexinA5,AXNA5)是膜聯(lián)蛋白(annexin，ANX)家族中少數(shù)具有抗凝活性的一員，其功能多樣，研究[4]顯示其與細(xì)胞凋亡、凝血過程、骨骼的生長發(fā)育以及部分腫瘤如宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生相關(guān)。國外有不少相關(guān)文獻[5-7]對膜聯(lián)蛋白A5基因(ANXA5)單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)及相關(guān)單體型與RSA之間的關(guān)系進行了探討。研究[8]顯示ANXA5抗體在RSA患者中的水平下降。然而國內(nèi)目前對于ANXA5的研究大多停留在分子水平，鮮有關(guān)于ANXA5基因多態(tài)性的研究。該研究試圖從基因水平探討AXNA5基因內(nèi)含子2SNP與中國漢族人群URSA的關(guān)系，為認(rèn)識和了解URSA提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選取2013年1月～2014年6月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心就診的213例URSA患者和170例有活產(chǎn)史、無流產(chǎn)史的對照者分別納入病例組和對照組。對于URSA患者的診斷嚴(yán)格按照以下標(biāo)準(zhǔn)：① 同一對夫婦連續(xù)發(fā)生2次或者2次以上的自然流產(chǎn)；② 夫妻雙方染色體核型均正常；③ 超聲檢查無子宮、生殖道解剖異常；④ 血清學(xué)檢查已排除內(nèi)分泌因素(糖尿病、甲狀腺功能亢進、高泌乳素血癥)、免疫因素(抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗淋巴細(xì)胞毒試驗)、凝血異常(血栓性疾病或者血栓形成傾向)、感染(Torch病毒系列)等因素引起的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。對照者的入組標(biāo)準(zhǔn)為：有至少1次正常分娩史；無自然流產(chǎn)病史；夫妻雙方染色體核型均正常。本實驗嚴(yán)格遵守《赫爾辛基宣言》及其修正案的相關(guān)倫理條例，并順利通過安徽醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會的倫理審查。所有納入本實驗的患者在詳細(xì)知情后簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集及儲存 每位被納入本研究的患者均由實驗人員采集5ml的靜脈血于5mlEDTA抗凝真空管中，并儲存在-80 ℃超低溫冰箱作為實驗標(biāo)本來源。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取基因組DNA使用QIAampDNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，按照試劑盒內(nèi)所提供的說明書從全血標(biāo)本中提取基因組DNA。

1.3.2 設(shè)計引物 從UCSC數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/)中下載人AXNA5基因內(nèi)含子1區(qū)域5′端附近包含rs2306413在內(nèi)的1 000bp的堿基序列，利用引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0設(shè)計引物。并參照引物設(shè)計的基本原則，從軟件生成的引物中挑選出最合適的一對(上游引物：5′-GATGATTTTGTCTCGCC-3′；下游引物：5′-ATGTGAGGCGAACGCA-3′)送至北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司進行合成。

1.3.3 目的片段擴增 采用25μlPCR體系對目的片段進行擴增。PCR參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性3min，然后95 ℃變性30s，52.3 ℃退火30s，72 ℃延伸1min30s，循環(huán)35次，最后72 ℃延長8min。取2μlPCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠-溴化乙錠染色法電泳。

1.3.4 測序 通過紫外線凝膠成像分析儀觀測記錄PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，將顯帶清晰且位置正確的PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因公司測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用STATA16.0軟件進行分析，對對照組樣本基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinbergequilibrium,HWE)檢驗，若P>0.05，提示樣本代表性好。對病例組和對照組樣本rs2306413位點的等位基因頻率和基因型頻率進行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析 病例組URSA患者的平均年齡為(28.66±4.27)歲，平均流產(chǎn)次數(shù)(2.48±0.59)次。對照組平均年齡為(31.23±4.19)歲，平均流產(chǎn)次數(shù)0次。

2.2HWE檢驗 經(jīng)STATA軟件計算出對照組樣本中的基因型分布HWE檢驗P=0.142。P>0.05，提示對照組rs2306413位點的基因型分布均符合人群正常遺傳規(guī)律，樣本代表性好。

2.3 等位基因頻率和基因型頻率的關(guān)聯(lián)分析rs2306413的等位基因分布在病例組和對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)，且G等位基因為危險等位基因[比值比(oddsratio,OR)=1.526，95%置信區(qū)間(confidenceinterval, CI):1.127～2.066]。rs2306413的基因型在病例組和對照組中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)。見表1。隱性模型下，rs2306413的基因型在病例組和對照組中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，含GG純合基因型的婦女患URSA的風(fēng)險顯著升高(OR=3.039，95% CI：1.499～6.159)。而顯性模型下，rs2306413的基因型在病例組和對照組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表1rs2306413等位基因和基因型在病例組和對照組中的分布(n)

rs2306413病例組(n=213)對照組(n=170)χ2值P值OR值(95%CI)等位基因 A2592397．4960．0061．526 G167101(1．127～2．066)基因型 AA838010．5840．005 AG9379- GG3711

表2 不同遺傳模式下rs2306413基因型在病例組和對照組中的分布(n)

3 討論

妊娠期間母體血容量增加，血液中凝血因子和纖溶酶原數(shù)量改變，凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)達(dá)到新的平衡，使得血液呈高凝狀態(tài)，稱為妊娠期生理性高凝狀態(tài)。而當(dāng)血液中的凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)失衡，則很容易導(dǎo)致血栓形成傾向。對于血栓形成傾向或者遺傳性易栓癥與RSA之間的關(guān)系已經(jīng)有很多人都進行了探討[9-12]。ANXA5作為膜聯(lián)蛋白家族中數(shù)量最多、分布最廣的一類，廣泛存在于滋養(yǎng)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種組織中。其結(jié)構(gòu)呈凹凸兩面的圓盤狀，凸面上有可以和鈣離子以及磷脂結(jié)合的位點，其功能多種多樣，與細(xì)胞凋亡、凝血過程、骨骼的生長發(fā)育、鈣離子通道作用等多種生理過程以及部分腫瘤如宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生相關(guān)[4]。本研究最關(guān)注的是ANXA5的抗凝作用。

不論是內(nèi)源性凝血途徑還是外源性凝血途徑，凝血因子復(fù)合物的形成必須要依賴磷脂，尤其是磷脂中的磷脂酰絲氨酸的存在。妊娠時胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)ANXA5[13]，在鈣離子存在的情況下，ANXA5與胎盤絨毛細(xì)胞膜表面的磷脂結(jié)合，在細(xì)胞膜表面排列成二維的晶體結(jié)構(gòu)，形成一道保護屏障，使凝血因子接觸不到磷脂，凝血因子復(fù)合物形成受阻，從而起到抗凝、維持正常妊娠的作用。一旦ANXA5在細(xì)胞膜表面形成的這種保護性屏障遭到破壞，或者由于抗磷脂抗體的拮抗使得細(xì)胞膜表面ANXA5數(shù)量減少，就有可能引起早期的流產(chǎn)[14-15]。 研究[16]顯示，RSA患者的血漿ANXA5水平較對照組降低，也從側(cè)面證實了這一理論。此外，ANXA5還可以與被激活的血小板表面的磷脂結(jié)合，通過抑制血小板的活性，而起到抗凝作用。

近年來不少國外學(xué)者都對ANXA5基因的SNP及其基因型和RSA之間的關(guān)系進行了探討。Miyamuraetal[5]研究發(fā)現(xiàn)，ANXA5基因啟動子區(qū)的rs1050606位點在RSA患者中的次要等位基因頻率明顯高于對照組(P=0.002)。Hayashietal[17]在一項病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，rs1050606位點的等位基因頻率在RSA患者和對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義；且首次運用該多態(tài)性位點來評估RSA患者的妊娠結(jié)局。而國內(nèi)目前對于ANXA5的研究多在分子水平，鮮有關(guān)于ANXA5基因多態(tài)性的研究。ANXA5基因位于染色體4q27，共包含13個外顯子和12個內(nèi)含子。由于外顯子的突變可以直接改變基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，影響氨基酸的合成和蛋白質(zhì)的功能，因此一直以來對外顯子的研究比較多，涉及內(nèi)含子的功能研究相對較少。然而內(nèi)含子序列占人類基因組的絕大部分，其也可通過影響mRNA剪切和增強基因表達(dá)等方式對疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要的影響。因此，對內(nèi)含子上基因遺傳多態(tài)性的研究也具有重要意義。本實驗通過對ANXA5基因內(nèi)含子2上的多態(tài)性位點rs2306413和URSA之間的關(guān)系進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示rs2306413位點的等位基因和基因型分布在病例組和對照組中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，隱性遺傳模式下，rs2306413位點GG純合基因型增加URSA的患病風(fēng)險。這些都提示ANXA5基因上的多態(tài)性位點rs2306413 和URSA相關(guān)，且G等位基因是URSA的危險基因。

綜上所述，URSA是一個多因素影響的復(fù)雜性疾病。雖然本實驗證實rs2306413位點和中國漢族人群的URSA發(fā)生相關(guān)，然而其對ANXA5基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的調(diào)控機制以及可能引起URSA的發(fā)病機制目前尚不清楚。今后應(yīng)擴大樣本量并加大研究深度，從SNP的功能驗證和調(diào)控機制等方面繼續(xù)研究該位點與URSA之間的關(guān)系，為完善URSA的病因研究和尋找治療方法提供新思路。

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SNP in the intron 2 of ANXA 5 gene may be a risk factor for URSA in the Han Chinese population

LiuYunyun,XiangHuifen,CaoYunxia

(Reproductive Medicine Center, Dept of Obstetrics and Gynecology,The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Institute of Reproductive Genetics, Anhui Medical University,Anhui Provincial Engineering Technology Research Center for Biopreservation and Artificial Organs, Hefei 230022)

Objective To investigate the association between SNP rs2306413 and URSA in the Han Chinese population.Methods A total of 213 Han Chinese women with URSA and 170 fertile healthy controls were recruited in this case-control study. Allele frequency and genotype distribution of URSA patients and controls were determined. The Pearson chi-square test was used for analysis.Results rs2306413 showed a significant association with URSA cases compared with the controls(P=0.006). Genotype distribution of rs2306413 in the case group and the control group was statistically different(P=0.005) .The GG genotype increased the risk for URSA(OR=3.039, 95%CI:1.499～6.159).Conclusion rs2306413 may be a risk factor for URSA in the Han Chinese population.

URSA; ANXA5; SNP;association study

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.027.html

2016-07-06接收

國家自然科學(xué)基金面上項目(編號：81370691)；安徽醫(yī)科大學(xué)國家創(chuàng)新研究群體科學(xué)基金獲得者培育計劃(編號：GJCXQT-1403)

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，安徽醫(yī)科大學(xué)生殖與遺傳研究所，安徽省生命資源保存與人工器官工程技術(shù)研究中心，合肥 230022

劉云云，女，碩士研究生；

曹云霞，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：caoyunxia6@126.com

對照組中的基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)；攜帶GG純合基因型的患者患URSA的風(fēng)險增加(OR=3.039, 95%CI：1.499～6.159)。結(jié)論ANXA5的單核苷酸多態(tài)性rs2306413可能是中國漢族人群中URSA發(fā)生的一個危險因素。

R714.21

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.027