鄧 杰，解明然，郭明發(fā)，柳常青，孫翔翔，徐美青

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胸苷酸合成酶檢測指導(dǎo)肺腺癌患者術(shù)后輔助化療的臨床研究

鄧 杰，解明然，郭明發(fā)，柳常青，孫翔翔，徐美青

目的 評估胸苷酸合成酶(TS)檢測指導(dǎo)肺腺癌患者根治術(shù)后行奈達鉑聯(lián)合培美曲塞方案化療的臨床意義。方法 回顧性分析166例ⅠB～ⅢA期肺腺癌患者的臨床資料。其中研究組94例，經(jīng)免疫組化檢測結(jié)果顯示全部為TS低表達患者；對照組72例，未行TS檢測。兩組均予以奈達鉑聯(lián)合培美曲塞方案化療，比較兩組患者的臨床病理特征、中位無病生存期、3年無病生存率、3年總生存率以及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)情況。結(jié)果 兩組患者臨床病理特征差異無統(tǒng)計學意義。研究組患者的中位無病生存期為43.0個月，1年、2年、3年無病生存率分別為90.4%、76.6%、61.7%，觀察組患者中位無病生存期為29.9個月，1、2、3年無病生存率分別為87.5%、66.7%和52.5%，兩組無病生存率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.035)。研究組患者的3年總生存率優(yōu)于觀察組患者(67.7% vs 56.4%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。研究組中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移41例(43.6%)，觀察組中復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移43例(59.7%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.04)。多因素分析結(jié)果顯示吸煙史、T分期、N分期及病理分期為患者的獨立預(yù)后因素。結(jié)論TS表達狀況與肺腺癌患者術(shù)后接受奈達鉑聯(lián)合培美曲塞化療方案有效率有一定相關(guān)性，通過免疫組化法對肺腺癌患者術(shù)后大體標本行TS檢測可篩選培美曲塞化療的獲益人群。

癌；腺癌；非小細胞肺癌；胸苷酸合成酶；培美曲塞；預(yù)后

肺癌目前是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。其中腺癌已經(jīng)超過鱗癌成為目前肺癌最主要的病理類型，可能和目前工業(yè)環(huán)境、吸煙人群增加有關(guān)[2]。手術(shù)仍是目前早中期肺腺癌最主要的治療方式，通過術(shù)后輔助化療可以提高肺腺癌患者的生存率[3]。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南指出鉑類聯(lián)合培美曲塞已成為肺腺癌的一線化療方案，相比傳統(tǒng)的鉑類聯(lián)合吉西他濱化療，其療效更高，化療毒副作用更低。培美曲塞是一種干擾細胞內(nèi)葉酸代謝的抗腫瘤藥物，胸苷酸合成酶(thymidylatesynthase,TS)為其主要作用靶點。文獻[4]報道培美曲塞的化療療效和TS的表達有關(guān)，TS可能會成為肺癌患者培美曲塞方案化療的預(yù)后因素。因此理論上檢測肺腺癌患者中TS表達情況可能會有助于篩選肺腺癌患者培美曲塞化療的受益人群。該研究收集接受根治性肺癌切除術(shù)且術(shù)后病理診斷為肺腺癌的ⅠB～ⅢA期患者166例,所有患者術(shù)后予以培美曲塞聯(lián)合奈達鉑方案化療；其中94例經(jīng)免疫組化檢測為TS低表達患者，72例未行免疫組化檢測，比較兩組的臨床病理特征、預(yù)后生存、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。

1 材料與方法

1.1 病例資料 回顧性分析2010年6月～2014年6月于安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院胸外科行肺癌根治術(shù)、術(shù)后病理確診為肺腺癌的患者195例，病例納入標準：① 術(shù)后病理證實為肺腺癌，根據(jù)UICC分期診斷為ⅠB～ⅢA期；② 手術(shù)為R0切除；③ 術(shù)后行奈達鉑聯(lián)合培美曲塞方案化療4療程；④ 術(shù)前未行放化療治療；剔除標準：① 非根治性手術(shù)；② 術(shù)后輔助化療<4周期；③ 術(shù)前或術(shù)后口服分子靶向藥物治療；④ 病例資料不完整?；谝陨蠘藴?，共166例患者納入本研究，其中男94例，女72例；年齡32～76歲，中位年齡57歲；ⅠB期62例，Ⅱ期61例，ⅢA期43例。研究組經(jīng)免疫組化檢測全部為TS低表達患者(n=94)，對照組未行TS檢測(n=72)。

1.2 方法

1.2.1 術(shù)后輔助化療方案 患者術(shù)后2～4周內(nèi)，研究組和對照組均采用奈達鉑聯(lián)合培美曲塞方案化療，培美曲塞500mg/m2靜脈滴注第1天，奈達鉑75mg/m2治療第1天，治療期間補充葉酸和維生素。21d為1周期，共治療4周期。

1.2.2 免疫組化法檢測TS表達 腫瘤石蠟切片脫蠟至水，放入3%雙氧水, 室溫孵育5～10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡2次，每次5min(如需抗原修復(fù)，可在此步后進行)；5%～10% 正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37 ℃ 孵育1～2h或4 ℃ 過夜；PBS沖洗3次，每次5min；滴加適量生物素標記二抗工作液，37 ℃ 孵育10～30min；PBS沖洗3次，每次5min； 滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～30min；PBS沖洗3次，每次5min；顯色劑顯色3～15min(DAB或NBT/BCIP)；自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。試劑購自邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.3 判定標準 低表達：以片中的非腫瘤細胞作為參照，強度為0，腫瘤細胞核染色強度分為0、1(低)、2(一般)、3(高)。強度0、1、2為低表達；強度為3，染色細胞數(shù)≤1也為低表達。強度為3，染色細胞數(shù)在2個以上則為高表達。

1.3 觀察指標 比較分析研究組與對照組患者的臨床病理特征、中位無病生存期、3年無病生存率、3年總生存率及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。

1.4 隨訪情況 患者術(shù)后采用門診復(fù)查或電話隨訪等方式，術(shù)后第1年每3個月隨訪1次，第2年每半年隨訪1次，從第3年起每1年隨訪1次，隨訪截止到2015年9月，獲取患者的的相關(guān)臨床信息和生存情況，包括影像學檢查(胸腹部CT、頭顱磁共振、骨掃描、PET-CT等)及病理穿刺檢查結(jié)果等。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行分析。計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗，應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，運用Logrank檢驗進行生存過程的比較；使用Cox比例風險模型考察患者預(yù)后影響因素。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1TS在肺腺癌中的表達情況以及兩組患者臨床病理特征的比較 免疫組化結(jié)果顯示，TS蛋白陽性表達的肺腺癌細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1)。兩組患者在性別、年齡、吸煙、腫瘤分化程度、原發(fā)灶分期(T分期)、淋巴結(jié)分期(N分期)、病理分期上比較差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

2.2 兩組患者的隨訪、預(yù)后及生存情況 166例患者中，隨訪150例(90.4%)，中位隨訪時間為34個月。全組患者的中位無病生存期為37.5個月，1、2、3年無病生存率分別為92.2%、67.5%、50.3%。研究組患者的中位無病生存期為43.0個月，1、2、3年無病生存率分別為90.4%、76、6%、61.7%。對照組患者的中位無病生存期為29.9個月，1、2、3年無病生存率分別為87.5%、66.7%、52.5%。研究組患者無病生存率優(yōu)于對照組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.035)。見圖2。

表1 患者的臨床病理特征比較[n(%)]

圖1 免疫組化法DAB染色檢測TS在腺癌組織中的表達情況

圖2 TS低表達組與TS未檢測組患者的無病生存曲線比較

2.3 隨訪情況 在隨訪過程中，166例患者局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移84例(50.6%)，其中死亡23例。研究組94例患者中局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移41例(43.6%)，其中死亡12例。對照組患者中局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移43例(59.7%)，其中死亡11例。兩組患者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.04)。

2.4 影響鉑類聯(lián)合培美曲塞化療的肺腺癌患者預(yù)后的多因素分析 吸煙、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及病理分期為肺腺癌患者的獨立預(yù)后因素(P<0.05)。見表2。

表2 166例肺腺癌患者預(yù)后影響因素的Cox比例風險模型分析

3 討論

培美曲塞是一種新型抗葉酸代謝藥物，能夠干擾葉酸代謝及DNA合成來抑制腫瘤生長[5]。培美曲塞作用的靶點之一就是TS，TS是胸苷酸合成的限速酶，而胸苷酸是胸腺嘧啶合成所必須的原料，培美曲塞對胸苷酸合成酶的抑制，導(dǎo)致DNA合成所需要的胸腺嘧啶減少，使得細胞增殖減少，所以培美曲塞能夠作用于增殖程度明顯的腫瘤細胞來達到抑制腫瘤生長的目的[6]。文獻[7]報道，采用含培美曲塞方案化療的患者，TS低表達的非小細胞肺癌患者其生存率高于TS高表達者，提示TS低表達可能是培美曲塞治療肺癌患者的生存預(yù)測因素。本研究顯示ⅠB～ⅢA期肺腺根治術(shù)后患者采用奈達鉑聯(lián)合培美曲塞方案化療，研究組較對照組有更高的無病生存率，進一步論證了TS低表達可能是肺腺癌患者行培美曲塞方案化療的預(yù)后影響因素。

研究[8]顯示，在肺腺癌、鱗癌、小細胞肺癌、大細胞肺癌及腺鱗癌的幾種病理類型中，TS基因在腺癌組織中表達水平低于其他病理類型肺癌，這就提示培美曲塞用于肺腺癌患者可能有更高的敏感性。Nakagawaetal[9]回顧性分析了104例I期肺腺癌根治術(shù)后行培美曲塞聯(lián)合鉑類方案化療的患者，TS低表達患者的5年生存率為86.1%，而TS高表達患者為72.0%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.048)。Wangetal[10]進行的一項Meta分析顯示，526例Ⅰ ～Ⅳ期非小細胞肺癌患者行鉑類聯(lián)合培美曲塞方案化療，TS低表達患者的無病生存期及總生存期高于TS高表達患者(P=0.004)。一項前瞻性隨機對照研究[11]顯示，共315例非鱗非小細胞肺癌患者納入研究，結(jié)果顯示，在TS陰性組中培美曲塞聯(lián)合順鉑療效優(yōu)于吉西他濱聯(lián)合順鉑，而在TS陽性組中則無此現(xiàn)象，說明TS蛋白表達水平是培美曲塞方案化療潛在的療效預(yù)測指標。本研究結(jié)果顯示，TS未檢測組患者1、2、3年無病生存率分別為87.5%、66.7%、52.5%，TS低表達組患者1、2、3年無病生存率分別為90.4%、76.6%、61.7%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。導(dǎo)致該結(jié)果出現(xiàn)的原因可能在于，未檢測組患者中可能有部分TS高表達患者，通過行TS檢測，可以減少盲目化療患者。多因素分析結(jié)果顯示，吸煙是肺腺癌患者的獨立預(yù)后因素。Ceppietal[12]發(fā)現(xiàn)吸煙患者中TS表達水平更高，特別是在肺腺癌患者中表現(xiàn)明顯，這從側(cè)面反映TS可能是肺腺癌患者的一個預(yù)后監(jiān)測指標。

培美曲塞用于非小細胞肺癌一線和二線治療取得了很好的療效，也有報道培美曲塞用于進展期非小細胞肺癌的三線甚至四線治療也取得了滿意效果，同時顯示化療療效和TS表達有明顯的相關(guān)性[13]。通過TS檢測，篩選出TS低表達患者用培美曲塞方案化療，可以提高肺腺癌患者的生存期，但仍有相當一部分患者發(fā)生局部或者遠處轉(zhuǎn)移甚至死亡，可能有以下幾點原因：① 部分患者出現(xiàn)了培美曲塞耐藥，文獻[14]報道 ，體外培養(yǎng)的培美曲塞耐藥細胞株中，TS表達水平會上調(diào)；② 檢測方法差異導(dǎo)致TS表達高低檢測不準確。免疫組化法是在蛋白質(zhì)水平上來檢測TS表達，以腫瘤細胞核染色強度和染色細胞數(shù)的多少來判定TS表達高低，因缺乏統(tǒng)一的評分標準，這可能會導(dǎo)致TS判定結(jié)果有差異，一些TS高表達患者檢測成TS低表達患者而使用了培美曲塞方案化療，導(dǎo)致化療不敏感。有研究者[15]在基因水平上行TS檢測，即RT-PCR(reversetranscriptasePCR)方法，發(fā)現(xiàn)RT-PCR檢測優(yōu)于免疫組化，TS基因檢測可能會篩選更多的培美曲塞化療獲益人群，研究[10]表明，免疫組化檢測方法在預(yù)測培美曲塞對TS表達水平敏感性方面優(yōu)于RT-PCR。兩者之間的差異需要更多的臨床證據(jù)支持，同時TS檢測也需要更敏感的免疫組化檢測系統(tǒng)及更為規(guī)范的評分標準。

綜上所述，吸煙、T分期、N分期、病理分期是ⅠB～ⅢA期肺腺癌患者的獨立預(yù)后因素。TS低表達患者用培美曲塞方案化療可以獲得更好的預(yù)后生存，通過免疫組化法檢測肺腺癌患者的TS表達水平，可以篩選肺腺癌患者培美曲塞方案化療的獲益人群。但本研究為單中心回顧性分析，存在一定的病例選擇性偏倚。同時本研究采用免疫組化法檢測TS蛋白表達，可能存在一定的檢驗誤差，對照組未行TS檢測，也是本研究的不足之處，因此本研究結(jié)果有待更為規(guī)范及精確的前瞻性隨機對照研究驗證。

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Clinical study on thymidylate synthase test for guiding postoperative adjuvant chemotherapy in patients with lung adenocarcinoma

DengJie,XieMingran,GuoMingfa,etal

(Dept of Thoracic Surgery, The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001)

Objective To evaluate the clinical significance of thymidylate synthase (TS) test for guiding combined chemotherapy with Nedaplatin and Pemetrexed after radical operation for lung adenocarcinoma.Methods A retrospective review was conducted on clinical data from 166 patients with lung adenocarcinoma from stage ⅠB～ⅢA. A total of 94 patients were assigned to the study group, and immunohistochemical tests showed that they were all patients with low expression of TS. On the other hand, 72 patients who didn′t undergo TS test were assigned to the control group. Both groups received combined chemotherapy with Nedaplatin and Pemetrexed. Clinicopathologic features, median disease-free survival time(mDFS), 3 years disease-free survival(DFS), 3-year survival as well as metastasis and recurrence situations were compared between the two groups.Results No statistical difference in clinicopathologic features was found between the two groups. The median disease-free survival time, 1-year, 2-year and 3-year DFS in the study group were respectively 43.0 months, 90.4%, 76.6% and 61.7%, and the indicators above in the control group were respectively 29.9 months, 87.5%, 66.7% and 52.5%. The statistical difference was significant(P=0.035). Three-year survival of the study group was higher than that of the control group(67.7%vs56.4%), with a significant difference(P<0.05). A total of 41 cases(43.6%) of metastasis or recurrence were found in the study group, while 43 cases(59.7%) were found in the control group,and the statistical difference was significant(P=0.04). Multi-factor analysis showed that a history of smoking,T-staging, N-staging and pathological staging were independent prognostic factors for these patients.Conclusion There is a correlation between the expression status of TS and the efficacy of postoperative chemotherapy with Nedaplatin and Pemetrexed in patients with lung adenocarcinoma. A TS test on the postoperative gross specimen for patients with lung adenocarcinoma through immunohistochemical method can screen out those patients who benefited from Pemetrexed chemotherapy.

carcinoma; adenocarcinoma; NSCLC;thymidylate synthase;pemetrexed;prognosis

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.025.html

2016-06-23接收

衛(wèi)生部腫瘤個體化治療分子診斷技術(shù)臨床應(yīng)用研究課題(編號：W2012FZ115)

安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院胸外科，合肥 230001

鄧 杰，男，碩士研究生；

徐美青，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：xmqahslyy@163.com

R73

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.025