張建華，李敏，陳霞，楊婷，韓舜愈

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

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響應(yīng)面法優(yōu)化‘蛇龍珠’葡萄皮渣中多酚提取條件的研究

張建華，李敏，陳霞，楊婷，韓舜愈

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

【目的】 為了提高葡萄皮渣中廢棄物的利用價(jià)值.【方法】 以‘蛇龍珠’葡萄皮渣為原料，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，比較不同試驗(yàn)因素和水平對(duì)葡萄皮渣中多酚提取率的影響.【結(jié)果】 不同的浸提條件對(duì)多酚提取率有很大的影響.優(yōu)化得到的葡萄皮渣多酚提取條件是乙醇體積分?jǐn)?shù)為42.4%，料液比為1∶15.44(g∶mL)，浸提溫度為60.6 ℃.【結(jié)論】 在此條件下可提取多酚的量為0.786 mg/g，與傳統(tǒng)提取率相比有明顯的增加.

葡萄皮渣；多酚；提取；響應(yīng)面

多酚物質(zhì)是羥基直接連接在苯環(huán)上的酚類(lèi)物質(zhì)及其聚合物的總稱(chēng).多酚類(lèi)物質(zhì)廣泛存在于自然界中，是植物的次生代謝產(chǎn)物，具有清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗脂質(zhì)氧化、延緩機(jī)體衰老、預(yù)防心血管疾病、抗輻射等生物活性功能[1].

葡萄多酚主要存于葡萄籽和葡萄皮中，尤其是葡萄籽中多酚類(lèi)物質(zhì)含量可達(dá)5%～8%，以原花色素含量最高[1].葡萄多酚具有抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、抗癌和抗過(guò)敏等生理活性[2-3].同時(shí)作為天然抗菌劑，葡萄多酚可對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等多種細(xì)菌及皮膚真菌有抑制作用[3].因此葡萄多酚的提取開(kāi)發(fā)對(duì)天然植物資源的利用、保健食品及生物制藥工業(yè)的發(fā)展均有積極作用.2013年我國(guó)葡萄產(chǎn)量達(dá)527萬(wàn)t，其中80%用于釀酒，僅此一項(xiàng)就產(chǎn)生近96萬(wàn)t的葡萄皮渣，其中富含葡萄多酚等功效成分，因此，從葡萄皮渣中提取純化葡萄多酚，對(duì)提高葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益十分有意義[1-3].

我國(guó)對(duì)葡萄廢棄物的二次回收利用研究主要集中在葡萄籽提取物(grape seed extracts，GSE)上[4]，而在法國(guó)、意大利、西班牙等葡萄酒生產(chǎn)大國(guó)，葡萄廢棄物利用率高達(dá)70%[2]，其中葡萄多酚已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化妝品行業(yè).

然而，由于提取方法和提取效率的限制，葡萄皮渣中的多酚很難被充分利用[5]，有關(guān)葡萄皮渣中多酚提取條件的類(lèi)似研究中得到的提取率通常為0.03‰左右[6,7]，較低的提取率不足以改良大量浪費(fèi)和資源流失的現(xiàn)狀.試驗(yàn)以河西產(chǎn)區(qū)主要的葡萄品種‘蛇龍珠’葡萄皮渣為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，比較不同試驗(yàn)因素和水平對(duì)葡萄皮渣中多酚提取率的影響，優(yōu)化得到的提取方法與其他類(lèi)似文獻(xiàn)相比，提取率有明顯提高，從而使葡萄廢棄物的利用價(jià)值進(jìn)一步提高.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘蛇龍珠’葡萄原料于2013年10月采自甘肅省張掖市高臺(tái)縣南華鎮(zhèn)，將酒精發(fā)酵結(jié)束后的葡萄皮渣于-18 ℃保存，備用.

Folin-Ciocalteus顯色劑購(gòu)自北京Sigma儀器生物科技有限公司；沒(méi)食子酸、無(wú)水碳酸鈉購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無(wú)水乙醇購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠(chǎng)；所有有機(jī)溶劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

CP214電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；HH-S型恒溫水浴鍋(金壇市恒豐儀器制造有限公司)；NRY-200空氣恒溫?fù)u床(上海南榮試驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；Genesis 10s紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；H2050臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；GZX-GF101-II電熱恒溫鼓風(fēng)干燥(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；18100摩爾超水機(jī)(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)；單道移液器(德國(guó)Eppendorf公司).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 參考李靜等[6]的方法.稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉(Na2CO3)37.50 g，溶于250 mL溫水中，混勻，冷卻，稀釋至500 mL即為7.5%碳酸鈉溶液.

準(zhǔn)確稱(chēng)取沒(méi)食子酸0.100 g，用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.001 g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL到100 mL容量瓶中，定容得到0、10、20、30、40和50 μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液.

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：分別從0、10、20、30、40和50 μg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取1.0 mL，加蒸餾水5 mL、Folin-Ciocalteus顯色劑1 mL，7.5%的Na2CO3溶液3 mL.陰暗處室溫下顯色2 h后，在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，以沒(méi)食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).

1.3.2 葡萄皮渣的破碎 將浸漬結(jié)束后的葡萄皮渣冷凍干燥，于研缽中研磨，將研磨后的粉末作為試驗(yàn)原料待用.

1.3.3 樣品的測(cè)定 吸取1 mL樣品溶液，分別加入5 mL蒸餾水、1 mL Folin-Ciocalteus顯色劑和3 mL 7.5% Na2CO3溶液.陰暗處室溫下放置2 h顯色后，在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(方程)計(jì)算樣品中多酚的質(zhì)量濃度.葡萄皮渣多酚含量按以下公式計(jì)算：

ω=CV/m×1 000

式中，ω為多酚含量，mg/g；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到的多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液的體積，mL；m為葡萄皮渣的質(zhì)量，g.

1.3.4 不同因素對(duì)多酚提取率的影響

1.3.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取率的影響 參考朱登祥等[2]的方法，稱(chēng)取1.000 g葡萄皮渣，分別加入裝有不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液(20%、40%、60%、80%、100%)的三角瓶中，40 ℃恒溫?fù)u床震蕩1 h，過(guò)濾，4 ℃下離心10 min，取上清液測(cè)定吸光度值.根據(jù)1.3.3的方法計(jì)算可提取的多酚含量.試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.4.2 料液比對(duì)多酚提取率的影響 稱(chēng)取1.000 g葡萄皮渣于三角瓶中，加入60%乙醇溶液，使料液比分別為1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15、1∶17、1∶19(g∶mL).根據(jù)1.3.3的方法計(jì)算可提取的多酚含量.試驗(yàn)重復(fù)3次.1.3.4.3 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響 稱(chēng)取1.000 g葡萄皮渣，分別置于加入10 mL60%乙醇溶液的三角瓶中，恒溫振蕩0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h.根據(jù)1.3.3的方法計(jì)算可提取的多酚含量.試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.4.4 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響 稱(chēng)取1.000 g葡萄皮渣，分別置于加入10 mL60%乙醇溶液的三角瓶中，于30、40、50、60、70和80 ℃水浴1 h.根據(jù)1.3.3的方法計(jì)算可提取的多酚含量.試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.4.5 提取次數(shù)對(duì)多酚提取率的影響 稱(chēng)取1.000 g葡萄皮渣，分別置于加入10 mL 60%乙醇溶液的三角瓶中，恒溫振蕩，每隔1 h提取一次，共提取4次.根據(jù)1.3.3的方法計(jì)算可提取的多酚含量.試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度X1，料液比X2，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)X3為自變量，以多酚提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行提取條件的優(yōu)化.響應(yīng)面分析因素和水平表見(jiàn)表1.

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析處理采用Design-Expert V.8.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

Folin-Ciocalteau法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程y=0.120 8x-0.118.式中，y表示吸光度值；x表示總酚含量(以沒(méi)食子酸計(jì)).標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，具有很好的線(xiàn)性相關(guān)性，能夠用于本試驗(yàn)的多酚含量測(cè)定.

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 The standard curve of gallic acid

2.2 葡萄皮渣中多酚提取條件的單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取量的影響 由圖2可知，多酚含量隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)增加而增加，當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時(shí)多酚含量達(dá)到最高值，之后隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加又逐漸降低，這一結(jié)果與牛春艷等[5]的研究結(jié)果相類(lèi)似.這可能是過(guò)多的有機(jī)溶劑導(dǎo)致細(xì)胞膜變性，通透性降低，阻礙了多酚類(lèi)物質(zhì)的溶出[8].因此初步選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%.

圖2 乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols

2.2.2 料液比對(duì)多酚提取量的影響 由圖3可知，在其他條件一定的前提下，多酚含量會(huì)隨著料液比的增加而逐漸升高，因?yàn)檩^多的溶劑可以加快整個(gè)溶媒的傳質(zhì)速率[8].但當(dāng)料液比為1∶15(g∶mL)時(shí)多酚含量達(dá)到最大值后又下降，這是因?yàn)楫?dāng)料液比過(guò)高時(shí)會(huì)增大其他物質(zhì)的溶出比例，間接影響了多酚的提取率[2].因此初步確定料液比為1∶15(g∶mL).

圖3 料液比對(duì)多酚提取量的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polyphenols

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響 由圖4可知，浸提時(shí)間對(duì)多酚含量影響不大，這可能是因?yàn)橐掖紝?duì)多酚的提取速率較快，在1 h之內(nèi)就能夠充分地提取絕大多數(shù)多酚化合物[1]，所以從效率和能源節(jié)約角度考慮取1 h為宜.

圖4 浸提時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polyphenols

2.2.4 浸提溫度對(duì)多酚提取量的影響 由圖5可知，隨著溫度的升高多酚含量也逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)多酚含量最高，但之后繼續(xù)升溫提取率逐漸降低，因?yàn)楦邷啬軌虼龠M(jìn)過(guò)氧化物的鈍化和多酚的溶解，但溫度過(guò)高會(huì)加速多酚物質(zhì)的非酶促氧化

圖5 浸提溫度對(duì)多酚提取量的影響Fig.5 Effect of temperature on the yield of polyphenols

聚合，同時(shí)也會(huì)降低多酚化合物的穩(wěn)定性[9].牛春燕等[5]認(rèn)為浸提溫度對(duì)葡萄酒渣中多酚物質(zhì)提取效果影響最大，并得出葡萄皮渣中多酚物質(zhì)的最佳浸提溫度為60 ℃，這與本研究結(jié)果一致，所以后續(xù)試驗(yàn)采用60 ℃為提取溫度.

2.2.5 浸提次數(shù)對(duì)多酚提取量的影響 由圖6可知，隨著浸提次數(shù)的增多，多酚含量先快速增加后逐漸趨于平衡，第4次提取與第3次提取時(shí)多酚含量幾乎無(wú)變化，從經(jīng)濟(jì)效益考慮以浸提3次為宜.

圖6 浸提次數(shù)對(duì)多酚提取量的影響Fig.6 Effect of times on the yield of polyphenols

2.3 葡萄皮渣中多酚物質(zhì)提取條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，因提取時(shí)間對(duì)于多酚含量沒(méi)有顯著影響，故選擇對(duì)結(jié)果影響較大的料液比、

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果

提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素，利用Design-Expert V.8.05軟件中的中心組合設(shè)計(jì)(CCD)選項(xiàng)，可獲得葡萄皮渣中多酚化合物提取的三因素五水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果.以乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度為變量進(jìn)行通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2.

對(duì)表2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可建立二次回歸方程：

Y=0.778 32-5.391 86X1+0.012 015X2-0.027 192X3+5.000X1X2-0.017 5X1X3-2.5X2X3-0.077 095X12-0.061 185X22-0.015 223X32

對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3.

從表3可知，二次回歸方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及

交互項(xiàng)中的X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22、X32均表現(xiàn)出了顯著水平，回歸方程整體模型顯著，且失擬項(xiàng)不顯著，該方程的決定系數(shù)R2=0.997 1，說(shuō)明回歸方程的擬合比較好，誤差較小，可以通過(guò)該模型預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果.各因素對(duì)‘蛇龍珠’葡萄皮渣多酚提取量的影響由大到小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)、液料比(X2)、提取溫度(X1).

根據(jù)此模型獲得的最優(yōu)提取條件為：提取溫度為60.6 ℃，浸提料液比為1∶15.44(g∶mL)，乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為42.4%，在此條件下多酚提取率為0.786 mg/g.

表3 方差分析結(jié)果

P<0.05表示該指標(biāo)顯著*，P<0.01表示該指標(biāo)極顯著**.

2.4 響應(yīng)面結(jié)果與分析

為考察交互項(xiàng)對(duì)葡萄皮渣中多酚提取率的影響，經(jīng)Design-Expert .V.8.05軟件分析得到響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖7、8、9.

根據(jù)響應(yīng)面法分析數(shù)據(jù)繪出響應(yīng)面，可以直觀(guān)反映出浸提溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)可提取多酚量的影響(圖 7、8、9).由響應(yīng)面立體優(yōu)化圖可以看出，浸提溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與可提取多酚量之間存在顯著的相關(guān)性.

由圖7可知，不論提取溫度(X1)與料液比(X2)的增大或減小，多酚含量都在逐漸下降；在交互項(xiàng)對(duì)多酚含量的影響中，提取溫度(X1)與料液比(X2)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著.

由圖8可以看出，浸提溫度從零水平逐漸減小的過(guò)程中多酚含量也在緩慢的減小，從零水平逐漸增大的過(guò)程中可提取的多酚含量迅速下降，坡度較陡；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的減小或增大，對(duì)應(yīng)的可提取多酚量也有相應(yīng)的減小，但變化趨勢(shì)不明顯.在交互項(xiàng)對(duì)可提取多酚量的影響中，提取溫度(X1)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著的影響.

圖7 浸提溫度與料液比的交互作用對(duì)多酚提取量的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface showing the pairwise interactive of temperature and solid-liquid ratio on the extraction yield of polyphenols

圖8 浸提溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對(duì)多酚提取量的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface showing the pairwise interactive of temperature and ethanol concentration on the extraction yield of polyphenols

圖9 料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對(duì)多酚提取量的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface showing the pairwise interactive of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction yield of polyphenols

由圖9可知，隨著料液比(X2)的增大或減小，多酚含量逐漸的減??；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)的變化多酚含量也在減小，但變化不明顯.這組交互項(xiàng)對(duì)可提取的多酚含量的影響不顯著.

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)模型獲得的最優(yōu)提取條件，考慮到可操作性，將其修正為提取溫度61 ℃、料液比1∶16(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)42%，在此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次.測(cè)得可提取多酚的平均含量為0.776 mg/g.驗(yàn)證結(jié)果與理論結(jié)果較為接近，表明模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間有很好的擬合性，證實(shí)了模型的有效性.

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用三因素五水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)‘蛇龍珠’葡萄皮渣多酚的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳提取條件為：提取溫度60.6 ℃，浸提料液比1∶15.44(g∶mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)42.4%，提取次數(shù)3次，時(shí)間1 h，在此條件下多酚含量為0.786 mg/g，與傳統(tǒng)提取率(0.03‰[6]、(0.028 9±0.002 7‰)[7])相比有明顯的增加.

本試驗(yàn)探討了葡萄酒生產(chǎn)中皮渣多酚的提取，考慮到不同多酚具有不同的生理活性，后續(xù)試驗(yàn)中可針對(duì)生理活性較高的多酚進(jìn)行提取率的研究.

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(責(zé)任編輯 趙曉倩)

Optimization of polyphenols extraction conditions from Cabernet Gernischt wine pomace by response surface method

ZHANG Jian-hua,LI Min,CHEN Xia,YANG Ting,HAN Shun-yu

(College of Food Science and Engineering,Gansu Key Lab of Viticulture and Enology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

【Objective】 The aim of the research was to improve utilization value of grape pomace waste.【Method】 Taking Cabernet Gernischt wine lees as material,a single factor experiment and response surface experiments was used to compare the influence of different experimental factors and levels on grape polyphenols extraction rate.【Result】 The results showed that extraction conditions had greater effect on polyphenol extraction rate.The optimal extraction technology of polyphenol substances in wine lees was as follows: alcohol concentration of 42.4%,ratio of solid to liquid of 1∶15.44(g∶mL),extraction temperature at 60.6 ℃.【Conclusion】 The extractable polyphenols obtained by the method was 0.786 mg/g,was increased significantly compared with traditional extractable rate.

wine pomace；polyphenols；extraction；response surface

張建華(1989-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槠咸鸭捌咸丫蒲芯?E-mail:zjh930718@163.com

韓舜愈，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣呒庸ぜ捌咸丫骑L(fēng)味化學(xué).E-mail:gsndhsy@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160310)；甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)基金.

2015-09-01；

2015-11-19

TS 201.2

A

1003-4315(2016)05-0141-07