齊明月 杜燕 劉未平 陳斌 梁廣鐵 徐邦牢 劉大漁

摘 要 發(fā)展了一種微流控芯片紙基細(xì)菌分析技術(shù)，用于多重細(xì)菌鑒定與抗生素敏感性測(cè)試。制備了陣列培養(yǎng)池芯片，以濾紙作為襯底固定顯色培養(yǎng)基和抗生素。利用PVDF疏水薄膜止流閥，將尿液樣品引入芯片并分隔于不同培養(yǎng)池。借助于培養(yǎng)池陣列的空間分辨力，實(shí)現(xiàn)多重細(xì)菌分析。根據(jù)特異性顯色結(jié)果實(shí)現(xiàn)細(xì)菌鑒定，通過實(shí)時(shí)顯色強(qiáng)度分析實(shí)現(xiàn)細(xì)菌定量，依據(jù)抑制顯色反應(yīng)的最低抗生素濃度確定抗生素敏感性。以3種泌尿系統(tǒng)感染常見病原菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌）為模擬測(cè)試對(duì)象進(jìn)行分析，結(jié)果表明，芯片方法可以在18 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)3種細(xì)菌的同時(shí)鑒定及6種抗生素敏感性測(cè)試。對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示，芯片法與傳統(tǒng)方法細(xì)菌鑒定和抗生素敏感性測(cè)試結(jié)果一致性分別為94.1%和93.9%。本研究建立的微流控芯片細(xì)菌分析方法簡(jiǎn)便快速，非常適合于醫(yī)療資源匱乏條件下的細(xì)菌分析。

關(guān)鍵詞 微流控芯片； 細(xì)菌鑒定； 抗生素敏感性測(cè)試； 快速檢測(cè)

1 引 言

尿路感染是非常常見的感染性疾病[1，2]，多由細(xì)菌引起，最常見的是大腸埃希菌，其次為糞腸球菌、銅綠假單胞菌、葡萄球菌屬細(xì)菌和肺炎克雷伯菌等[2]。尿路感染可引起局部和全身不適癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致腎功能衰竭，甚至感染性休克，因而需要及時(shí)診斷和治療。臨床治療尿路感染病例時(shí)，醫(yī)生需要了解病原菌的種類、數(shù)量以及對(duì)于抗生素的敏感性，以便進(jìn)行針對(duì)性治療[3，4]。因此，臨床上的細(xì)菌檢測(cè)平臺(tái)，需具備多重病原菌快速定性與定量分析以及抗生素敏感性測(cè)試的功能。

傳統(tǒng)的尿路感染病原菌鑒定及抗生素敏感性試驗(yàn)（Antibiotic susceptibility testing， AST）主要采用平板培養(yǎng)法，但是耗時(shí)較長(zhǎng)（一般需2～3天）[5，6]，不利于及時(shí)診斷和抗生素選擇指導(dǎo)。近年開發(fā)出了尿路感染病原菌檢測(cè)新方法，如免疫熒光法[7]、干化學(xué)分析法[8]、流式細(xì)胞法[9]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）[10]、質(zhì)譜法[11]及新一代測(cè)序技術(shù)[12]等，雖然可以顯著縮短檢測(cè)時(shí)間，但這些方法大多依賴于大型或者精密設(shè)備，難以在基層醫(yī)療單位推廣。因此，亟需簡(jiǎn)便、快速的尿路感染病原菌檢測(cè)方法。

近年發(fā)展起來的微流控芯片細(xì)菌分析技術(shù)[13～19]較之傳統(tǒng)方法具有很多優(yōu)勢(shì)。首先，芯片細(xì)菌分析平臺(tái)小巧便攜，操作簡(jiǎn)便，非常適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[20]；其次，芯片微分析平臺(tái)有利于提高測(cè)試通量和降低試樣消耗量[21]，便于實(shí)現(xiàn)高通量分析；此外，大多數(shù)芯片細(xì)菌分析方法可以免去預(yù)增菌步驟，因而可以顯著縮短分析時(shí)間[22]。因此，微流控芯片技術(shù)為細(xì)菌分析提供了一種理想的解決方案。然而，目前報(bào)道的微流控芯片細(xì)菌分析大多只針對(duì)單一種類細(xì)菌檢測(cè)[16，18，20]，無法滿足臨床上對(duì)病原菌的分析需求。

本研究組在前期工作[23]中進(jìn)行了微流控芯片上多重細(xì)菌鑒定的初步探索。在此基礎(chǔ)上，本研究將多重細(xì)菌鑒定與AST結(jié)合，為芯片病原分析方法用于臨床診療奠定基礎(chǔ)。在芯片上進(jìn)行多重細(xì)菌分析與AST，要求同步完成多重生化反應(yīng)，因而需要解決包括多重試劑的引入、多重反應(yīng)的有效分隔以及多重檢測(cè)指標(biāo)的判定問題。針對(duì)上述問題，本研究發(fā)展了一種微流控芯片紙基細(xì)菌分析方法，在芯片培養(yǎng)池中以濾紙作為襯底組合固定菌種特異性顯色培養(yǎng)基和抗生素。濾紙成分為纖維素，具有疏松多孔結(jié)構(gòu)，不僅具有良好的生物相容性， 而且易于固定試劑[24]。借助于芯片集成PVDF疏水薄膜止流閥，引入芯片的尿液樣品被分隔于不同培養(yǎng)池，以實(shí)現(xiàn)多重顯色反應(yīng)。根據(jù)特異性顯色結(jié)果實(shí)現(xiàn)細(xì)菌定性鑒定，通過實(shí)時(shí)顯色強(qiáng)度分析實(shí)現(xiàn)細(xì)菌定量測(cè)定，依據(jù)抑制顯色反應(yīng)的最低抗生素濃度確定抗生素敏感性，因此在芯片上實(shí)現(xiàn)了多重細(xì)菌的同時(shí)定性與定量分析和AST。本方法簡(jiǎn)便快速，尤其適于醫(yī)療資源匱乏條件下的細(xì)菌快速分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

TS2A四通道微量注射泵（保定蘭格公司）；XW80A漩渦振蕩器（上海書培公司）；尼康D7100數(shù)碼相機(jī)（日本尼康公司）；中速定性濾紙（杭州新華公司）；SU8 3035光刻膠（MicroChem公司）；聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）前體及引發(fā)劑（Dow Corning公司）；PVDF膜（孔徑0.23 μm，美國(guó)Millipore公司）；海藻酸鈉（上海生工公司）；系列抗生素（Sigma公司）；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞腸球菌特異性顯色培養(yǎng)基（青島海博公司）；血平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、McFarland 0.55.0 麥?zhǔn)媳葷峁埽◤V東環(huán)凱公司）；金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC25922）、糞腸球菌（ATCC29212）由本院檢驗(yàn)科微生物室菌種保藏中心提供；尿路感染病人的尿液由本院檢驗(yàn)科微生物室提供。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 微流控裝置

本實(shí)驗(yàn)使用自行搭建的微型化細(xì)菌培養(yǎng)裝置 [23]。微流控芯片包含3層PDMS結(jié)構(gòu)，采用軟刻蝕工藝加工[25]而成。芯片頂層包含一系列通孔，分別對(duì)應(yīng)流體出入口以及培養(yǎng)池排氣孔（直徑1 mm），后者以PVDF膜封閉；芯片中間層含有一系列通孔（直徑3 mm），與底層無結(jié)構(gòu)平板封接后形成培養(yǎng)池。培養(yǎng)池上游的折線形通道（長(zhǎng)5.5 mm、寬0.05 mm）與進(jìn)樣通道連接；培養(yǎng)池下游借助通道與頂層排氣孔連接。芯片各層經(jīng)90℃烘烤2 h，紫外燈照射過夜。芯片封接在無菌條件下進(jìn)行，先將中層與底層封接，然后將固定有特異性培養(yǎng)基及抗生素的紙片分別置于培養(yǎng)池中，等離子處理后將中層與頂層封接。最后，將PVDF膜借雙面膠貼附于排氣孔處，即制得完整芯片。

2.3 芯片上的實(shí)驗(yàn)操作

將質(zhì)控菌株取出后接種于血平板上，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)菌進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲菌體。挑取數(shù)個(gè)菌落于無菌生理鹽水中混勻后測(cè)定濁度，調(diào)整濁度至0.5 MCF，相當(dāng)于1.5 × 108 cfu/mL細(xì)菌濃度，系列稀釋后備用。臨床標(biāo)本為采集的中段尿液，直接灌注入芯片。進(jìn)樣時(shí)，通過微量注射泵向毛細(xì)管中吸入1 mL 細(xì)菌懸浮液，然后將毛細(xì)管與芯片進(jìn)樣通道連接，并以50 μL/min 流量注入。待全部培養(yǎng)池充盈后，驅(qū)除多余菌液， 并向通道中快速灌入1.5%（w/V）海藻酸鈉溶液。進(jìn)樣后將芯片置于便攜式培養(yǎng)裝置中，37℃培養(yǎng)18 h。

2.4 細(xì)菌增殖檢測(cè)

以金黃色葡萄球菌（ATCC25923）為例，比較芯片培養(yǎng)法與傳統(tǒng)肉湯培養(yǎng)法中的細(xì)菌增殖狀況。于0，2，4，6，8 和10 h 分別收獲兩組培養(yǎng)細(xì)菌菌液，用傾注平板法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，每2 h檢測(cè)一次細(xì)菌數(shù)量。

2.5 芯片上的細(xì)菌定性與定量分析

芯片細(xì)菌培養(yǎng)每隔30 min拍照一次，使用Photoshop軟件提取照片中培養(yǎng)池部位光密度值并描繪曲線。根據(jù)顯色反應(yīng)顏色判定細(xì)菌種類，依據(jù)顯色時(shí)間確定細(xì)菌數(shù)量。設(shè)定培養(yǎng)池背景顏色強(qiáng)度偏差值3倍（3SD）為閾值，根據(jù)細(xì)菌顯色強(qiáng)度達(dá)到閾值所需時(shí)間（Time threshold，Tt值）推斷細(xì)菌初始濃度。

2.6 芯片上的細(xì)菌抗生素藥敏測(cè)試

根據(jù)針對(duì)細(xì)菌種類選擇抗生素，用于AST。對(duì)于金黃色葡萄球菌，選取紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、萬古霉素、慶大霉素、左氧氟沙星；對(duì)于大腸桿菌，選取亞胺培南、頭孢唑啉、氨芐青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素；對(duì)于糞腸球菌，選取紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素、萬古霉素、左氧氟沙星。

3 結(jié)果與討論

3.1 微流控芯片設(shè)計(jì)

本研究所用的微流控裝置能夠?yàn)榧?xì)菌生長(zhǎng)提供適宜的溫度、濕度以及氧含量。培養(yǎng)池體積約為19 μL，容納11 μL顯色培養(yǎng)基及8 μL細(xì)菌懸液，可為細(xì)菌生長(zhǎng)提供足夠的養(yǎng)分及空間。經(jīng)培養(yǎng)后，根據(jù)培養(yǎng)基顯色反應(yīng)顏色判定細(xì)菌種類，依據(jù)顯色時(shí)間確定細(xì)菌數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)所用微流控芯片含63個(gè)培養(yǎng)池，分別用于細(xì)菌鑒定與AST。因此，每張芯片可同時(shí)鑒定3種細(xì)菌，以及6種抗生素3個(gè)水平的AST。結(jié)合菌種特異性培養(yǎng)基的顏色分辨力及培養(yǎng)池陣列的空間分辨力，本方法可實(shí)現(xiàn)多重細(xì)菌的定性與定量分析和抗生素敏感性判定。

本研究在以濾紙作為襯底的培養(yǎng)池中實(shí)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)和顯色反應(yīng)。濾紙具有疏松多孔結(jié)構(gòu)，可以簡(jiǎn)便地固定顯色培養(yǎng)基和抗生素。紙片封裝時(shí)，將固定有抗生素的紙片置于頂層，固定有瓊脂顯色培養(yǎng)基的紙片置于底層。樣品進(jìn)入培養(yǎng)池時(shí)，由于紙片及瓊脂的阻滯效應(yīng)，可有效防止灌液時(shí)抗生素被流體沖走。

為防止培養(yǎng)池中試劑交互干擾，設(shè)計(jì)了一種基于PVDF膜的止流閥（圖2）。初始狀態(tài)下芯片主通道阻力大于分支通道，可以保證流體優(yōu)先經(jīng)分支通道充盈培養(yǎng)池。培養(yǎng)池下游通道連接排氣口，后者以PVDF膜覆蓋。疏水性PVDF膜具有透氣特性，在液體充盈培養(yǎng)池過程中，允許氣體通過排氣口排出；而當(dāng)液體接觸PVDF膜后，由于流動(dòng)阻力顯著增加而無法通過。利用上述設(shè)計(jì)，樣品可以順序充滿一系列培養(yǎng)池，不會(huì)造成試劑的交叉污染。完成進(jìn)樣后，主通道引入粘性的海藻酸鈉溶液封閉培養(yǎng)池入口，避免培養(yǎng)池間的交互影響。采用與抗生素分子質(zhì)量相當(dāng)?shù)匿宸铀{(lán)驗(yàn)證芯片性能。溴酚藍(lán)為靈敏酸堿指示劑，低pH條件下呈黃色，遇堿則變藍(lán)。將固定溴酚藍(lán)的濾紙片與空白濾紙片相間封裝于培養(yǎng)池中，向芯片中灌入0.1% NaOH溶液，溴酚藍(lán)未擴(kuò)散至相鄰的空白濾紙（圖3）。此結(jié)果表明，進(jìn)樣過程中，芯片培養(yǎng)池中的試劑未發(fā)生交叉污染。

圖2 芯片操作步驟示意圖。芯片培養(yǎng)池上游的折線形通道與進(jìn)樣通道連接， 下游通道與頂層排氣孔連接，后者使用PVDF膜覆蓋。進(jìn)樣過程：Ⅰ. 樣品引入進(jìn)樣通道。由于主通道與分支通道阻力差異，標(biāo)本優(yōu)先進(jìn)入分支通道；Ⅱ. 當(dāng)樣品接觸到PVDF膜，由于表面張力效應(yīng)分支通道內(nèi)阻力增加因而起到止流作用，樣品繼續(xù)充盈下游培養(yǎng)池；Ⅲ. 待全部培養(yǎng)池充盈后，驅(qū)除主通道殘留液體；Ⅳ. 主通道引入海藻酸鈉封閉培養(yǎng)池。

3.2 芯片上的細(xì)菌增殖

以金黃色葡萄球菌為例，比較了芯片培養(yǎng)方法與傳統(tǒng)肉湯培養(yǎng)方法中細(xì)菌的增殖情況。平板傾注法計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，使用兩種方法培養(yǎng)的細(xì)菌在此階段均呈指數(shù)增殖狀態(tài)（圖4），細(xì)菌增殖率無顯著差異。

3.3 芯片上的細(xì)菌定性和定量分析

根據(jù)顯色培養(yǎng)基說明，經(jīng)培養(yǎng)后，大腸桿菌顯粉紅色， 金黃色葡萄球菌顯藍(lán)綠色， 糞腸球菌顯黃色，如培養(yǎng)池中出現(xiàn)相應(yīng)顏色則判定存在上述細(xì)菌。

由于環(huán)境中的細(xì)菌污染，健康人尿液樣品也可能存在少量細(xì)菌。因此，細(xì)菌的準(zhǔn)確定量對(duì)于尿路感染診斷是非常重要的。參考臨床判定標(biāo)準(zhǔn)，如尿細(xì)菌密度≥105 /mL，判定為尿路感染；密度介于104～105/mL，為可疑陽性；如<104 /mL，判斷為污染。由于細(xì)菌初始數(shù)量與顯色時(shí)間存在相關(guān)性[26]，本研究發(fā)展了一種實(shí)時(shí)顯色強(qiáng)度定量方法，即根據(jù)Tt值推斷細(xì)菌初始數(shù)量。在芯片上分別接種系列濃度金黃色葡萄球菌，拍照結(jié)果顯示細(xì)菌顯色時(shí)間Tt值與初始細(xì)菌密度相關(guān)（圖5）。線性回歸分析顯示金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌的初始數(shù)量與Tt值均存在較好的線性關(guān)系（金黃色葡萄球菌R2=0.9576；大腸桿菌R2=0.9615；糞腸球菌R2=0.9464）。因此，依據(jù)Tt值可以推斷出初始細(xì)菌密度。

3.4 抗生素敏感性測(cè)試

目前，由于廣泛存在的細(xì)菌耐藥問題，AST對(duì)于個(gè)體化治療指導(dǎo)具有重要價(jià)值。本研究發(fā)展的芯片AST方法同樣依賴于顯色反應(yīng)，其原理是足夠劑量的敏感抗生素通過抑制細(xì)菌生長(zhǎng)使顯色反應(yīng)呈現(xiàn)陰性。參照美國(guó)CLSI 對(duì)MIC（最小抑菌濃度）的解釋，使用敏感、中介和耐藥3個(gè)水平來解讀細(xì)菌對(duì)于某種抗生素的敏感度[27]。如圖6Ⅲ所示的大腸桿菌對(duì)于亞胺培南的敏感性測(cè)試，細(xì)菌對(duì)于該抗生素的敏感性依據(jù)最低的顯色抑制濃度判定。亞胺培南對(duì)大腸桿菌的MIC解釋標(biāo)準(zhǔn)中，敏感，中介、耐藥濃度轉(zhuǎn)折點(diǎn)分別為1，2和4 μg/mL。在抗生素（-）組顯色的前題下，如以上3個(gè)藥物濃度組均未顯色，則判定對(duì)該抗生素敏感；如1 μg/mL濃度組顯色，判定為中介；如1和2 μg/mL顯色， 或3個(gè)濃度組都顯色，判定為耐藥。同理判斷其它抗生素MIC（金黃色葡萄球菌對(duì)克林霉素見圖6Ⅰ，腸球菌對(duì)左氧氟沙星見圖6Ⅱ）。

3.5 臨床樣本分析

利用傳統(tǒng)方法與芯片方法平行測(cè)試40例臨床可疑尿液感染標(biāo)本。傳統(tǒng)方法和芯片方法對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的陽性檢出例數(shù)分別為17例和16例，二者一致性為94.1%。由于本實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)菌特異性顯色培養(yǎng)基種類有限，芯片方法細(xì)菌鑒定僅限于3種細(xì)菌，因而總體陽性檢出率顯著低于對(duì)照方法（40% vs 80%），這需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中增加顯色培養(yǎng)基種類加以解決。對(duì)照常規(guī)方法檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)芯片方法鑒定陰性樣品中待檢致病菌數(shù)量均低于103 cfu/mL，而鑒定為細(xì)菌（+）的尿液標(biāo)本中致病菌數(shù)量多數(shù)在105 cfu/mL水平。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芯片法與傳統(tǒng)方法AST結(jié)果的總體一致率為93.9%， 顯示兩種方法具有較好的一致性。其中，金黃色葡萄球菌與糞腸球菌AST結(jié)果一致率均為100%，而大腸桿菌的AST結(jié)果一致率稍低，為90.7%（表1），這種差異可能是由于大腸桿菌顯色反應(yīng)定量偏差導(dǎo)致。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)展了微流控芯片多重細(xì)菌鑒定和AST方法，具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、低消耗和高通量的優(yōu)勢(shì)，適合于醫(yī)療資源匱乏條件下的細(xì)菌分析。后續(xù)工作將進(jìn)一步擴(kuò)展檢測(cè)對(duì)象范圍，以提高該技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用性能。

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QI MingYue1， DU Yan1， LIU WeiPing1， CHEN Bin1， LIANG GuangTie1，2，

XU BangLao*1，2， LIU DaYu1，2

1（Department of Laboratory Medicine， Guangzhou First People′s Hospital，

Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510180， China）

2 （Clinical Molecular Medicine and Molecular Diagnosis Key Laboratory of Guangdong Province， Guangzhou 510180， China）

Abstract A microfluidic chip assay was described for bacteria identification and antibiotic susceptibility test （AST）. Filter paper pads were embedded in arrayed microchambers， with immobilized antibiotics and chromogenic medium. By taking advantage of the polyvinylidene fluoride （PVDF） membrane based valves， urine sample introduced was distributed in individual chambers without cross contamination. The simultaneous analysis of multiple bacteria was achieved by using the culture chamber array design. The identification of a bacterium was based on its specific colorimetric result. The density of a bacterium was determined by realtime monitoring color intensity in the chamber， and its susceptibility to an antibiotic was determined relying on the lowest antibiotic concentration that inhibited the colorimetric reaction. A set of three common uropathogenic bacteria were selected as models to test the microfluidic approach. Our results showed that the developed microfluidic assay was able to complete bacteria identification and the sixantibiotic AST in 18 h. In comparison with the conventional method， the microchip method showed a coincidence of 94.1% and 93.9% with regard to bacteria identification and AST， respectively. The developed microfluidic approach is simple and rapid， thus hold the potential to serve as a powerful tool for bacterial analysis under conditions of poor medical resource.

Keywords Microfluidic chip； Bacterial identification； Antibiotic susceptibility testing； Rapid detection

（Received 14 January 2016； accepted 3 February 2016）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 81371649， 81271730，81501831） and the Natural Science Foundation of Guangdong Province， China （No. 2014A030313677）