江丹丹 宋乃忠 王皓 賈瓊

摘 要 以3（甲基丙烯酸酰氧）丙基三甲氧基硅烷修飾的Fe3O4為載體，沒食子酸丙酯為模板分子，采用表面印跡技術(shù)制備了核殼結(jié)構(gòu)的磁性沒食子酸丙酯分子印跡聚合物（Fe3O4@SiO2MIPS），并將該磁性分子印跡聚合物作為吸附劑引入到微流控芯片中，與HPLC聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量酚類抗氧化劑的分離富集。采用掃描電鏡、磁滯回線、熱重分析、紅外光譜及X射線衍射對(duì)該磁性分子印跡聚合物表征。在最佳萃取條件下（樣品體積3 mL，樣品溶液pH=5.0，樣品流速為0.5 mL/min，洗脫液流速為0.3 mL/min），該聚合物對(duì)酚類抗氧化劑具有較強(qiáng)的富集作用。3種酚類抗氧化劑在10～5000 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9901，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）分別低于2.8%和3.5%。將本方法用于化妝水中酚類抗氧化劑的分析檢測(cè)，加標(biāo)回收率在87.9%～104.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）小于3.7%。

關(guān)鍵詞 微流控芯片；分子印跡；磁性納米粒子；酚類抗氧化劑

1 引 言

微流控芯片是20世紀(jì)90年代迅速發(fā)展起來的一種分析技術(shù)，它主要通過微米級(jí)流路對(duì)流體進(jìn)行操控達(dá)到微分析的目的[1，2]。微流控芯片裝置可以實(shí)現(xiàn)集成化和自動(dòng)化、減少試劑浪費(fèi)、縮短分析時(shí)間、提高檢測(cè)效率，引起了普遍的關(guān)注和興趣。將微流控芯片用于樣品前處理過程，不僅能節(jié)約試劑用量，還能達(dá)到很高的萃取效率[3]，為其在分離和富集領(lǐng)域的應(yīng)用提供了廣闊的前景。

磁性納米粒子（MNPs）具有較強(qiáng)的吸附能力和超順磁性，常常在表面修飾特定的官能團(tuán)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的富集[4～7]。分子印跡技術(shù)是以目標(biāo)分子為模板，合成對(duì)特定目標(biāo)分子及其結(jié)構(gòu)類似物具有特異性識(shí)別和選擇性吸附的聚合物。磁性分子印跡聚合物是將磁性與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，得到同時(shí)具有分子識(shí)別特異性和磁性分離特點(diǎn)的材料。磁性分子印跡聚合物不僅對(duì)印跡分子具有特異性選擇，而且可以通過磁場(chǎng)的作用與基質(zhì)快速分離，因此其作為固相萃取材料已得到廣泛關(guān)注[8～10]。

食物中添加抗氧化劑能夠保護(hù)食物免受氧化損傷而變質(zhì)。合成酚類抗氧化劑（SPAs）是常用的抗氧化劑，包括沒食子酸丙酯（PG），丁基羥基茴香醚（BHA），2，6二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）等，其應(yīng)用比天然抗氧化劑更廣泛。但是，過多或長(zhǎng)期接觸酚類抗氧化劑會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不利的影響。因此，發(fā)展高選擇性、低成本的材料來分離、富集和檢測(cè)酚類抗氧化劑具有重要意義[11，12]。

本實(shí)驗(yàn)以3（甲基丙烯酸酰氧）丙基三甲氧基硅烷修飾的Fe3O4作為載體，沒食子酸丙酯為模板分子，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，合成了磁性沒食子酸丙酯分子印跡聚合物（Fe3O4@SiO2MIPS）。用該磁性分子印跡聚合物作為吸附劑，在微流控芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)酚類抗氧化劑的分離富集。本方法為食品和化妝品中酚類抗氧化劑的選擇性分離富集提供了一種新型樣品前處理方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Waters 2489高效液相色譜儀（Waters，USA），配置Waters 2489紫外可見檢測(cè)器；PB10 pH計(jì)（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；JJ1磁力電動(dòng)攪拌器（金壇市江南儀器廠）；ZK82BB真空干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；722N紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）。

PG、BHA、BHT標(biāo)準(zhǔn)品、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈、3（甲基丙烯酸酰氧）丙基三甲氧基硅烷、硅酸四乙酯、水合肼均購(gòu)于上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；FeCl3·6H2O和（NH4）2Fe（SO4）2購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。甲醇、乙腈（色譜純）購(gòu)于天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司。

準(zhǔn)確稱取酚類抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品各0.0100 g，用甲醇溶解，配制成1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃密封保存。

2.2 色譜條件

選擇Symmetry C18色譜柱（4.6 mm × 75 mm，3.5 μm）為分析柱，乙腈（A）1.5%乙酸水溶液（B）作流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL。采用梯度洗脫：0～4 min，90%～100% A；4～5 min，100%～90% A；5～13 min，90% A。

2.3 磁性分子印跡聚合物的制備

2.3.1 Fe3O4磁性微球的制備 Fe3O4磁性微球由共沉淀法制成[13]。準(zhǔn)確稱取10 g FeCl3·6H2O和4.2 g （NH4）2Fe（SO4）2置于含有1 mL水合肼的50 mL水溶液中，再加入10 mL氨水（27% w/v），室溫下攪拌0.5 h至完全溶解，然后升溫至80℃再攪拌1 h。產(chǎn)物用磁鐵分離后，用去離子水和乙醇清洗3次，70℃真空干燥 24 h。

2.3.2 Fe3O4@SiO2的制備 Fe3O4@SiO2由溶膠凝膠法合成[14]。首先將0.2 g Fe3O4分散到60 mL乙醇和10 mL水中，超聲處理15 min。加入1 mL氨水與2 mL硅酸四乙酯，溶液在室溫下攪拌24 h。產(chǎn)物用磁鐵分離后，用去離子水和乙醇清洗3次，70℃ 真空干燥 24 h。

2.3.3 Fe3O4@SiO2@MPS的制備 1.0 g Fe3O4@SiO2 分散到50 mL水中，超聲處理10 min，用乙酸將溶液pH調(diào)至3.0～4.0，室溫下攪拌1 h。取0.2 mL的MPS分散到50 mL乙醇中，將此溶液加入到上述溶液中，80℃下攪拌5 h[15]。產(chǎn)物用磁鐵分離后，用去離子水和乙醇清洗3次，70℃真空干燥24 h。

2.3.4 Fe3O4@SiO2MIPs分子印跡聚合物的制備 準(zhǔn)確稱取模板分子沒食子酸丙酯85 mg，功能單體MAA 346.5 mg，分散在15 mL甲苯中超聲處理，混合物攪拌12 h預(yù)聚合。再向該溶液中加入Fe3O4@SiO2MPS 0.3 g，交聯(lián)劑EDMA 1.5858 g，引發(fā)劑AIBN 90 mg，氮?dú)獗Ｗo(hù)下60℃反應(yīng)24 h[16]。產(chǎn)物用甲醇/乙酸體積比9∶1的溶液洗脫模板分子，直至紫外分光光度法檢測(cè)不出。產(chǎn)物用磁鐵分離后，用去離子水和乙醇清洗3次，70℃真空干燥24 h，得到?jīng)]食子酸丙酯磁性分子印跡聚合物。制備非印跡聚合物（Fe3O4@SiO2NIPs）時(shí)，除不加模板分子外，其它步驟同上。

2.4 微流控芯片制作

本實(shí)驗(yàn)所用的微流控芯片由上下兩層聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）模塊組成，下層刻有直徑0.5 mm、深0.5 mm的通道作為流路，上下兩層通過熱粘合方法組合在一起。具體操作是：刻蝕通道后的芯片依次在乙醇、去離子水中用超聲波清洗。然后將上下兩層芯片的微管道對(duì)準(zhǔn)，放入烘箱中熱粘合，以5℃/30 min的速度由100℃逐步升溫至120℃。

2.5 萃取過程

首先將0.3 g Fe3O4@SiO2MIPS分散到10 mL乙醇溶液中，超聲處理5 min，然后將其通入到微流控芯片的通道中，利用磁鐵固定在通道中，形成約10 mm的填充固定相。實(shí)驗(yàn)過程分3步：進(jìn)樣，清洗，洗脫。首先，將3 mL的樣品溶液以0.5 mL/min速度流經(jīng)裝有Fe3O4@SiO2MIPS的芯片。然后引入去離子水清洗流路。最后，以0.3 mL/min的流速引入200 μL甲醇進(jìn)行洗脫。洗脫液經(jīng)0.22 μm 的濾膜過濾后取10 μL通過HPLC檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)示意圖見圖1。

圖1 磁性分子印跡聚合物合成示意圖

Fig.1 Preparation process of Fe3O4@SiO2molecularly imprinted polymers （MIPS）

3 結(jié)果與討論

3.1 磁性分子印跡聚合物的表征

3.1.1 掃描電鏡 Fe3O4和Fe3O4@SiO2MIPs的形貌和大小通過SEM表征。由圖2A可以看到，F(xiàn)e3O4呈現(xiàn)規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)。從圖2B可以看出，F(xiàn)e3O4包裹印跡聚合物后有效的降低了Fe3O4微球之間的磁性偶極吸引，

圖2 Fe3O4（A）和Fe3O4@SiO2MIPs（B）的SEM圖

Fig.2 SEM images of Fe3O4 （A） and Fe3O4@SiO2MIPs （B）

使Fe3O4@SiO2MIPs的分散性更好。同時(shí)可以看出，F(xiàn)e3O4@SiO2MIPs表面凹凸不平，說明存在大量空穴，有利于對(duì)模板分子的吸附。

3.1.2 紅外光譜 由圖3A（a～d）看出Fe3O4的FeO基團(tuán)的彎曲振動(dòng)引起的特征吸收峰出現(xiàn)在580 cm

Symbolm@@ 1處。從圖3A（b）觀察到，在Fe3O4硅烷化后，SiOSi不對(duì)稱伸縮振動(dòng)的特征峰出現(xiàn)在1080 cm

Symbolm@@ 1處，SiO彎曲振動(dòng)的特征峰出現(xiàn)在799 cm

Symbolm@@ 1處，這說明SiO2成功地包裹到了Fe3O4磁性微球的表面上。觀察圖3A（c）和圖3A（d），在1730 cm

Symbolm@@ 1處均出現(xiàn)了CO的特征吸收峰，這證實(shí)了MPS的成功修飾。圖3A（d）出現(xiàn)的2975 cm

Symbolm@@ 1處的吸收峰歸屬于EDMA中CH芳香伸縮振動(dòng)，1390 cm

Symbolm@@ 1處的吸收峰歸屬于EDMA中CH對(duì)稱彎曲振動(dòng)峰。以上這些特征吸收峰的出現(xiàn)說明成功地制備了磁性分子印跡聚合物。

3.1.3 熱重分析 由圖3B看出，曲線分為3段區(qū)間，0～400℃的失重是由于Fe3O4@SiO2MIPs表面乙醇分子的揮發(fā)；400℃～600℃的失重是由于包裹Fe3O4@SiO2MIPs的有機(jī)化合物的揮發(fā)；600℃以后曲線趨于平穩(wěn)，說明Fe3O4表面修飾的有機(jī)化合物已經(jīng)完全分解。

圖3 （A）Fe3O4（a），F(xiàn)e3O4@SiO2（b），F(xiàn)e3O4@SiO2@MPS（c）和Fe3O4@SiO2MIPs（d）的紅外吸收?qǐng)D譜；（B）Fe3O4@SiO2MIPs的TGA圖

Fig.3 （A） FTIR spectra of Fe3O4 （a）， Fe3O4@SiO2（b）， Fe3O4@SiO2@MPS （c） and Fe3O4@SiO2MIPs （d）； （B） TGA curve of Fe3O4@SiO2MIPs

3.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

3.2.1 試液pH值的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)研究了樣品pH在2.0～10.0范圍內(nèi)對(duì)吸附效率的影響（圖5A），結(jié)果表明，3種抗氧化劑的峰面積均在pH為5.0時(shí)達(dá)到最大值?？赡艿脑蚴牵喊苍贔e3O4@SiO2MIPs外層的甲基丙烯酸表面存在COOH，當(dāng)pH小于5.0時(shí)，隨著pH的下降，甲基丙烯酸與抗氧化劑之間的氫鍵作用逐漸減小，所以吸附效率減低。而pH過高也不利于吸附，所以本實(shí)驗(yàn)選擇的最佳pH值為5.0。

3.2.2 樣品流速的優(yōu)化 在0.1～0.8 mL/min范圍內(nèi)考察樣品流速的影響，如圖5B所示，在0.1～0.5 mL/min范圍內(nèi)，峰面積隨著樣品流速的增加而增大，但當(dāng)樣品流速大于0.5 mL/min時(shí)，峰面積逐漸減小。這說明過高的樣品流速不利于吸附劑對(duì)樣品的吸附，所以，本實(shí)驗(yàn)選擇樣品流速為0.5 mL/min。

3.2.3 洗脫液流速的優(yōu)化 選擇甲醇作為洗脫液，同時(shí)還考察了洗脫液流速對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果如圖5C所示。當(dāng)洗脫液的流速為0.1～0.3 mL/min時(shí)，峰面積逐漸變大，當(dāng)繼續(xù)增大洗脫液的流速時(shí)，由于洗脫液與吸附劑的接觸時(shí)間變短，影響洗脫效率導(dǎo)致峰面積減小。最終，選擇0.3 mL/min作為洗脫液流速。

圖5 （A）樣品pH值，（B）樣品流速和（C）洗脫液流速的條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

Fig.5 Effects of experimental conditions： （A） Sample pH； （B） Sample flow rate； （C） Eluent flow rate

3.3 方法評(píng)價(jià)

3.3.1 方法學(xué)考察 在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下（樣品體積3 mL，樣品流速0.5 mL/min，洗脫液流速0.3 mL/min， 樣品pH值5.0），進(jìn)一步考察了線性范圍、檢出限、定量限、日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1，3種酚類抗氧化劑的線性相關(guān)系數(shù)（R2）均高于0.9901。慕尼黑上海分析生化展（analytica China）

展會(huì)時(shí)間：2016年10月10～12日

展會(huì)地點(diǎn)：上海新國(guó)際博覽中心N1、N2、N3館

展會(huì)網(wǎng)址：www.ac.cn

展會(huì)周期：兩年一屆

會(huì)展主辦方： 德國(guó)慕尼黑國(guó)際博覽集團(tuán) 慕尼黑展覽（上海）有限公司

展出時(shí)間：2016年10月10日～12日

展會(huì)描述：

慕尼黑上海分析生化展（analytica China）是分析和生化技術(shù)領(lǐng)域的國(guó)際性博覽會(huì)，專門面向飛速發(fā)展的中國(guó)市場(chǎng)。憑借著analytica 的國(guó)際品牌，analytica China 吸引了來自全球主要工業(yè)國(guó)家的分析、診斷、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和生化技術(shù)領(lǐng)域的廠商。繼2002年首次成功舉辦以來，analytica China 已經(jīng)成為亞洲最大的分析、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和生化技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)博覽會(huì)，每?jī)赡昱e辦一次，是業(yè)內(nèi)領(lǐng)軍企業(yè)全面展示最新技術(shù)、產(chǎn)品和解決方案的最佳平臺(tái)，這也是該展會(huì)能夠吸引越來越多展商和觀眾的關(guān)鍵所在。同期舉辦的analytica China國(guó)際研討會(huì)與研習(xí)班也是業(yè)內(nèi)人士關(guān)注的焦點(diǎn)，其聚焦整個(gè)行業(yè)的發(fā)展，是科學(xué)技術(shù)和行業(yè)技術(shù)相互傳遞的理想平臺(tái)。

第八屆慕尼黑上海分析生化展（analytica China 2016）將于2016年10月10-12日在上海新國(guó)際博覽中心拉開帷幕。展會(huì)將推出四大展區(qū)，包括生物技術(shù)、生命科學(xué)與診斷展區(qū)；分析與質(zhì)量控制展區(qū)；實(shí)驗(yàn)室裝備與技術(shù)展區(qū)；食品安全裝備與技術(shù)主題展區(qū)。展區(qū)分布進(jìn)一步細(xì)化，旨在為行業(yè)企業(yè)與用戶提供一個(gè)更廣泛、更深入交流與合作的良好平臺(tái)。

高水平學(xué)術(shù)研討會(huì)和研習(xí)班一直是慕尼黑上海分析生化展亮點(diǎn)之一！除以往倍受好評(píng)的上海國(guó)際食品安全研討會(huì)、“組學(xué)與個(gè)性化治療”專題研討會(huì)、LSAC 生命科技論壇等之外，2016年還將在原有培訓(xùn)班的基礎(chǔ)上，新增更多生物醫(yī)藥、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)等系列培訓(xùn)班，緊扣飛速發(fā)展的中國(guó)市場(chǎng)，促進(jìn)產(chǎn)、學(xué)、研各環(huán)節(jié)緊密連接， 更好的服務(wù)于展商與觀眾。

3.3.2 印跡聚合物與非印跡聚合物吸附性能對(duì)比 本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了經(jīng)過印跡聚合物（Fe3O4@SiO2MIPs）富集HPLC分析的3種抗氧化劑得到的峰面積及經(jīng)過非印跡聚合物（Fe3O4@SiO2NIPs）富集HPLC分析的3種酚抗氧化劑得到的峰面積，如圖6所示，可以看出經(jīng)過印跡聚合物富集的抗氧化劑得到的峰面積響應(yīng)值明顯高于后者，同時(shí)也可以看出印跡聚合物對(duì)印跡分子沒食子酸丙酯有很高的選擇性。

3.4 實(shí)際樣品分析

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的4種化妝水均購(gòu)于當(dāng)?shù)爻校? mL化妝水經(jīng)過0.45 μm的濾膜過濾后儲(chǔ)存置4℃的冰箱中。這4種化妝水中均被加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液來進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖7和表2，所得的回收率在87.9%～104.0%范圍內(nèi)。結(jié)果表明，該方法能夠適用于化妝水抗氧化劑含量的檢測(cè)，有效地避免

了基質(zhì)的影響。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以沒食子酸丙酯為模板分子，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，成功地合成了一種新型的磁性印跡聚合物（Fe3O4@SiO2MIPs），并應(yīng)用于微流控芯片中，與液相色譜聯(lián)用，檢測(cè)了化妝水中的酚類抗氧化劑的含量。結(jié)果表明，此吸附劑對(duì)化妝水中的酚類抗氧化劑有特異的吸附性能，3種物質(zhì)檢出限分別為8， 22和31 ng/mL，在10～5000 ng/mL范圍內(nèi)，3種物質(zhì)均具有良好的線性關(guān)系（R2>0.9901）。

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