何 薇，耿慧武，左 恒，阮 操，潘林鑫，范禮斌，劉曉穎

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◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

FK506結(jié)合蛋白25及其突變體與CLIC1蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)共定位的研究

何 薇1，耿慧武1，左 恒2，阮 操2，潘林鑫1，范禮斌1，劉曉穎1

目的 研究FK506結(jié)合蛋白25(FKBP25)野生型及其突變體在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位及與胞內(nèi)氯離子通道蛋白1(CLIC1)的共定位情況。方法 以pcDNA3.1-FKBP25-FLAG為模板，分別構(gòu)建以pCDGFP為載體的FKBP25野生型及其缺失突變體FKBP25(1～42 aa)、FKBP25(1～110 aa)、FKBP25(43～224 aa)、FKBP25(43～110 aa)、FKBP25(111～224 aa)的真核表達(dá)質(zhì)粒，并分別轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞中，Western blot法檢測重組蛋白表達(dá)情況；將上述質(zhì)粒分別與帶FLAG標(biāo)簽的CLIC1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察、分析熒光共定位情況。結(jié)果 成功構(gòu)建了pCDGFP-FKBP25基因的一系列真核表達(dá)質(zhì)粒；Western blot顯示：pCDGFP-FKBP25及其突變體pCDGFP-FKBP25(1～42 aa)、pCDGFP-FKBP25(1～110 aa)、pCDGFP-FKBP25(43～110 aa)、pCDGFP -FKBP25(43～224 aa)、pCDGFP-FKBP25(111～224 aa)均能在HEK 293T細(xì)胞中有效表達(dá)；GFP-FKBP25野生型在COS7細(xì)胞中主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中表達(dá)較少，而突變體在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均有表達(dá)，而且細(xì)胞核中的表達(dá)多于野生型。共定位實驗結(jié)果表明：野生型FKBP25蛋白與CLIC1蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在明顯的共定位現(xiàn)象。其3個缺失突變體與CLIC1蛋白的共定位明顯減少，而且共定位也存在區(qū)別：FKBP25-N與CLIC1共定位主要于細(xì)胞核中，部分分布于細(xì)胞質(zhì)；FKBP25-PC和FKBP25-C與CLIC1只共定位于細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)論 熒光共定位實驗觀察到FKBP25野生型及其3種突變體FKBP25(1～42 aa)、FKBP25(43～224 aa)、FKBP25(111～224 aa)與CLIC1蛋白存在不同程度的共定位現(xiàn)象，為進(jìn)一步揭示FKBP25的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。

FKBP25；轉(zhuǎn)染；基因表達(dá)；共定位

FK506結(jié)合蛋白(FK506 binding proteins，F(xiàn)KBP)是高度保守的分子伴侶蛋白家族，能與FK506和雷帕霉素(RAPA)結(jié)合[1]。該家族廣泛存在于真核生物中，不同生物之間FKBP的同源性很高，在生物進(jìn)化過程中具有高度的保守性。研究[2]表明該家族成員都具有肽基脯氨酸異構(gòu)酶(PPIase)活性，且該部分的氨基酸序列具有高度的保守性。FKBP25(又稱為FKBP3)蛋白分子量約為25 ku，首次純化于牛腦中，是FKBP家族中唯一的核DNA結(jié)合蛋白，可以與免疫抑制劑很好地結(jié)合，發(fā)揮免疫抑制的作用[3]。前期實驗通過酵母雙雜交技術(shù)以CLIC1蛋白作為誘餌，篩選人胎盤cDNA基因文庫，篩選出其中之一的FKBP25蛋白可以和CLIC1蛋白相互作用。該研究通過構(gòu)建FKBP25野生型與突變體表達(dá)質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中，檢測其表達(dá)及定位情況，并了解其在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)與CLIC1的共定位情況，對FKBP25與CLIC1的相互作用進(jìn)行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 所用細(xì)胞、感受態(tài)、載體及模板質(zhì)粒均由安徽醫(yī)科大學(xué)生物實驗室保存，引物均由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建[4]設(shè)計構(gòu)建pCDGFP載體的FKBP25野生型及突變體質(zhì)粒，根據(jù)目的基因序列和引物設(shè)計原則設(shè)計特異性PCR引物，具體序列見表1。運(yùn)用PCR法以pcDNA3.1-FKBP25-FLAG(安徽醫(yī)科大學(xué)生物實驗室保存)質(zhì)粒為模板，以50 μl PCR體系分別進(jìn)行擴(kuò)增，模板DNA 1 μl ，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl ，PrimeSTAR酶22 μl，加高純水至50 μl，30個循環(huán)，根據(jù)說明書中PCR反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)。擴(kuò)增的野生型及突變體片段FKBP25(1～42 aa)、FKBP25(1～110 aa)、FKBP25(43～224aa)、 FKBP25(43～110 aa)、FKBP25(111～224 aa)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和凝膠回收試劑盒回收。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對pCDGFP載體和PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切：BamHⅠ、 EcoR Ⅰ。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠回收試劑盒回收，用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于TG1感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含氨芐抗性的固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)(10～12 h)，待長出克隆后挑取單克隆至含有氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。堿裂解法抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定，選擇鑒定正確的質(zhì)粒送安徽通用生物系統(tǒng)有限公司測序。

表1 引物序列

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前24 h，對HEK 293T細(xì)胞(本實驗室保存)進(jìn)行正常傳代，以較高的密度將細(xì)胞接種至無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中。實驗中，根據(jù)所使用細(xì)胞量選擇不同規(guī)格培養(yǎng)皿。在蛋白表達(dá)實驗，以1×105～2×105細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞接種至無雙抗培養(yǎng)基35 mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時轉(zhuǎn)染。在熒光定位實驗中，對COS7細(xì)胞進(jìn)行正常傳代，在35 mm培養(yǎng)皿中放入1張無菌蓋玻片，并用多聚賴氨酸進(jìn)行包被，充分晾干，以1×104～2×104/cm2的密度接種于含有蓋玻片的無雙抗培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞匯合度達(dá)到30%～40%時轉(zhuǎn)染。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜。按照脂質(zhì)體試劑盒提供的方法進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗，置培養(yǎng)皿于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6 h后，換新鮮的無雙抗DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot法檢測[5]轉(zhuǎn)染后約48 h，棄培養(yǎng)液，胰酶消化法收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞后離心，保留上清液并進(jìn)行蛋白定量。取30 μg總蛋白與等體積2×SDS上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，冰浴2 min。進(jìn)行 SDS-PAGE電泳約2 h，電泳分離的蛋白用100 V恒壓濕轉(zhuǎn)1 h至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的1×TBST溶液封閉2 h，TBST洗滌后加FLAG一抗(1 ∶500，用一抗稀釋液稀釋)4 ℃過夜孵育，用TBST洗膜后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1 ∶5 000，用1×TBST溶液稀釋)室溫孵育2 h，1×TBST洗膜后用ECL試劑盒顯色，在暗室中用X線片曝光并顯影和定影，X線片晾干后掃描。

1.2.4 免疫熒光觀察[6]轉(zhuǎn)染后約24 h，取出COS7細(xì)胞(本實驗室保存)爬片，PBS清洗3次以洗去殘留的培養(yǎng)基；-20 ℃預(yù)冷的甲醇固定3 min，70%的乙醇固定5 min，PBS清洗3次，每次5 min；含1%脫脂奶粉的1×TBST溶液封閉30 min；FLAG一抗(1 ∶100，用封閉液配制)室溫孵育2 h；封閉液清洗3次，每次5 min；TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗(1 ∶100，用1×TBST配制或用封閉液配制)室溫孵育1 h；1×PBS清洗4次，每次5 min；0.15 g/L DAPI溶液染核，室溫3 min；1×PBS清洗4次，每次5 min；用吸水紙盡可能吸去蓋玻片上的溶液(切勿過于干燥)，熒光封片膠Dako封片。4 ℃儲存過夜后用激光共聚焦掃描顯微鏡(德國Leica公司)觀察并掃描拍照。

2 結(jié)果

2.1 pCDGFP-FKBP25及其突變體真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)FKBP25蛋白的結(jié)構(gòu)分析(圖1)，N端有一個特殊的且?guī)в姓姾傻沫h(huán)狀結(jié)構(gòu)HLH(helix-loop-helix)，C端擁有一段保守核苷酸序列即FK506/雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，故將FKBP25劃分不同區(qū)域，并構(gòu)建GFP標(biāo)簽的突變體表達(dá)質(zhì)粒。對抽提的pCDGFP-FKBP25及各突變體質(zhì)粒分別進(jìn)行BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2，以上質(zhì)粒都被切出2條亮帶，經(jīng)過與Marker和PCR產(chǎn)物比對，顯示泳道1條帶大小約為6 100 bp，與載體pCDGFP的大小基本一致，2～7泳道都有較亮的PCR產(chǎn)物條帶，分別與各目的片段大小一致[FKBP25(1～224 aa)為672 bp，F(xiàn)KBP25(1～42 aa)為129 bp，F(xiàn)KBP25(1～110 aa)為330 bp，F(xiàn)KBP25 (43～224 aa)為543 bp，F(xiàn)KBP25(43～110 aa)為201 bp，F(xiàn)KBP25(111～224 aa)為339 bp]，表明載體與各目的片段連接成功，通用公司測序結(jié)果進(jìn)一步證實了質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 FKBP25蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 重組質(zhì)粒pCDGFP載體FKBP25野生型及突變體的酶切鑒定

M1:Lambda DNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ Marker；M2: TaKaRa DL 2 000 Marker;1：酶切后的pCDGFP載體；2、8：FKBP25(1～224 aa)的PCR產(chǎn)物和酶切鑒定結(jié)果；3、9：FKBP25(1～42 aa) 的PCR產(chǎn)物和酶切鑒定結(jié)果；4、10：FKBP25(1～110 aa) 的PCR產(chǎn)物和酶切鑒定結(jié)果；5、11：FKBP25(43～224 aa) 的PCR產(chǎn)物和酶切鑒定結(jié)果；6、12：FKBP25(43～110 aa) 的PCR產(chǎn)物和酶切鑒定結(jié)果；7、13：FKBP25(111～224 aa) 的PCR產(chǎn)物和酶切鑒定結(jié)果

2.2 GFP-FKBP25及其突變體在HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，Western blot法檢測蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示GFP-FKBP25及其突變體在HEK 293T細(xì)胞中均能夠表達(dá)，見圖3。所顯影條帶均符合目的蛋白大小，pCDGFP-FKBP25、pCDGFP-FKBP25(1～42 aa)、pCDGFP-FKBP25(43～224 aa)、pCDGFP-FKBP25(111～224 aa) 、pCDGFP-FKBP25(1～110 aa)、 pCDGFP-FKBP25(43～110 aa) 的分子量分別為50、30、45、37、37、32 ku。圖3A中3、4泳道顯影出條帶隨后重新上樣于曝光機(jī)顯影，見圖3B，所顯影條帶符合pCDGFP-FKBP25(1～110 aa)、 pCDGFP-FKBP25(43～110 aa)蛋白大小。

2.3 GFP-FKBP25及其突變體在COS7細(xì)胞中的定位 激光共聚焦掃描顯微鏡拍攝pCDGFP-FKBP25及其各突變體單轉(zhuǎn)至COS7細(xì)胞中的定位情況，F(xiàn)KBP25-GFP及其突變體分別與帶FLAG標(biāo)簽的CLIC1在COS7細(xì)胞中的共定位情況。

2.3.1 GFP-FKBP25及其3種突變體在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的定位 結(jié)果表明：FKBP25的GFP融合蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中也有少量分布；其突變體在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均有分布。但與野生型不同的是，突變體在細(xì)胞核中的分布明顯增多；GFP-FKBP25(1～110 aa)、GFP-FKBP25(43～110 aa)的熒光并未觀察到。見圖4。

圖3 Western blot法檢測pCDGFP-FKBP25及其各突變體在HEK 293T中的表達(dá)

A：Western blot法檢測pCDGFP-FKBP25及其各突變體在HEK 293T中的表達(dá)；1：轉(zhuǎn)染pCDGFP-FKBP25的細(xì)胞裂解液；2：轉(zhuǎn)染pCDGFP-FKBP25(1～42 aa)的細(xì)胞裂解液； 5：轉(zhuǎn)染pCDGFP-FKBP25(43～224 aa) 的細(xì)胞裂解液；6：轉(zhuǎn)染pCDGFP-FKBP25(111～224 aa) 的細(xì)胞裂解液；B：對應(yīng)圖A中的圖3、4；3：轉(zhuǎn)染pCDGFP-FKBP25(1～110 aa)的細(xì)胞裂解液；4：轉(zhuǎn)染pCDGFP-FKBP25(43～110 aa)的細(xì)胞裂解液

2.3.2 GFP-FKBP25及其突變體與CLIC1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位 共定位實驗觀察到GFP-FKBP25及其3種突變體都與CLIC1蛋白存在共定位的現(xiàn)象。野生型FKBP25蛋白與CLIC1蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在非常明顯的共定位現(xiàn)象。其3個缺失突變體與CLIC1蛋白的共定位明顯減少，而且共定位有兩種不同情況：一種主要共定位于細(xì)胞核，部分于細(xì)胞質(zhì)中：FKBP25-N與CLIC1蛋白；另一種主要共定位在細(xì)胞質(zhì)中：FKBP25-PC與CLIC1蛋白、FKBP25-C與CLIC1蛋白。見圖5。

圖4 GFP-FKBP25及其突變體

圖5 GFP-FKBP25及其突變體FKBP25-N(1～42 aa)、FKBP25-PC(43～224 aa)、FKBP25-C(111～224 aa)與CLIC1蛋白在COS7細(xì)胞中的共定位 ×600

3 討論

通過埃德曼降解分析FKBP25蛋白序列，得出該基因由兩個重要結(jié)構(gòu)域組成，分別位于其N、C端。通過進(jìn)一步分析，顯示該蛋白N端有一個特殊的且?guī)в姓姾傻沫h(huán)狀結(jié)構(gòu)HLH(helix-loop-helix)，C端擁有一段保守核苷酸序列即FK506/雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[7-8]。據(jù)此，本實驗將FKBP25蛋白人為分為幾部分，分別構(gòu)建缺失突變體的表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中觀察各截短體在細(xì)胞中的表達(dá)及定位情況。

CLIC1是細(xì)胞核內(nèi)的通道蛋白，CLIC1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖分化，并且參與造血細(xì)胞胰島素信號轉(zhuǎn)到通路過程中[9-11]。CLIC1和許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。CLIC1在鼻咽癌[12]、胃癌[13]、膽囊癌[14]、肝癌[15]中表達(dá)量升高，提示CLIC1可能作為一種腫瘤標(biāo)志物。本實驗室此前的酵母雙雜交實驗證實了FKBP25與CLIC1蛋白在酵母細(xì)胞中存在相互作用，因此，本實驗也將這些突變體表達(dá)質(zhì)粒與CLIC1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，觀察兩種蛋白在細(xì)胞中的共定位情況，為進(jìn)一步了解兩種蛋白的相互作用及其機(jī)制提供依據(jù)。

Western blot結(jié)果表明GFP標(biāo)簽的FKBP25野生型蛋白及其突變體蛋白FKBP25-N(1～42 aa)、FKBP25-PC(43～224 aa)、FKBP25-C(111～224 aa)、FKBP25(1～110 aa)、FKBP25(43～110 aa)均檢測到蛋白的表達(dá)。

激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果顯示：GFP標(biāo)簽的FKBP25野生型蛋白及其突變體FKBP25-N(1～42 aa)、FKBP25-PC(43～224 aa)、FKBP25-C(111～224 aa)的熒光蛋白均能正常表達(dá)，GFP-FKBP25主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中僅有少量表達(dá)； GFP標(biāo)簽的突變體FKBP25-N(1～42 aa)、FKBP25-PC(43～224 aa)、FKBP25-C(111～224 aa)的綠色熒光在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，但GFP標(biāo)簽的突變體FKBP25(1～110 aa)、FKBP25(43～110 aa) 熒光蛋白表達(dá)未被檢測到；與FLAG標(biāo)簽的CLIC1的共轉(zhuǎn)染實驗表明，野生型GFP-FKBP25與FLAG-CLIC1存在共定位，并主要共定位于細(xì)胞質(zhì)中；突變體FKBP25-N(1～42 aa)、FKBP25-PC(43～224 aa)、FKBP25-C(111～224 aa) 與CLIC1有部分共定位，胞質(zhì)、胞核均有共定位，而且相對于FKBP25野生型蛋白，各突變體與CLIC1的共定位明顯減少。

兩種蛋白在細(xì)胞中的共定位提示了兩者在細(xì)胞內(nèi)可能存在相互作用。鑒于CLIC1蛋白在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能，本研究為進(jìn)一步探索FKBP25蛋白的生物學(xué)功能提供了重要線索。FKBP25與CLIC1結(jié)合的確切亞細(xì)胞定位，F(xiàn)KBP25蛋白中一部分氨基酸殘基的缺失對蛋白折疊及蛋白功能的影響，以及兩種蛋白的互作結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍坠δ艿挠绊懙?，都尚需進(jìn)一步研究揭示。

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The co-localization of FKBP25 and its deletion mutants with CLIC1

He Wei1, Geng Huiwu1, Zuo Heng2, et al

(1DeptofBiology,2DeptofBiotechnology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

ObjectiveToinvestigatetheexpressionandlocalizationofFKBP25includingitsdeletionmutantsFKBP25(1～42aa),FKBP25(1～110aa),FKBP25(43～224aa),FKBP25 (43～110aa),FKBP25(111～224aa)ineukaryoticcells,andthecolocalizationofFKBP25anditsmutantswithCLIC1inmammaliancells.MethodsToconstructsomeeukaryoticexpressionplasmidsofpCDGFP-FKBP25,pCDGFP-FKBP25(1～42aa),pCDGFP-FKBP25(1～110aa),pCDGFP-FKBP25(43～224aa),pCDGFP-FKBP25(43～110aa),pCDGFP-FKBP25(111～224aa).TheseplasmidsweretransfectedintoHEK293TcellsrespectivelyandtheexpressionwascheckedbyWesternblot.TheirlocalizationandcolocalizationwithFLAG-CLIC1inCOS7cellsweredetectedbyfluorescencemicroscopy.ResultsTheexpressionplasmidsofpCDGFP-FKBP25andaseriesofitsdeletionmutantswereconstructedsuccessfully,whichcouldeffectivelyexpressinHEK293TandCOS7cells.ThelocalizationofGFP-FKBP25wasmainlyincytoplasmanditsmutantswereinbothnucleusandcytoplasm.Theco-localizationofitsmutantswithFLAG-CLLIC1weremuchlessthanthatofGFP-FKBP25itself,andthereweresomedifferencesindistribution.ConclusionFKBP25anditsdeletionmutantscanexpressefficientlyinHEK293TandCOS7cells.GFP-FKBP25ismainlydistributedinthecytoplasm,butthemutantsareinbothnucleusandcytoplasm.FKBP25proteinanditsmutantsappeartocolocalizewithCLIC1todifferentdegreesrespectively,whichimpliesthatFKBP25anditsmutantsmayinteractwithCLIC1respectivelyinmammaliancells.ItprovidescellularbasistofurtherstudyonbiologicalfunctionsofFKBP25gene.

FKBP25;transfection;geneexpression;co-localization

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.001.html

2016-05-30接收

國家自然科學(xué)基金青年基金(編號：81201368)

安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1生物教研室，2生物技術(shù)，合肥 230032

何 薇，女，碩士研究生；

范禮斌，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:lfan@ahmu.edu.cn；

劉曉穎，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail: liuxiaoying@ahmu.edu.cn

Q 28；R 392.7

A

1000-1492(2016)10-1391-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.001