肖昌彬 劉秋桃 豆小文 楊美華 孔維軍 萬(wàn)麗

摘 要 建立了一種快速、靈敏檢測(cè)中藥麥芽中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A， OTA）含量的間接競(jìng)爭(zhēng)流式微球方法。麥芽樣品經(jīng)60%甲醇/PBS提取，加入20%甲醇/PBS溶液稀釋5倍后，離心取上清液制備樣品。在編碼熒光微球上偶聯(lián)牛血清白蛋白OTA（BSAOTA）復(fù)合物，與樣品中OTA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗OTA特異性抗體，然后加入FITCIgG孵育，離心洗滌后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)微球表面的平均熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)樣品中OTA的準(zhǔn)確定性定量測(cè)定。本方法檢測(cè)OTA的半數(shù)抑制濃度IC50為1.20 ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.9892，檢出限（IC10）為0.12 ng/mL， 加樣回收率為93.9%～97.4%，RSD<3.6%。16份實(shí)際麥芽樣品中檢測(cè)到2個(gè)陽(yáng)性樣品，OTA的最高含量為3.83

SymbolmA@ g/kg，未超出歐盟的OTA限量標(biāo)準(zhǔn)，與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）法檢測(cè)結(jié)果相一致。本方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、可靠，可拓展用于其它復(fù)雜基質(zhì)中多種真菌毒素的定性與定量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 流式微球技術(shù)；間接競(jìng)爭(zhēng)；麥芽；赭曲霉毒素A；快速檢測(cè)

1 引 言

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A， OTA）是由曲霉屬和青霉屬真菌產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物[1]，具有嚴(yán)重的致癌、致畸、致突變及肝細(xì)胞毒性、免疫抑制和生殖紊亂等毒性作用[2]，已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)[3]列為人類可能的致癌物（2B級(jí)），也被美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)計(jì)劃[4]定為極有可能對(duì)人類產(chǎn)生致癌性的物質(zhì)。OTA是食品、農(nóng)產(chǎn)品及農(nóng)作物、藥用植物中主要的外源性有害污染物，不僅會(huì)影響相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量，而且對(duì)人類健康和生命安全存在潛在的威脅[5，6]。世界各國(guó)已對(duì)其制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，如歐盟聯(lián)合委員會(huì)規(guī)定谷物中OTA的限量為5.0 μg/kg，谷物制品及其相關(guān)產(chǎn)品中OTA的限量為3.0 μg/kg，酒和葡萄汁飲料中OTA的限量為2.0 μg/L[ 7]。因此，開發(fā)簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏且特異性的檢測(cè)方法，對(duì)于保證食品、農(nóng)產(chǎn)品及藥用植物的安全使用以及保證人類健康至關(guān)重要[8]。

OTA的檢測(cè)大多采用儀器分析技術(shù)[9～11]，如液相色譜熒光法（HPLCFLD）及串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）等。雖然這些分析方法具有靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但需大型的昂貴的儀器，操作步驟繁瑣、耗時(shí)；此外，食品、農(nóng)產(chǎn)品、中藥材等基質(zhì)成分復(fù)雜，需要嚴(yán)格的前處理和凈化步驟，給實(shí)際操作帶來諸多困難。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）以其高特異性、高選擇性、對(duì)樣品純度要求不高及樣品處理量大的優(yōu)點(diǎn)，而被用于復(fù)雜基質(zhì)中OTA的快速篩查檢測(cè)[12，13]，但存在靈敏度低、重復(fù)性差等不足[14]。

流式微球技術(shù)（Cytometric bead array， CBA）[15～20]以一系列熒光強(qiáng)度不同的編碼微球?yàn)檩d體，通過激光束激發(fā)熒光編碼微球，利用流式細(xì)胞儀分析微球本身和表面熒光強(qiáng)度完成數(shù)據(jù)收集和分析，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物靈敏、準(zhǔn)確的快速檢測(cè)，且重復(fù)性和穩(wěn)定性好、分析時(shí)間短、假陽(yáng)率低。該技術(shù)已被應(yīng)用到多種基質(zhì)中大分子及小分子化合物的高通量檢測(cè)[21～25]。OTA為小分子化合物，具有半抗原性、分子量小、單一抗原表位、本身不具免疫原性等特點(diǎn)[26]，多采用基于“抗體抗原”特異性識(shí)別的競(jìng)爭(zhēng)型流式微球免疫分析技術(shù)，而間接競(jìng)爭(zhēng)模式因其偶聯(lián)過程中不損傷，且不阻礙抗體與抗原的識(shí)別位點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用[27，28]。

麥芽為中醫(yī)臨床常用的中藥材，具有行氣消食、健脾開胃、退乳消腫[29]等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，麥芽還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抑制膽固醇與血脂增加、預(yù)防心血管疾病、增強(qiáng)免疫能力等作用[30]。麥芽還是糧食、飼料和釀酒的重要原料。麥芽的制備加工過程中[31]，極易霉變變質(zhì)產(chǎn)生真菌毒素如OTA等。所以，有必要建立適合麥芽中OTA的現(xiàn)場(chǎng)、靈敏、高效的檢測(cè)方法[32，33]。

本研究建立了一種基于間接競(jìng)爭(zhēng)模式的流式微球方法，在熒光微球表面偶聯(lián)牛血清白蛋白（BSA）OTA復(fù)合物，與樣品中OTA共同競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體，加入熒光標(biāo)記的二抗探針后，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)微球本體和表面熒光，實(shí)現(xiàn)OTA的定性定量測(cè)定。本方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)通量大、檢出限低、靈敏度高、特異性好、受基質(zhì)干擾小，可推廣用于中藥材等復(fù)雜基質(zhì)中其它真菌毒素的分析和檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)： LC20AD XR液相色譜儀（日本島津公司），5500 QTRAP質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；TUS200P恒溫振蕩金屬?。ㄉ虾Ｒ缓愎荆籏Q500超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ANKE TGL16C高速離心機(jī)（上海安亭公司）；AB135S電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）

羧基化紅色熒光微球FC05F（Φ 4.95 μm，激發(fā)波長(zhǎng)630 nm，發(fā)射波長(zhǎng)690 nm）購(gòu)自美國(guó)Bangs Laboratories公司；OTA對(duì)照品（濃度為1.0 mg/mL）購(gòu)于新加坡Pribolab公司；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自SigmaAldrich公司；OTA牛血清白蛋白（BSAOTA，7.8 mg/mL）、OTA單克隆抗體（mAb，7.2 mg/mL）購(gòu)自山東綠都生物工程有限公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗小鼠二抗（Fluorescein isothiocyanate （FITC） labeled goat antimouse IgG（H+L），1.5 mg/mL）購(gòu)自美國(guó)Fitzgerald公司；嗎啉乙磺酸（MES）、N羥基琥珀酰亞胺鹽酸鹽（NHS）、碳化二亞胺（EDC）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其它試劑均為分析純。

2.2 緩沖液的配制

10 mmol/L PBS（pH=7.4）： NaCl 8.0 g、Na2HPO4 1.2 g、KH2PO4 0.2 g、KCl 0.2 g加蒸餾水溶解并定容至1000 mL；封閉液： PBSBT（pH 7.4，含1% BSA和0.1% Tween20）；洗滌緩沖液： PBST（pH 7.4，含0.1% Tween20）；保存緩沖液： PBSBTN（pH 7.4，含0.1 % BSA、0.01% Tween20和 0.05% NaN3）；活化緩沖液： 50 mmol/L MES（pH 5.0）；偶聯(lián)緩沖液： 50 mmol/L MES（pH6.0）；偶聯(lián)劑： 0.32 mol/L EDC、 0.33 mol/L NHS；樣品提取液： 甲醇PBS（60∶40， V/V）；樣品稀釋液： 甲醇PBS（20∶80， V/V），均用2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值，溶液在使用前均用0.22 μm濾膜過濾。

2.3 羧基熒光微球偶聯(lián)BSAOTA

根據(jù)Bangs laboratories（TechNote 205 Covalent Coupling）提供的方案制備微球偶聯(lián)BSAOTA免疫分析物。取10 μL（約1.433×106個(gè)）熒光微球于2 mL離心管中，加入200 μL 活化緩沖液振蕩30 s，充分混勻后靜置5 min，14000 r/min離心15 min，棄上清液。微球用活化緩沖液清洗2次后，加入160 μL偶聯(lián)緩沖液、20 μL EDC、20 μL NHS，于恒溫振蕩， 金屬浴中孵育（25℃，600 r/min）30 min，14000 r/min離心15 min，棄去上清液；加入200 μL偶聯(lián)緩沖液及BSAOTA蛋白偶聯(lián)物，充分混勻后恒溫振蕩金屬浴上孵育2 h，14000 r/min離心15 min，棄去上清液。微球清洗2次，加入500 μL封閉液，再于恒溫振蕩金屬浴中孵育2 h。離心棄去上清液，偶聯(lián)好的微球用緩沖液清洗2次，加入1 mL保存緩沖液于4℃儲(chǔ)藏備用。分別取1， 2， 4， 8， 10， 20和30 μL偶聯(lián)BSAOTA的微球，加入200 μL PBS混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。偶聯(lián)微球制備及檢測(cè)過程，均在避光條件下進(jìn)行。

2.4 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取麥芽粗粉（過2號(hào)篩）1 g于10 mL 離心管中，加入2 mL樣品提取液，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min，12000 r/min離心10 min，吸取上清液過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜。濾液稀釋5倍后，14000 r/min離心10 min，取上清液備用。

取適量1.0 mg/mL OTA甲醇儲(chǔ)備液，加入陰性樣品提取液，制備0， 0.001， 0.01， 0.098， 0.391， 1.56， 6.25， 25和100 ng/ mL的基質(zhì)匹配OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5 樣品中OTA的檢測(cè)

取100 μL不同濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，加入100 μL 50 ng/mL抗體孵育20 min，加入10 μL偶聯(lián)BSAOTA微球孵育40 min，離心去上清液；微球清洗2次，加入1∶4000倍稀釋的FITCIgG熒光二抗孵育1 h，離心，用緩沖液清洗2次，加入200 μL PBS振蕩混勻后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，635 nm激光激發(fā)微球本體熒光，在流式細(xì)胞儀的APC熒光值通道檢測(cè)；488 nm激光激發(fā)微球表面結(jié)合的FITCIgG熒光，在流式細(xì)胞儀的FITC熒光值通道檢測(cè)。收集2000個(gè)微球的檢測(cè)信號(hào)，約90 s后結(jié)束檢測(cè)，每個(gè)樣品平行制備3份檢測(cè)樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，分析微球表面的平均熒光強(qiáng)度（Mean fluorescence intensity，MFI），對(duì)樣品中OTA進(jìn)行定量分析[33]。

2.6 數(shù)據(jù)分析

3.1.6 鹽離子濃度的影響 考察了PBS溶液中的鹽離子濃度（以HPO2-4和H2PO-4計(jì)）對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。由圖1e可見，隨著PBS溶液中鹽離子濃度的增加，微球表面的熒光值逐漸增強(qiáng)，當(dāng)鹽離子濃度為0.01 mol/L時(shí)達(dá)到最大；隨鹽離子濃度繼續(xù)升高，熒光強(qiáng)度降低；當(dāng)鹽離子濃度為0.1 mol/L時(shí)，微球表面的熒光值幾乎為0，說明此時(shí)抗體已經(jīng)變性或者高濃度的鹽致使微球變形、溶解。最終確定最適鹽離子濃度為0.01 mol/L。

3.1.7 甲醇濃度的影響 麥芽樣品經(jīng)60%甲醇/PBS溶劑提取，但60%甲醇濃度易使抗體變性失活，樣品提取液需經(jīng)稀釋后才能用于流式微球免疫分析。由圖1f可見，隨著甲醇濃度的升高，微球表面的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)甲醇濃度達(dá)到30%時(shí)，微球表面熒光值最強(qiáng)；隨著甲醇濃度的繼續(xù)增加，熒光強(qiáng)度急劇降低?？紤]到提取溶液中甲醇的存在，最終選擇20%甲醇PBS對(duì)樣品提取液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行稀釋，然后進(jìn)樣分析。

3.1.8 基質(zhì)成分對(duì)流式微球免疫分析的影響

如圖1g所示，樣品基質(zhì)液稀釋倍數(shù)越多，基質(zhì)成分對(duì)微球表面的熒光值影響越小。但稀釋倍數(shù)越大，達(dá)不到方法的靈敏度和檢出限要求。因此選擇樣品提取液稀釋5倍后，進(jìn)行檢測(cè)以及基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。

3.2 非特異性吸附的考察

在流式細(xì)胞儀檢測(cè)過程中，流式編碼熒光微球在鞘液流中分布不均一發(fā)生粘連或非特異性吸附，均會(huì)影響流式細(xì)胞儀對(duì)微球表面熒光強(qiáng)度的檢測(cè)。微球在APC通道的熒光峰出現(xiàn)峰高鈍化或者肩峰，表明微球發(fā)生粘連，在溶液中分布不均一；在FITC通道的熒光峰出現(xiàn)峰形低、峰位變寬、峰形分叉，表明微球表面存在非特異性吸附。實(shí)驗(yàn)表明， 微球表面的平均熒光強(qiáng)度與背景干擾熒光值相當(dāng)，

圖2 緩沖液和麥芽樣品提取液的競(jìng)爭(zhēng)抑制校正曲線（n=3）

Fig.2 Calibration curves for inhibition immunoassay in buffer and malt extract （n=3）說明偶聯(lián)BSAOTA微球表面的非特異性吸附量很少。

3.3 競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)樣品稀釋液或基質(zhì)稀釋液稀釋成不同濃度后在優(yōu)化的條件下進(jìn)行檢測(cè)，繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算方法的檢出限、線性范圍（IC10～I(xiàn)C90）及IC50值。由圖2和表2可以看出，樣品稀釋液與基質(zhì)稀釋液對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)的流式微球分析法影響較小，麥芽基質(zhì)液對(duì)微球、抗體及微球表面的熒光強(qiáng)度淬滅少，對(duì)方法的靈敏度影響小。但抗原抗體之間的免疫反應(yīng)受諸多實(shí)驗(yàn)因素的影響，因此選用基質(zhì)校正曲線作為測(cè)定麥芽中OTA的標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線， 以減少誤差。

3.6 麥芽實(shí)際樣品中OTA的檢測(cè)

采用建立的間接競(jìng)爭(zhēng)模式的流式微球分析方法檢測(cè)16批不同地點(diǎn)購(gòu)買的麥芽樣品中OTA的含量。在2批樣品中檢測(cè)到OTA，陽(yáng)性樣品發(fā)生率為12.5%，但OTA的含量（3.36和3.83 μg/kg）均未超出歐盟聯(lián)合委員會(huì)（European Commission）對(duì)OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)（5 μg/kg）。同時(shí)采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用OTA離子對(duì)m/z 404.2→358及m/z 404.2→239.1及保留時(shí)間來對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證， 兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致。上述結(jié)果證明建立的流式微球技術(shù)可用于復(fù)雜基質(zhì)麥芽樣品中OTA的定性與定量分析，并可拓展用于其它復(fù)雜基質(zhì)中更多真菌毒素的快速、靈敏檢測(cè)。

4 結(jié) 論

建立了簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的定性定量分析麥芽中OTA的間接競(jìng)爭(zhēng)流式微球分析方法，考察了FITCIgG稀釋倍數(shù)、孵育時(shí)間、溫度、pH值、基質(zhì)效應(yīng)等條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，優(yōu)化了反應(yīng)條件。流式微球技術(shù)以羧基化熒光編碼微球?yàn)檩d體，具有體積小、比表面積大、高擴(kuò)散性、粒徑及形態(tài)均一、熒光強(qiáng)度高的特點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度高，但聚苯乙烯微球比重輕，不易沉降，離心時(shí)微球易損失，清洗及離心過程耗時(shí)長(zhǎng)，不利于快速檢測(cè)?？梢岳敏然鶡晒獯判晕⑶颍柚判苑蛛x，以減少微球損失，節(jié)約時(shí)間，且洗滌充分，以提高方法的靈敏度。基于間接競(jìng)爭(zhēng)模式的流式微球分析檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)通量大、檢出限低、分析速度快，適于中藥復(fù)雜基質(zhì)體系中痕量小分子物質(zhì)的檢測(cè)。麥芽樣品只需60%甲醇/PBS簡(jiǎn)單提取、5倍稀釋并孵育后即可上樣檢測(cè)，不需要額外的前處理步驟，提高了樣品的提取效率，減少了樣品處理過程中待測(cè)目標(biāo)物真菌毒素的損失，對(duì)實(shí)際麥芽樣品的檢測(cè)結(jié)果與LCMS/MS檢測(cè)結(jié)果一致。本研究運(yùn)用流式微球技術(shù)快速檢測(cè)麥芽中的OTA，為中藥材質(zhì)量監(jiān)控提供了科學(xué)、有效的分析手段。

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