李晶鑫，許芳秀，2，王玉，郭燕，3，錢碧云，4

（1.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤流行病與生物統(tǒng)計室，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津300060；2.解放軍第401醫(yī)院藥劑科，青島266071；3.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院病理科，天津300060；4.上海交通大學公共衛(wèi)生學院，上海200025）

NFAT2在非小細胞肺癌中的表達及預后關(guān)聯(lián)研究

李晶鑫1，許芳秀1，2，王玉1，郭燕1，3，錢碧云1，4

（1.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤流行病與生物統(tǒng)計室，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津300060；2.解放軍第401醫(yī)院藥劑科，青島266071；3.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院病理科，天津300060；4.上海交通大學公共衛(wèi)生學院，上海200025）

目的：研究NFAT2在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達情況及與患者生存預后的關(guān)系。方法：收集原發(fā)性NSCLC腫瘤組織315例及其配對的正常組織164例，免疫組織化學染色檢測NFAT2蛋白表達情況，同時進行臨床關(guān)聯(lián)及預后分析。結(jié)果：NFAT2在NSCLC中高表達（P＜0.001）。在女性及非吸煙早期NSCLC中，NFAT2表達上調(diào)與生存期縮短相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.003、P=0.001）。結(jié)論：NFAT2是NSCLC發(fā)生的危險因子，NFAT2高表達可能預示著不良預后結(jié)局。

NFAT2；非小細胞肺癌；免疫組織化學技術(shù)

肺癌是目前發(fā)病率、死亡率都位居首位的惡性腫瘤，其中85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。2012年在亞洲國家中，肺癌新發(fā)病例為1 033 881例，其中71.13%為男性，28.87%為女性；肺癌死亡病例數(shù)為936 051例，其中71.45%為男性，28.55%為女性。無論在男性或者女性中，肺癌的發(fā)病率和死亡率都居高不下［1］。盡管目前放化療技術(shù)在腫瘤中得到廣泛應(yīng)用，但NSCLC的治療仍以手術(shù)切除為主［2］。大多肺癌患者出現(xiàn)明顯臨床癥狀時已為晚期，錯過了最佳的手術(shù)治療時機，影響預后生存狀況。因此識別NSCLC早期診斷和治療的標志物，可以早期發(fā)現(xiàn)并介入治療，有效改善肺癌患者的生存率?；罨疶細胞核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）是一類轉(zhuǎn)錄因子家族，包括NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4、NFAT5。該家族中各個亞型在組織中均存在廣泛表達［3］?，F(xiàn)研究證明，NFAT家族在腫瘤中發(fā)揮著重要作用，能夠調(diào)控細胞周期，影響細胞增殖、細胞凋亡、侵襲能力，在多種腫瘤中發(fā)揮促癌基因或者抑癌基因的作用［4］。NFAT2又稱NFATC1，是NFAT家族中的一個重要因子。本文擬研究NFAT2在NSCLC中的表達情況，探討NFAT2表達對NSCLC的影響及與預后關(guān)聯(lián)，以期識別NSCLC早期診斷的標志物。

1　對象與方法

1.1研究對象本研究所需的病例均來自天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院，于2007-2011年收治入院并進行手術(shù)切除治療的原發(fā)性非小細胞肺癌患者。所有病例均經(jīng)病理確診。納入研究的NSCLC患者腫瘤組織315例及其配對的癌旁組織164例，均經(jīng)石蠟包埋制作成組織芯片（tissue microarray，TMA）。從診斷之日起對納入研究的NSCLC患者進行隨訪，隨訪截止時間為2013年8月，或者出現(xiàn)因腫瘤引起的死亡結(jié)局。

1.2研究方法采用免疫組織化學技術(shù)進行組織染色。將組織芯片置于60℃烤箱中烘烤1 h進行脫蠟，然后依次通過二甲苯60 min、無水乙醇10 min、95%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min進行水化。PBS沖洗3次，枸櫞酸鈉緩沖液作為修復液高壓修復2 min后冷卻至室溫。置于過氧化氫溶液中避光放置30 min，以除去內(nèi)源性過氧化物酶。平放于濕盒中滴加一抗，4℃孵育過夜。次日將組織芯片復溫后滴加二抗，室溫孵育1 h，PBS沖洗3次。DAB顯色5～7 min后將組織芯片放入自來水中終止顯色反應(yīng)。蘇木染色5 min，分化液分化，再依次逆序通過梯度酒精及二甲苯進行脫水。封片，在室溫下晾置后閱片。

1.3結(jié)果判讀組織芯片染色結(jié)果由兩名病理科醫(yī)生分別閱片，意見不一致時，由第三名醫(yī)生進行復讀。陽性細胞染色強度以0分、1分、2分、3分四個等級分別表示未著色、淺棕色、棕色、深棕色；陽性細胞所占的比例以0分（＜5%）、1分（5%～25%）、2分（25%～50%）、3分（50%～75%）、4分（＞75%）進行評價。染色評分以陽性細胞染色強度與陽性細胞所占的比例相加之和表示，范圍為0～7分。NFAT2在早期NSCLC中的表達根據(jù)染色評分結(jié)果分為低表達（0～5分），高表達（6～7分）兩組。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。其中NFAT2蛋白在組織中的表達采用Wilcoxon配對符號秩和檢驗；NFAT2表達與臨床信息相關(guān)性采用χ2檢驗；生存分析采用Log-rank檢驗、Kaplan-Meier生存曲線及Cox回歸分析。P≤0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1 NFAT2蛋白在NSCLC中的表達免疫組化研究顯示NFAT2主要在細胞核中表達。圖1顯示的是NFAT2在NSCLC腫瘤組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織中的表達情況。0～5分為低表達組，6～7分為高表達組，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中NFAT2高表達率為24.4%，而癌旁組織中則全部為低表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）（表1）。經(jīng)Wilcoxon配對符號秩和檢驗發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中NFAT2染色評分中位數(shù)為5分，而癌旁組織中位數(shù)則為0分，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），說明NFAT2蛋白在NSCLC腫瘤組織中的表達顯著高于在癌旁組織中的表達（表2）。

表1　NSCLC及配對組織中NFAT2蛋白表達情況Tab 1 Theexpression ofNFAT2 protein in NSCLCand normaltissue

表2　NFAT2在NSCLC及配對組織中染色評分結(jié)果比較Tab 2 NFAT2 protein score in NSCLC and norm al tissue

圖1　NFAT2在NSCLC組織芯片中的表達情況Fig 1 The exp ression of NFAT2 in TMA in NSCLC

2.2 NSCLC中NFAT2蛋白表達與臨床病理資料的關(guān)聯(lián)本研究分析了315例NSCLC癌組織中NFAT2免疫組織化學染色結(jié)果與臨床病理資料的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示NSCLC中NFAT2蛋白表達與確診年齡、性別、BMI分類、肺部疾病史、腫瘤家族史、吸煙史、組織學類型、腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小均無關(guān)聯(lián)性（P＞0.05）（表3）。

2.3 NFAT2在NSCLC中的表達與預后的關(guān)系315例NSCLC從診斷之日起隨訪至2013年8月。Log-rank檢驗發(fā)現(xiàn)，在NFAT2低表達的NSCLC患者中，中位生存期為57.87月，NFAT2高表達的NSCLC患者中，中位生存期僅為38.40月，但差異不具有統(tǒng)計學意義。這與多因素調(diào)整的Cox回歸分析顯示的結(jié)果一致（P=0.842）。同時我們按照TNM臨床分期將NSCLC分為早期（Ⅰ～Ⅱ期）和晚期（Ⅲ～Ⅳ期）兩個亞組進行NFAT2表達與預后關(guān)聯(lián)分析，僅發(fā)現(xiàn)預后趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（早期：P=0.166，晚期：P=0.250）（表4）。

表3　NFAT2蛋白在肺組織芯片中與臨床病理資料的關(guān)聯(lián)Tab 3 Relationship between NFAT2 expression and clinicopatholo gical characteristics of NSCLC patients

表4　NFAT2在NSCLC中的表達與預后分析Tab 4 Association of NFAT2 expression w ith NSCLC survival

2.4 NSCLC中NFAT2表達與預后的分層分析NFAT2蛋白表達與NSCLC生存分析未見統(tǒng)計學意義。按照確診年齡、性別、BMI分類、肺部疾病史、腫瘤家族史、吸煙史、組織學類型、腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小等變量進行分層分析，Log-rank檢驗發(fā)現(xiàn)，只有在早期女性及非吸煙NSCLC患者中，NFAT2高表達組總體生存率低于NFAT2低表達組，差異具有統(tǒng)計學意義（女性：P=0.003；非吸煙患者：P=0.001）（圖2），表明NFAT2蛋白的高表達與早期女性及非吸煙NSCLC患者生存期縮短相關(guān)。而在315例NSCLC患者和112例晚期NSCLC患者中，分層分析未見統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2　女性及非吸煙患者中NFAT2表達與早期NSCLC生存關(guān)系的分層分析Fig 2 Subgroup analysis of early-stage NSCLC survival and NFAT2 expression in female and non-smokers

3　討論

NFAT家族是最早發(fā)現(xiàn)存在于T淋巴細胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，在免疫系統(tǒng)和免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用［5］。NFAT2位于18號染色體上（18q23），是NFAT家族中的重要亞型，在人類的淋巴組織中高度表達［6］。近年來多項研究表明NFAT家族在非免疫系統(tǒng)中存在廣泛表達［7-8］，尤其是在腫瘤組織中［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)NFAT1和NFAT2能夠在腸癌細胞系中表達，活化后進入細胞核，調(diào)節(jié)下游基因COX2的轉(zhuǎn)錄，促進細胞侵襲［11］。NFAT1在成纖維細胞中可誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，而NFAT2則能夠促進細胞增殖，誘導細胞轉(zhuǎn)化。這說明NFAT2與NFAT1在腫瘤發(fā)展中可能發(fā)揮著不同的作用［12］，影響腫瘤的發(fā)生。現(xiàn)有研究證實NFAT2在乳腺癌、腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達，作為促癌基因影響腫瘤的進展及預后。NFAT2在將近70%的胰腺癌組織中高表達，阻斷NFAT2活性可顯著抑制胰腺癌細胞的生長［13］。在前列腺癌中，NFAT2在腫瘤組織中表達上調(diào)，Kaplan-Meier分析顯示NFAT2的高表達能夠引起前列腺癌切除治療后的腫瘤復發(fā)，縮短無復發(fā)生存期（P=0.034）［14］。卵巢癌中NFAT2的高表達與腫瘤轉(zhuǎn)移及不良預后有關(guān)（P=0.019）［15］。目前NFAT2在肺癌中的研究還很有限，趙立臣等［4］研究了NFAT家族在NSCLC中的作用，發(fā)現(xiàn)NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4在NSCLC中的高表達率分別為52.8%、11.3%、28.3%、47.2%，在腫瘤組織中的表達顯著高于在其配對正常組織中的表達（P＜0.001），但NFAT2表達與NSCLC臨床資料及生存預后之間的關(guān)系尚不清楚［4］。

本課題組通過研究NFAT2對NSCLC發(fā)生發(fā)展及生存預后的影響，一定程度上彌補了NFAT2在肺癌臨床研究上的不足。筆者采用免疫組織化學技術(shù)對315例肺癌組織及164例配對的癌旁正常組織中NFAT2表達進行染色判定，發(fā)現(xiàn)NFAT2在NSCLC癌組織中表達上調(diào)，而對照組全部為低表達。趙立臣等［4］認為NFAT2在NSCLC高表達［4］，這與本研究結(jié)果一致。因此，筆者認為NFAT2在NSCLC中發(fā)揮促癌基因的作用。進一步分析并未發(fā)現(xiàn)NFAT2的表達同臨床病理特征有關(guān)聯(lián)。亞組生存分析顯示，在早期NSCLC中，NFAT2表達上調(diào)預后較差；而在晚期NSCLC中，趨勢相反，但兩者均未見統(tǒng)計學差異。在女性及非吸煙早期NSCLC患者中，發(fā)現(xiàn)NFAT2高表達的患者預后較差。這說明NFAT2對NSCLC預后影響與TNM分期有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)NFAT2能夠促進NSCLC的發(fā)生發(fā)展，但未進行相關(guān)作用機制的探索。現(xiàn)多數(shù)研究認為NFAT2對腫瘤的作用與其能夠調(diào)節(jié)細胞功能有關(guān)。NFAT2能夠下調(diào)E-Cadherin的表達，促進細胞侵襲［16］；在大B細胞淋巴瘤中，NFAT2能夠調(diào)控cmyc、CD40L、BlyS等與細胞生長、腫瘤生存有關(guān)的因子［17］；而在卵巢癌中，NFAT2通過激活ERK1/2/ p38/MAPK信號通路上調(diào)c-myc表達，促進卵巢癌細胞增殖［15］。另有研究發(fā)現(xiàn)，NFAT2調(diào)控靶基因Tks5并介導腫瘤細胞與正常細胞的融合，影響細胞的轉(zhuǎn)移能力［18］。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，NFAT2可調(diào)控靶基因在腫瘤中的表達發(fā)揮促癌作用。在NSCLC中，研究者發(fā)現(xiàn)NFAT2與DNA損傷誘導凋亡抑制基因（DDIAS）啟動子區(qū)域靶向結(jié)合，在A549細胞系中敲除NFAT2可導致DDIAS表達缺失，抑制細胞增殖［19］。本結(jié)果顯示，NFAT2在NSCLC中高表達，與早期女性及非吸煙NSCLC患者不良預后有關(guān)。因此我們推測其可能通過促進腫瘤細胞的細胞增殖能力，增強其轉(zhuǎn)移及侵襲能力來影響預后。

根據(jù)研究結(jié)果推測，作為促癌基因的NFAT2在NSCLC中表達上調(diào)預示著不良的預后結(jié)局，尤其是在早期NSCLC中，這可能與腫瘤的特征有關(guān)聯(lián)。NFAT2可作為NSCLC早期診斷及治療的標志物，筆者仍需擴大樣本對NFAT2在NSCLC中的表達進行驗證，對功能機制予以探索。

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（2016-03-10收稿）

Relationship between expression of NFAT2 and survival prognosis in non-small cell lung cancer

LI Jing-xin1，XU Fang-xiu1，2，WANG Yu1，GUO Yan1，3，QIAN Bi-yun1，4
（1.Department of Cancer Epidemiology and Biostatistics，Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，National Clinical Research Center of Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China；2.Department of Pharmacy，No. 401 Hospital of Chinese People's Liberation Army，Qingdao 266071，China；3.Department of Pathology，Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300060，China；4.School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200025，China）

O bjective：To study the relationship between the NFAT2 expression and the survival prognosis in non-small cell lung cancer（NSCLC）.M ethods：NFAT2 expression were detected by applying immunohistochemistry in 315 NSCLC cancer tissues and 164 adjacent normal tissues.Then，the relationship between NFAT2 expression and survival prognosis was studied in NSCLC.Results：NFAT2 increased in NSCLC tumor tissues（P＜0.001）.The subgroup analysis showed that in the early NSCLC women and non-smokers，NFAT2 expression was significantly correlated with shortened survival（P=0.003，P=0.001）.Conclusion：NFAT2 is a risk factor for NSCLC.NFAT2 high expression may indicate poor prognosis.

NFAT2；non-small cell lung cancer；immunohistochemistry

論著

R730.2

A

1006-8147（2016）05-0417-04

國家自然科學基金資助項目（81573231）；天津市自然科學基金資助項目（13JCYBJC23100）

李晶鑫（1988-），女，碩士在讀，研究方向：肺癌病因?qū)W及分子流行病學；通信作者：錢碧云，E-mail：qianbiyun@126.com。