陳妍，邢正英，李繼彬，李晗，房志仲

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070；2.天津海濱人民醫(yī)院藥劑科，天津300280）

論著

HPLC法測(cè)定黃丹蘭顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿含量

陳妍1，2，邢正英1，李繼彬1，李晗1，房志仲1

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070；2.天津海濱人民醫(yī)院藥劑科，天津300280）

目的：建立高效液相色譜（H PLC）法測(cè)定黃丹蘭顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿含量的方法。方法：采用HPLC法以苦參堿、氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，黃丹蘭顆粒劑為樣品，使用TIANHE?Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（pH=3.0）-甲醇（93∶7），流速為0.8 mL/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：苦參堿回歸方程為Y=40 074.09X-14.73，其進(jìn)樣濃度在2.5～25 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.999 9，n=3），平均加樣回收率為99.99%，RSD=0.057 7%（n=6）；氧化苦參堿回歸方程為Y=53 380.27X+46.35，其進(jìn)樣濃度在2.0～20.0 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（r=0.999 9，n=3），平均加樣回收率為99.78%，RSD=0.443 2%（n=6）。苦參堿和氧化苦參堿平均含量分別為0.505 6 mg/g和0.306 7 mg/g，RSD分別為0.298 7%和0.154 2%。結(jié)論：HPLC方法分離效果好、專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、靈敏和準(zhǔn)確，可作為黃丹蘭顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿含量的測(cè)定方法。

黃丹蘭顆粒劑；苦參堿；氧化苦參堿；高效液相色譜法

黃丹蘭顆粒劑是由苦參、黃芪、丹參、三七總苷、螺旋藻、絞股蘭總皂甙和蝙蝠蛾孢菌絲體粉等組成，具有調(diào)節(jié)免疫功能，逆轉(zhuǎn)纖維化進(jìn)程，溶解纖維斑塊的功效?？鄥⒅兄饕钚猿煞譃榭鄥A和氧化苦參堿。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抑制免疫、抗纖維化、抗腫瘤等生物學(xué)作用［1-3］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)肝纖維化、肺纖維化及溶解纖維斑塊等具有很好的治療效果。中藥苦參是黃丹蘭顆粒劑處方中的主藥，為了有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量，參考相關(guān)文獻(xiàn)［4-9］采用HPLC法測(cè)定了該顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿的含量，建立該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為申報(bào)醫(yī)院制劑提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1儀器美國(guó)高效液相色譜儀（Spectra-physics），輸液泵（SP8810 precision isocratic，BIO-RAD），檢測(cè)器（Spectra 100 variable wavelength detector），Anastar色譜工作站，TIANHE?Kromasil C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），ALC-210.4電子分析天平（ACCULAB Sartorius group，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），pH計(jì)（雷磁pHs-25型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2藥品與試劑苦參堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110805-200306，供含量測(cè)定用）和氧化苦參堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物質(zhì)品檢定所，批號(hào)為110780-200506，供含量測(cè)定用）；黃丹蘭顆粒劑（本室自制3批，批號(hào)：141014、141018和141022）；甲醇（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；乙腈（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；其它試劑均為市售分析純；重蒸水（自制）。

1.3色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：TIANHE?Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0）-甲醇（93∶7）；流速為0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.4樣品溶液的制備

1.4.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取苦參堿對(duì)照品12.5 mg、氧化苦參堿對(duì)照品10 mg，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，密塞。精密量取上述溶液各10 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，密塞，制備成50 μg/mL的苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液和40 μg/mL的氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

1.4.2供試品溶液的制備取黃丹蘭顆粒劑至乳缽中研細(xì)，取粉末1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入濃氨水1 mL，CHCl350 mL，密塞，搖勻，精密稱定質(zhì)量，放置4 h，隨時(shí)振搖，超聲提取20 min，再精密稱定質(zhì)量，用CHCl3補(bǔ)足其減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，立即取下，殘?jiān)蛹状? mL使其溶解，定量轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4.3陰性樣品對(duì)照液的制備按處方比例，取除苦參外的其余藥味，按工藝要求制成不含苦參的陰性樣品，再按“1.4.2項(xiàng)下”中的方法制成陰性樣品對(duì)照液。

2　結(jié)果

2.1專屬性試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品對(duì)照液各20 μL，按照“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖?？鄥A和氧化苦參堿對(duì)照品的保留時(shí)間分別為9.7和12.3 min左右，供試品色譜行為與苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上有相應(yīng)的色譜峰，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾，色譜見圖1。

圖1　黃丹蘭顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿色譜

2.2線性關(guān)系考察

2.2.1苦參堿精密量取苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，配制成2.5、5、10、15、20和25 μg/mL系列對(duì)照品溶液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL注入液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對(duì)苦參堿濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=40 074.09X－14.73（r=0.999 9，n=3），結(jié)果表明：苦參堿進(jìn)樣量在2.5～25 μg/mL范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系。

2.2.2氧化苦參堿精密量取氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，配制成2.0、4.0、8.0、10.0、15和20 μg/mL系列對(duì)照品溶液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL注入液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對(duì)苦參堿濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 53 380.27X＋46 035（r=0.999 9，n=3），結(jié)果表明：氧化苦參堿進(jìn)樣量在2.0～20.0 μg/mL范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系。

2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液20 μL，在0、2、4、6、8及12 h測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿峰面積值，結(jié)果苦參堿的RSD為1.510 5%，氧化苦參堿RSD為0.991 3%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4精密度試驗(yàn)精密吸取供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果其中苦參堿RSD為1.050 7%，氧化苦參堿RSD為0.227 5%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)按“1.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果苦參堿和氧化苦參堿的含量分別為0.504 2，0.306 9 mg/g，RSD分別為0.217 8%，0.703 8%（n=6），表明本法的重復(fù)性良好。

2.6回收率試驗(yàn)

2.6.1苦參堿精密稱取已知含量的樣品，精密加入不同量的苦參堿對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法制得待測(cè)液，測(cè)定含量，平均回收率為99.99%，RSD為0.057 7%，見表1。

表1　苦參堿回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6.2氧化苦參堿精密稱取已知含量的樣品，精密加入不同量的氧化苦參堿對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法制得待測(cè)液，測(cè)定含量，平均回收率為99.78%，RSD為0.443 2%，見表2。

表2　氧化苦參堿回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7樣品測(cè)定按上述色譜條件和含量測(cè)定方法，精密測(cè)定3批樣品，記錄峰面積，計(jì)算含量?？鄥A平均含量為0.505 6 mg/g，氧化苦參堿平均含量0.306 7 mg/g，見表3。

表3　樣品含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

3.1流動(dòng)相的選擇分別考察3種不同比例的流動(dòng)相：（1）乙腈-0.1%KH2PO4溶液；（2）乙腈-水（含KH2PO4和庚烷磺酸鈉）；（3）磷酸鹽緩沖液（pH=3.0）-甲醇（93∶7）。結(jié)果表明：使用流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（pH=3.0）-甲醇（93∶7），流速為0.8 mL/min，柱溫為35℃時(shí)，色譜峰對(duì)稱，基線平穩(wěn)，分離效果最好。

3.2供試品提取純化條件的選擇根據(jù)苦參堿和氧化苦參堿的溶解性能，并參考有關(guān)文獻(xiàn)［4-9］的提取純化方法，最終選取如下方法：取黃丹蘭顆粒劑至乳缽中研細(xì)，置具塞錐形瓶中，加入濃氨水使樣品充分潤(rùn)濕，加入CHCl3，密塞，搖勻，放置4 h，隨時(shí)振搖，超聲提取20 min，濾過。超聲的方法比回流法更為簡(jiǎn)便。

3.3薄層層析試驗(yàn)薄層色譜（TLC）分析在藥物制劑等快速檢測(cè)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，簡(jiǎn)便易行，可以作為定量分析初始依據(jù)。在建立HPLC定量分析中，同時(shí)利用“1.4項(xiàng)下”的樣品溶液進(jìn)行了TLC試驗(yàn)，硅膠G加2%NaOH溶液的自制板，展開劑為氯仿∶甲醇∶濃氨溶液（5∶0.6∶0.3），上行展開8 cm，顯色劑為依次噴以稀碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉試液，日光下苦參堿和氧化苦參堿顯紅棕色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照液無干擾［8-11］，結(jié)果顯示TLC分析可以作為該制劑的定性分析方法。

［1］張知貴，楊華.苦參素對(duì)免疫性肝纖維化大鼠肝臟組織MMP-1，TIMP-1表達(dá)的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（11）：236

［2］袁建，楊宇.基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1與肝纖維化的中醫(yī)治療［J］.井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，31（5）：106

［3］李大壽.苦參堿治療慢性乙型肝炎肝纖維化45例臨床觀察［J］.中國(guó)民康醫(yī)學(xué)，2011，23（21）：2701

［4］肖琦，陽文武，李柏群，等.高效液相色譜法測(cè)定足光散中苦參堿含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2015，24（17）：55

［5］劉瑩，孟慶妍，翟宏宇.HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方苦參腸炎康片中苦參堿和氧化苦參堿的含量［J］.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27（5）：842

［6］葉秀金，宋粉云.HPLC法測(cè)定清肺抑火丸中苦參堿和氧化苦參堿的含量［J］.中國(guó)藥房，2011，22（12）：1127

［7］張成穎，彌宏，趙宏峰，等.HPLC測(cè)定前列康泰膠囊中的苦參堿與氧化苦參堿［J］.華西藥學(xué)雜志，2010，25（4）：476

［8］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1027

［9］肖琦，陽文武，李柏群，等.高效液相色譜法測(cè)定足光散中苦參堿含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2015，24（17）：55

［10］伍小燕，唐愛存，謝臻，等.抑霉洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（18）：88

［11］祁海宏，鄔瑾麗，屈鵬舒，等.薄層色譜掃描法測(cè)定治帶片中苦參堿含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2008，17（3）：15

（2016-02-02收稿）

R927.2

A

1006-8147（2016）05-0452-03

陳妍（1983-），女，主管藥師，碩士在讀，研究方向：臨床藥學(xué)；通信作者：房志仲，E-mail：fangzhizhong@tm u.edu.cn。