金麗

（浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州310012）

水飛薊賓增強(qiáng)TRAIL對MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性研究

金麗

（浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州310012）

目的探討中藥活性成分水飛薊賓對增強(qiáng)TRAIL對三陰乳腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)的能力并研究其機(jī)制。方法將三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231分為對照組、水飛薊賓組、TRAIL組及水飛薊賓聯(lián)合TRAIL組，MTT法檢測MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞活力，Annexin V/PI染色檢測MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，免疫共沉淀聯(lián)合Western blot法檢測MDA-MB-231細(xì)胞FADD-caspase-8死亡受體復(fù)合物的形成，Western blot法檢測MDA-MB-231細(xì)胞caspase-8的活化和FADD的表達(dá)水平。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TRAIL體外單獨(dú)治療僅能輕微抑制MDA-MB-231的細(xì)胞活力，聯(lián)合水飛薊賓后TRAIL對MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制率顯著提升。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TRAIL體外單獨(dú)治療對MDA-MB-231的凋亡誘導(dǎo)活性較低，聯(lián)合水飛薊賓后TRAIL對MDA-MB-231的凋亡誘導(dǎo)活性顯著提高。免疫共沉淀聯(lián)合western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水飛薊賓在體外能顯著上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中FADD蛋白的表達(dá)水平而TRAIL不能影響其表達(dá)，同時水飛薊賓還能顯著促進(jìn)TRAIL依賴的FADD-caspase-8復(fù)合物的形成和caspase-8的活化。轉(zhuǎn)染FADD siRNA后，水飛薊賓對TRAIL的協(xié)同作用喪失。結(jié)論水飛薊賓通過上調(diào)去泛素化酶FADD的表達(dá)水平促進(jìn)TRAIL依賴的RIP1蛋白的去泛素化進(jìn)而誘導(dǎo)三陰乳腺癌細(xì)胞caspase-8的活化和凋亡的發(fā)生。

水飛薊賓；TRAIL；三陰乳腺癌；FADD；caspase-8；凋亡

三陰乳腺癌是乳腺癌的一種亞型，其癌細(xì)胞表面不表達(dá)雌激素受體、孕激素受體和Her2受體，因此缺乏靶向治療的生物靶點(diǎn)，只能采取化療或生物治療的方法［1］。然而在臨床治療中往往會發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對藥物治療的敏感性很低，因此尋找輔助治療藥物提高化療或生物治療的敏感性有十分重要的意義［2］。本研究的目的在于研究中藥活性成分水飛薊賓是否能發(fā)揮對腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配 體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的協(xié)同作用，報道如下。

1　材料與方法

1.1材料噻唑藍(lán)（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT），水飛薊賓，TRAIL購于美國R&D Systems，Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。細(xì)胞提取液、Fas相關(guān)死亡域蛋白（Fas-associating protein with a novel death domain，F(xiàn)ADD）抗體、前caspase-8（p ro-caspase-8）抗體、活化型 caspase-8（cleaved caspase-8）抗體和 β-actin抗體購于美國 Cell Signaling。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購于美國Santa Cruz。FADD siRNA購于廣州銳博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen。ECL（增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物）試劑盒購于美國Pierce。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)本研究從2014年2月～2015年12月完成于本院實(shí)驗(yàn)室。人三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231購于美國ATCC（美國模式菌種收集中心）。將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。細(xì)胞每2～3天傳代1次，傳代時，用胰酶消化液使細(xì)胞進(jìn)入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細(xì)胞懸液按1:3稀釋后傳代。

1.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將MDA-MB-231細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組、水飛薊賓組、TRAIL組和水飛薊賓+TRAIL組，分組培養(yǎng)方法詳見表1，藥物處理時間為48小時。（1）細(xì)胞活力檢測：藥物處理完畢后在培養(yǎng)體系中加入20μL 5g/L MTT再培養(yǎng)4小時，棄去上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，在570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，細(xì)胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD治療組）/OD對照組×100%。（2）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：藥物處理完畢后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20分鐘，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。（3）免疫共沉淀：藥物處理完畢后對MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取2×106的各組細(xì)胞用免疫沉淀緩沖液進(jìn)行裂解，緩沖液的成分如下：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），1%NP-40細(xì)胞裂解液，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%混合蛋白酶抑制劑（Sigma-Aldrich）。MDA-MB-231細(xì)胞在裂解液下處理15分鐘后，將其在12000g下離心10分鐘，收取上清液并在其中加入FADD抗體孵育過夜，之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2小時。孵育完成后將其在1200g速度下離心5分鐘，將瓊脂糖珠離心至管底，之后將上清液小心吸去，瓊脂糖珠用免疫沉淀緩沖液洗滌2次后加入western blot上樣緩沖液，沸水浴煮5分鐘后備用，用于檢測與RIP1結(jié)合的泛素蛋白。（4）Western blot實(shí)驗(yàn)：藥物處理完畢后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2遍并提取總蛋白質(zhì)。將蛋白提取液或免疫共沉淀處理樣品用12.5%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用FADD抗體、procaspase-8抗體、cleaved caspase-8抗體或β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2小時，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

表1　MDA-MB-231細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組方法

2　結(jié)果

2.1水飛薊賓顯著提高TRAIL對MDA-MB-231的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示水飛薊賓或TRAIL單用對MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷活性較弱，但兩者聯(lián)合后，其對乳腺癌腫瘤細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，水飛薊賓能顯著提高TRAIL對MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性，表明水飛薊賓和TRAIL存在協(xié)同抗乳腺癌效應(yīng)，能顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡通路。詳見表2。

表2　各組對MDA-MB-231的抗腫瘤活性（±s）

表2　各組對MDA-MB-231的抗腫瘤活性（±s）

與水飛薊賓+TRAIL組比較**P＜0.05

組別　n/孔　細(xì)胞活力抑制率（%）凋亡誘導(dǎo)率（%）對照組　3　0　1.8±0.3水飛薊賓組　3　8.8±0.6**　4.3±0.3**TRAIL組　3　13.4±0.8**　9.5±0.4**水飛薊賓+TRAIL組　3　60.4±3.7　31.6±2.5

2.2水飛薊賓促進(jìn)TRAIL依賴的死亡受體復(fù)合物的形成和 caspase-8的活化Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果水飛薊賓能顯著上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中FADD的表達(dá)水平，而TRAIL對FADD的表達(dá)無影響（圖1）。進(jìn)一步的免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水飛薊賓能顯著促進(jìn)TRAIL依賴的FADD-caspase-8死亡受體復(fù)合物的形成（圖2），進(jìn)而誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的caspase-8的活化（圖3）。

圖1　水飛薊賓上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中FADD的表達(dá)水平

圖2　水飛薊賓促進(jìn)TRAIL依賴的FADD-caspase-8死亡受體復(fù)合物的形成

圖3　水飛薊賓促進(jìn)TRAIL依賴的caspase-8的活化

2.3水飛薊賓通過上調(diào)FADD的表達(dá)水平增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞對TRAIL的敏感性為了明確水飛薊賓顯著提高TRAIL對MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷活性的機(jī)制是通過上調(diào)FADD的表達(dá)，作者先將MDA-MB-231細(xì)胞用FADD siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染后再用TRAIL聯(lián)合水飛薊賓進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FADD siRNA能顯著抑制水飛薊賓聯(lián)合TRAIL對MDA-MB-231細(xì)胞caspase-8的活化作用 （圖4），同時抑制兩者聯(lián)合對MDA-MB-231的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（表3）。

圖4　FADD siRNA抑制水飛薊賓聯(lián)合TRAIL對MDAMB-231細(xì)胞caspase-8的活化

表3　FADD siRNA抑制水飛薊賓聯(lián)合TRAIL對MDAMB-231的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（±s）

表3　FADD siRNA抑制水飛薊賓聯(lián)合TRAIL對MDAMB-231的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（±s）

與水飛薊賓+TRAIL+FADD siRNA組比較*P＜0.05

組別　細(xì)胞活力抑制率（%）凋亡誘導(dǎo)率（%）對照組　0　1.7±0.3水飛薊賓+TRAIL組　61.5±3.8*　31.9±2.4*水飛薊賓+TRAIL+FADD siRNA組　20.6±1.2　11.8±1.0

3　討論

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體 （TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是TNF家族的成員。研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，卻不影響正常組織細(xì)胞的功能，因此TRAIL被認(rèn)為是一種有很好前景的低毒抗腫瘤藥物［3］。盡管如此，研究也發(fā)現(xiàn)很多腫瘤細(xì)胞對TRAIL的抗腫瘤作用不敏感，并能抵抗TRAIL依賴的凋亡效應(yīng)［4-5］。因此如何提高腫瘤細(xì)胞對TRAIL的敏感性是目前研究工作的重點(diǎn)。在TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的通路中，TRAIL首先與死亡受體4（DR4）或死亡受體5（DR5）結(jié)合，結(jié)合后的受體復(fù)合物能募集細(xì)胞中的FADD蛋白，而募集的FADD蛋白則又從細(xì)胞質(zhì)中募集caspase-8前體，形成FADD-caspase-8死亡受體復(fù)合物，從而激活caspase-8并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此細(xì)胞中FADD蛋白的表達(dá)水平?jīng)Q定了腫瘤細(xì)胞對TRAIL的敏感性［6-7］。

水飛薊賓是從水飛薊屬植物奶薊種子中提取的一種黃酮類化合物，臨床上主要用來保護(hù)肝細(xì)胞，對黃疸，肝炎，膽囊疾病有良好的療效［8］。近年來，水飛薊賓還被發(fā)現(xiàn)具有一定的抗腫瘤活性，對于多種腫瘤均具有抑制作用［9-10］，然而將其作為輔助藥物提高腫瘤細(xì)胞的治療敏感性的研究卻少見報道。在本研究中，通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可以顯著提高三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231對TRAIL的敏感性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡。

為了探究水飛薊賓發(fā)揮對TRAIL協(xié)同作用的分子機(jī)制，通過Western blot實(shí)驗(yàn)證明了水飛薊賓能顯著上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中FADD的表達(dá)水平，而TRAIL對FADD的表達(dá)無影響，提示FADD可能是水飛薊賓發(fā)揮協(xié)同作用的靶蛋白。由于TRAIL通過激活caspase-8蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此進(jìn)一步通過免疫共沉淀方法證明了水飛薊賓能促進(jìn)TRAIL依賴的FADD-caspase-8死亡受體復(fù)合物的形成和caspase-8的活化。同時，當(dāng)在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FADD siRNA抑制FADD的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)水飛薊賓對 TRAIL的協(xié)同抗腫瘤作用喪失。這些結(jié)果證明了水飛薊賓增強(qiáng)TRAIL對三陰乳腺癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的機(jī)制是通過FADD/ caspase-8途徑。

綜上所述，水飛薊賓能顯著提高三陰乳腺癌細(xì)胞對TRAIL的敏感性，并發(fā)現(xiàn)水飛薊賓通過上調(diào)FADD的表達(dá)水平促進(jìn)TRAIL依賴的死亡受體復(fù)合物的形成進(jìn)而誘導(dǎo)三陰乳腺癌細(xì)胞caspase-8的活化和凋亡的發(fā)生，為水飛薊賓輔助治療提高TRAIL的抗腫瘤活性提供了理論依據(jù)。

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