葉合敏，李帥，向洋，付豪，杜永洪

（重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院/省部共建國家重點實驗室培育基地/重慶市超聲醫(yī)學工程重點實驗室，重慶400016）

不同濃度白色念珠菌連續(xù)培養(yǎng)對比觀察*

葉合敏，李帥，向洋，付豪，杜永洪△

（重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院/省部共建國家重點實驗室培育基地/重慶市超聲醫(yī)學工程重點實驗室，重慶400016）

目的通過對比觀察白色念珠菌（白念珠菌）在LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板上不同濃度的生長情況，探討白念珠菌平板稀釋法計數(shù)的適宜觀察濃度。方法將白念珠菌原液稀釋至約1.5×109cfu/mL，編號為A。然后取7個20 mL的無菌試管，每個試管加入9 mL無菌生理鹽水，分別編號為B～H。從A試管中吸取1 mL菌液至B管，混勻后再吸取1 mL至C管，如此連續(xù)倍比稀釋至H管。用移液槍吸取100 μL不同濃度的白念珠菌懸液到對應編號的一次性瓊脂培養(yǎng)平板，用接種環(huán)涂抹均勻，置于37℃孵箱內培養(yǎng)。結果培養(yǎng)48 h后，濃度數(shù)量級為104的白念珠菌較濃度數(shù)量級為102、103菌體密集且體積小，而105較104更密集、體積更小，呈針尖狀，肉眼不易觀察具體形態(tài)。白念珠菌濃度數(shù)量級為102、103時，真菌數(shù)量為20～300個，可以計數(shù)，而濃度數(shù)量級達104及以上時，則不能計數(shù)。分別培養(yǎng)24、48、72 h后取出瓊脂培養(yǎng)平板觀察，培養(yǎng)24 h后肉眼可觀察到菌落，但具體形態(tài)不明顯；培養(yǎng)48 h后較24 h時體積大，大致形態(tài)可看出，呈乳白色圓形或卵圓形，表面光滑濕潤，有光澤，直徑為1.0～2.0 mm；培養(yǎng)72 h后較培養(yǎng)48 h后體積稍大，但呈現(xiàn)黃色。結論

菌液濃度為1.5×102cfu/mL時可以作為平板稀釋法的適宜計數(shù)濃度，培養(yǎng)48 h后為菌落形態(tài)觀察的最佳時機。

白念珠菌；集落計數(shù)，微生物；體外研究；培養(yǎng)基；瓊脂

白色念珠菌（白念珠菌）因各種原因引起的機體免疫力下降或菌群失調時，可引起假絲酵母菌病。白念珠菌為最常見的真菌致病菌[1]，致病機制尚未明確，初步認為白念珠菌致病力與其黏附能力、形態(tài)轉變、產(chǎn)生有毒性的多種酶、產(chǎn)生抑制免疫活性細胞趨化作用的代謝產(chǎn)物有關[2]。目前，對白念珠菌引起的相關疾病主要通過藥物治療，但存在毒性反應大、治療周期長、易產(chǎn)生耐藥性等缺點[3]。通過對白念珠菌的培養(yǎng)，可了解其生長周期與基本特性，為確定白念珠菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板上培養(yǎng)的最適觀察時間及其平板稀釋法最理想計數(shù)濃度提供條件，也為體外研究治療白念珠菌疾病的新方法提供支持。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗設備HD-650-u超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司，規(guī)格650mm×680 mm×625mm）、HZ-9211K恒溫振蕩器（江蘇省太倉市科教器材廠）。

1.1.2實驗材料白念珠菌菌株購自上海寶錄生物科技有限公司，LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂、0.9%氯化鈉（NaCl）溶液、一次性培養(yǎng)平板（直徑9 cm）、10 mL刻度吸管、1.5 mL EP管、接種環(huán)。

1.2方法

1.2.1瓊脂培養(yǎng)平板的制備參照LB營養(yǎng)瓊脂配制方法，按40 g/L將粉末狀LB營養(yǎng)瓊脂在燒瓶中進行溶解，充分混勻消毒[4]后，液體處于60～70℃時在超凈臺上取13 mL于一次性培養(yǎng)平板中，靜置凝固后瓊脂厚度3～4 mm，密封保存于4℃冰箱中待用[5]。

1.2.2白念珠菌原菌液制備按25 g/L將粉末狀LB肉湯在燒瓶中進行溶解，充分混勻消毒冷卻至室溫。在超凈工作臺上，用接種環(huán)挑取瓊脂培養(yǎng)平板中培養(yǎng)48 h的最大白念珠菌1～2個接種于液體培養(yǎng)基中[6]，調節(jié)恒溫搖床振蕩器在150 r/min、37℃條件下?lián)u菌13～15 h。

1.2.3制備不同濃度的菌液在超凈工作臺上，用移液槍吸取1 mL白念珠菌菌液，無菌生理鹽水稀釋，用比濁法對比菌液濃度，制備成原菌液濃度約為1.5×109cfu/mL，并編號為A。然后取7個20 mL的無菌試管，分別編號為B、C、D、E、F、G、H，再分別加入9 mL無菌生理鹽水。（1）用刻度吸管從A試管中取1 mL白念珠菌原菌液，加入B試管，混勻，B試管菌液稀釋濃度約為10倍（比濁法得菌液濃度約為1.5×108cfu/mL）；（2）用刻度吸管從B試管中取1 mL白念珠菌菌液，加入C試管，混勻，C試管的菌液稀釋濃度約為102倍（菌液濃度約為1.5× 107cfu/mL）；（3）重復該操作至H試管，H試管的菌液稀釋濃度約為107倍（菌液濃度約為1.5×102cfu/mL）。以上菌液濃度約為1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5× 104、1.5×103、1.5×102cfu/mL的白念珠菌菌液配置完畢。

1.2.4白念珠菌平板接種在超凈工作臺上，用移液槍吸取100 μL不同濃度的白念珠菌懸液到對應編號的一次性營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板，用接種環(huán)涂抹均勻，置于37℃孵箱內培養(yǎng)。

2　結果

2.1不同濃度數(shù)量級的白念珠菌培養(yǎng)48 h后的生長情況培養(yǎng)48 h后，濃度數(shù)量級為102的白念珠菌的生長情況為：單個生長，未形成菌落，呈圓形或卵圓形，表面光滑，菌體較大，直徑為1.0～2.0 mm，見圖1a；濃度數(shù)量級為103的白念珠菌的生長情況為：多數(shù)為單個生長，少部分形成大小疏密不一的菌落，菌體直徑為1.0～2.0 mm，見圖1b；濃度數(shù)量級為104、105的白念珠菌的生長情況為：廣泛形成大片菌落，見圖1c、d。圖1c較圖1a和圖1b菌體密集且體積小，直徑為0.3～1.0 mm；圖1d較圖1c更密集、體積更小，呈針尖狀，肉眼不易觀察具體形態(tài)。

2.2不同濃度數(shù)量級的白念珠菌培養(yǎng)48 h后計數(shù)結果濃度數(shù)量級在102、103時，真菌數(shù)量在20～300個，可以計數(shù)；而菌液濃度數(shù)量級在104及以上時不能計數(shù)，所以菌液濃度為1.5×102cfu/mL時可以作為平板稀釋法最理想的計數(shù)濃度。見表1。

圖1　不同濃度數(shù)量級的白念珠菌培養(yǎng)48 h后的生長情況

表1　不同濃度數(shù)量級的白念珠菌培養(yǎng)48 h后計數(shù)結果

2.3培養(yǎng)24、48、72 h后濃度數(shù)量級為103的白念珠菌生長情況白念珠菌在LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板上培養(yǎng)24 h后即可在肉眼下觀察到菌落，但僅是一個個針尖大小的圓形小點，具體形態(tài)不明顯，見圖2a；培養(yǎng)48 h后體積較培養(yǎng)24 h后大，大致形態(tài)可看出，呈乳白色圓形或卵圓形，表面光滑濕潤，有光澤，直徑為1.0～2.0 mm，見圖2b；培養(yǎng)72 h后體積較培養(yǎng)48 h后稍大，直徑為1.5～2.5 mm，但呈現(xiàn)黃色，可能與培養(yǎng)時間過長有關，見圖2c。

圖2　培養(yǎng)24、48、72 h后濃度數(shù)量級為103的白念珠菌生長情況

3　討論

白念珠菌屬于酵母屬真菌[7]，白念珠菌有其獨特的雙相（酵母相和菌絲相）生長方式[8]，真菌類鑒別培養(yǎng)一般采用的培養(yǎng)平板為沙氏培養(yǎng)平板。在平常的臨床工作中LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板培養(yǎng)白念珠菌較常用，該培養(yǎng)平板價格較便宜，配制簡單，適合真菌生長[9]。

本實驗圖1a～d表明，高濃度的白念珠菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板上形成的菌落數(shù)量較多、形態(tài)偏小、呈點狀或絲狀，難以計數(shù)；低濃度的白念珠菌，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板上形成肉眼清晰可見的單個菌落，數(shù)量偏少，可以計數(shù)。

本實驗表明，濃度數(shù)量級在102、103時，真菌數(shù)量在20～300個時，可以計數(shù)；而菌液濃度數(shù)量級在104及以上時不能計數(shù)，所以菌液濃度為1.5×102cfu/mL時可以作為平板稀釋法最理想的計數(shù)濃度。

本實驗中，作者觀察到影響白念珠菌培養(yǎng)結果的因素有：在制備培養(yǎng)平板及培養(yǎng)白念珠菌時，要嚴格無菌操作，避免雜菌污染[10]；在培養(yǎng)期間注意按時觀察平板菌株生長狀況，做好記錄。如相機拍照，要標明時間、刻度；72 h后由于培養(yǎng)時間過長會有部分菌落偏黃，從而影響菌落色澤的判斷；白念珠菌稀釋濃度不同時菌體大小會出現(xiàn)不同，可能與各菌體營養(yǎng)成分不足或分布不均有關。

為了直接觀察微生物的形態(tài)及生長情況，將微生物培養(yǎng)在固體培養(yǎng)平板表面上進行形態(tài)觀察和菌落計數(shù)，已經(jīng)被公認為比較精準的實驗方法。掌握白念珠菌體外培養(yǎng)的基本方法對于了解白念珠菌的生長周期有一定作用，對后期實驗中尋找最適接種時期、篩選菌液濃度與藥物濃度的比例有較大幫助。本實驗中所用的菌落平板稀釋法的熟練操作可為開展超聲聯(lián)合藥物對白念珠菌的損傷作用及研究超聲對其細胞壁的破壞作用的實驗研究提供支持。

[1]丁秀琴，黃曉峰．346例口腔感染者口內真菌檢出與藥敏分析[J]．中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥，2014，21（5）：44-45．

[2]楊豐帥，周厚吾.白色念珠菌致病機制及治療研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29（22）：3411-3414.

[3]符健，賈杰，蔡篤運.白色念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的耐藥性分析[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2011，38（16）：3301-3302.

[4]于亞頡．菌種培養(yǎng)基滅菌技術[J]．吉林農(nóng)業(yè)，2009（3）：43．

[5]崔曉燕，張宏萍，李海波．培養(yǎng)基的不同儲存條件對細菌檢測結果的影響[J]．上海預防醫(yī)學，2007，19（12）：631-632．

[6]蘇杭，江和遜，鄭慧敏，等．低頻低強度超聲對恥垢分枝桿菌細胞壁通透性影響的實驗研究[J]．中國超聲醫(yī)學雜志，2015，31（11）：1038-1040．

[7]Pravin Charles MV，Kali A，Joseph NM.Performance of chromogenic media for Candida in rapid presumptive identification of Candida species fromclinical materials[J].Pharmacognosy Res，2015，7（Suppl 1）：S69-73.

[8]徐振華，廖勇，李夢，等．BDSF抑制臨床白假絲酵母菌絲生長的效果分析[J]．微生物與感染，2015，10（4）：247-251．

[9]杜宗緒．3種平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的質量比較[J]．山西農(nóng)業(yè)科學，2014，42（8）：835-837．

[10]戴瑞娣，王麗，趙向東．制備營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基出現(xiàn)細菌污染原因分析[J]．實用醫(yī)技雜志，2004，11（20）：2105．

Comparative observation of continuous culture with different concentrations of Candida albicans*

Ye Hemin，Li Shuai，Xiang Yang，F(xiàn)u Hao，Du Yonghong△
（School of Biomedical Engineering，Chongqing Medical University/Province-Ministry Co-Build State Key Lab Cultivation Base/Chongqing Key Laboratory of Ultrasound in Medicine Engineering，Chongqing 400016，China）

Objective To investigate the suitable observation concentration in the count of Candida albicans plate dilution method by comparatively observing the growth situation in different concentrations of Candida albicans in LB nutrient agar culture plate.Methods The Candida albicans stock solution was diluted to about 1.5×109cfu/mL with No.A.Then 7 sterile tubes with 20 mL were taken，each tube was added with 9 mL sterile normal saline with No.B-H.One mL of bacterial solution was absorbed from the tube A to the tube B，after mixing，1 mL of bacterial solution was absorbed again to the tube C，so did successive multiple proportion dilution to the tube H.100 μL of different concentrations of Candida albicans suspension was absorbed by pipette to the one-off agar plate with corresponding number，which was evenly coated with the inoculating loop and cultured at 37℃incubator.Results After 48 h culture，Candida albicans with the order of magnitude 104had smaller thallus with smaller volume than the order of magnitude 102，103，while 105was even more denser and smaller volume than 104，which was needle-shaped，its actual morphology was not easier to be observed by naked eye.When the orders of magnitude of Candida albicans was 102，103，the fungal counting was 20-300 and could be counted，whereas the concentration orders of magnitude reached more than 104，which could not be counted.After 24，48，72 h culture，the agar culture plate was taken out for observing.The colony could be visually observed after 24 h culture，but the actual form was not obvious.After culturing for 48 h，the volume was large than that after culturing for 24 h culture，rough morphology could be seen，milky white round or oval，smooth surface and moist，shiny，diameter of 1.0-2.0 mm.The volume after 72 h culture was slightly larger than that after 48 h culture，but the bacterial color was yellow.Conclusion The bacterial solution concentration of 1.5×102cfu/mL can be used as the suitable counting concentration of plate dilution method，culturing for 48 h is the best time to observe the colony morphology.

Candida albicans；Colony count，Microbial；In vitro；Culture media；Agar

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.005

A

1009-5519（2016）21-3272-03

重慶市基礎科學與前沿技術研究專項資助項目（csct2016jcyjA0098）；重慶醫(yī)科大學2015年國家自然科學基金預研資助項目（NSFYY201528）。

葉合敏（1994-），在讀本科生，主要從事生物醫(yī)學工程（醫(yī)療器械方向）方面的學習。

△，E-mail：duyonghong@yeah.net。

（2016-05-22）