張　旺，申元英，陳紅云，宋正蕊，季守蓮，王金勇

（大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000）

亞硝酸鈉對雄性小鼠的損傷及修復(fù)機制研究

張旺，申元英，陳紅云，宋正蕊，季守蓮，王金勇*

（大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000）

目的：研究NaNO2對雄性小鼠的損傷及修復(fù)機制。方法：昆明種雄性小鼠，劑量組經(jīng)口給予NaNO2（15、30、60 mg/（kg·d）），對照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)14 d，末次染毒24 h后，處死各劑量組1/3小鼠，余下小鼠分兩組，給予NaNO2等劑量枸杞多糖和等體積生理鹽水，連續(xù)14 d，處死全部實驗動物。測定主要臟器、睪丸及附睪的重量、臟器系數(shù)，血清睪酮水平和精子畸形率。結(jié)果：隨NaNO2劑量增加，睪酮水平、脾臟重量均下降（P＜0.05），精子畸形率升高（P＜0.05）；停止給予NaNO2后，在15、30 mg/kg NaNO2組，精子畸形率下降，睪酮水平升高及脾臟器系數(shù)，與之前比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：NaNO2具有抑制小鼠睪酮水平、誘導(dǎo)精子畸變的能力；停止染毒后，小鼠自身具有一定修復(fù)能力，枸杞多糖也可能具有一定的修復(fù)作用，但還有待進一步研究。

NaNO2；臟器系數(shù)；睪酮激素水平；精子畸形

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.009

枸杞是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，很多學(xué)者研究它對雄性生殖系統(tǒng)的作用，有實驗證實枸杞具有保護雄性生殖系統(tǒng)的作用〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，作為肉類制品常用的發(fā)色劑和防腐劑的亞硝酸鹽〔2〕，其廣泛過量地使用已嚴重影響人類的健康，尤其是對人類生育力的影響〔3〕。以往對亞硝酸鹽生殖毒性的研究多采用單階段動物實驗，結(jié)果呈現(xiàn)以毒性損害為主，對其損害的修復(fù)機制研究較少。本次實驗研究采用分段式動物實驗，一方面進一步明確亞硝酸鹽對各臟器的毒性損害，另一方面觀察枸杞多糖是否具有修復(fù)生殖系統(tǒng)損害的功效。

1　材料與方法

1.1實驗動物選擇成年昆明種雄性小鼠44只，體重20～30 g，普通級，由大理大學(xué)實驗動物中心提供（合格證號∶SYXK（滇）2008-0003）。

1.2主要試劑和儀器亞硝酸鈉（NaNO2，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；枸杞多糖（純度70%，生產(chǎn)批號∶YSCI 20130804，西安源森生物科技有限公司）；甲醇（分析純，天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司）；2%伊紅、睪酮（P）試劑盒（上海一基實業(yè)有限公司）；酶標儀、光學(xué)顯微鏡。

1.3實驗分段及給藥

1.3.1第一階段將實驗動物隨機分為4組，其中，3個實驗組，1個對照組，每個實驗組12只，對照組8只，實驗組分別給予NaNO215、30、60 mg/（kg·d），灌胃0.1 mL/10g，對照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)14 d，末次染毒24 h后，各實驗組處死4只實驗動物，進行相關(guān)指標檢測。

1.3.2第二階段第一階段結(jié)束后，對照組小鼠繼續(xù)給予生理鹽水，各實驗組小鼠再隨機分為A、B組（每組4只）。A組按10 mg/（kg·d）的枸杞多糖溶液灌胃，B組小鼠給予相同劑量的生理鹽水，灌胃0.1 mL/10g，連續(xù)14 d，末次染毒24 h后，處死所有實驗小鼠并分析相關(guān)指標。

1.4樣品采集及處理

1.4.1臟器系數(shù)的測定各階段末次染毒24 h后稱重，斷頭處死小鼠，取其心、肝、脾、肺、腎、睪丸和附睪并稱重。并換算臟器系數(shù)，進行分析。

1.4.2血清激素測定各階段末次染毒24 h后，斷頭取血，采用ELISA法測定血清睪酮水平。

1.4.3小鼠精子畸形率測定各階段末次染毒24 h后，取雙側(cè)附睪，計數(shù)精子畸形率。

2　結(jié)果

2.1NaNO2對雄性小鼠主要臟器及生殖系統(tǒng)的影響NaNO2對雄鼠主要臟器系數(shù)、睪酮水平和精子畸形率的影響∶脾臟系數(shù)、激素水平隨著NaNO2染毒劑量的增加而降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；畸形精子的類型以無鉤、香蕉頭、胖頭和不定形為主，隨染毒劑量增加，精子畸形率明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1　NaNO2對雄鼠主要臟器系數(shù)、睪酮水平和精子畸形率的影響

表1　NaNO2對雄鼠主要臟器系數(shù)、睪酮水平和精子畸形率的影響

注：*表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。

分組劑量/（mg/kg）心臟/（mg/g）肝臟/（mg/g）脾臟/（mg/g）肺/（mg/g）腎臟/（mg/g）睪丸和附睪/（mg/g）睪酮/（nmol/L）精子畸形率/%對照組0 5.99±0.15 55.47±8.64 9.83±0.69 10.84±2.50 13.67±3.56 9.84±0.41 134.14±20.92 7.61±0.35低劑量組15 5.36±0.30 54.43±9.56 9.01±0.91 9.86±2.52 13.93±2.43 8.60±2.54 116.21±19.42 11.00±1.20中劑量組30 6.24±0.64 60.05±5.25 8.67±0.38 19.05±11.66 13.87±2.40 11.62±4.01 100.30±9.49 14.56±1.71高劑量組60 5.61±0.76 58.17±15.07 7.40±0.48 13.22±3.95 14.47±0.84 8.82±1.00 92.72±8.60 15.75±1.06 F—1.673 0.186 7.299 1.243 0.057 0.960 4.132 29.789 P—0.249 0.903 0.011*0.356 0.981 0.457 0.048*＜0.05*

2.2枸杞多糖、機體自身對NaNO2損傷的修復(fù)作用對15 mg/kg NaNO2組進行第一階段（NaNO2染毒階段）與第二階段A（給予枸杞多糖階段）和第二階段B（給予生理鹽水階段）的指標比較，得到以下結(jié)果∶染毒期的精子畸形率、睪酮水平和脾臟器系數(shù)與恢復(fù)期A、B兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其他指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2　15 mg/kg NaNO2組前后兩階段的指標比較

表2　15 mg/kg NaNO2組前后兩階段的指標比較

注：△表示第一階段與第二階段A之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，☆表示第一階段與第二階段B之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*表示P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

分組脾臟/（mg/g）睪酮/（nmol/L）精子畸形率/%第一階段9.01±0.91△，☆116.21±19.42△，☆11.00±1.20△，☆第二階段A 4.14±1.75 206.13±20.99 6.96±0.71第二階段B 6.00±0.57 194.80±24.39 7.19±0.27 F 13.811 16.317 29.221 P 0.003*0.002*＜0.000 1*

對30 mg/kg NaNO2組進行第一階段（NaNO2染毒階段）與第二階段A（給予枸杞多糖階段）和第二階段B（給予生理鹽水階段）的指標比較，得到以下結(jié)果∶染毒期的精子畸形率、睪酮水平和脾臟器系數(shù)與恢復(fù)期A、B兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其他指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3　30mg/kg NaNO2組前后兩階段的指標比較

表3　30mg/kg NaNO2組前后兩階段的指標比較

注：△表示第一階段與第二階段A之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，☆表示第一階段與第二階段B之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*表示P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

分組脾臟/（mg/g）睪酮/（nmol/L）精子畸形率/%第一階段8.67±0.38△，☆100.30±9.49△，☆14.56±1.71△，☆第二階段A 5.19±1.07 202.80±33.68 7.99±1.97第二階段B 4.41±2.02 187.91±16.76 7.99±1.04 F 9.301 16.699 16.152 P 0.011*0.002*0.002*

對60 mg/kg NaNO2組進行第一階段（NaNO2染毒階段）與第二階段A（給予枸杞多糖階段）和第二階段B（給予生理鹽水階段）的指標比較，得到以下結(jié)果∶染毒期的精子畸形率與恢復(fù)期A、B兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其他指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4　60mg/kg NaNO2組前后兩階段的指標比較

表4　60mg/kg NaNO2組前后兩階段的指標比較

注：△表示第一階段與第二階段A之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，☆表示第一階段與第二階段B之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*表示P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

分組脾臟/（mg/g）睪酮/（nmol/L）精子畸形率/%第一階段7.40±0.48 92.72±8.60 15.75±1.06△，☆第二階段A 5.01±2.68 204.63±42.31 8.00±1.47第二階段B 6.14±1.83 267.02±167.97 8.05±2.58 F 0.878 1.844 13.323 P 0.463 0.237 0.006*

3　討論

第一階段實驗結(jié)果∶隨著NaNO2的劑量增加，雄性小鼠的脾臟器系數(shù)隨之下降，表明NaNO2對小鼠脾臟有損傷，且為持續(xù)性的損傷，繼而影響小鼠的免疫功能，這與郝恩柱等〔4〕的研究結(jié)果一致。第二階段實驗結(jié)果∶①比較枸杞多糖對NaNO2損傷的修復(fù)，從表2～4均可見枸杞多糖組睪酮水平高于NaNO2組，枸杞多糖組精子畸形率低于NaNO2組，兩指標在兩組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這說明枸杞多糖具有保護睪丸組織的作用，與TAN Q H等〔5〕的研究結(jié)果一致，但是，從表2～4中還發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖組的脾臟器系數(shù)均小于NaNO2組，枸杞多糖是用來對NaNO2的損害進行修復(fù)的，在NaNO2染毒結(jié)束后，持續(xù)2周，得到這樣的結(jié)果說明NaNO2對小鼠脾臟的損害是持續(xù)性的，且實驗中的枸杞多糖劑量是無法有效對脾臟損害進行修復(fù)的，這提示后續(xù)的實驗劑量設(shè)計應(yīng)加大劑量，才可判斷是否存在修復(fù)作用。②比較生理鹽水對NaNO2損傷的修復(fù)，從表2～4均可見生理鹽水組睪酮水平高于NaNO2組，生理鹽水組精子畸形率低于NaNO2組，兩指標在兩組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這說明停止給予NaNO2后，機體具有一定的自身修復(fù)功能，也即反應(yīng)了睪丸組織具有較強的自身修復(fù)能力。對于表中，生理鹽水組的脾臟器系數(shù)均小于NaNO2組，驗證了前面提到的NaNO2對脾臟的損害是持續(xù)的，且在2周內(nèi)是無法進行有效自身修復(fù)的。③比較枸杞多糖和生理鹽水的修復(fù)效果，從表2～4可見，二者的修復(fù)效果無統(tǒng)計學(xué)差異，這與MA〔6〕、許忠新等〔7〕的結(jié)果存在一定的差異，分析其原因可能是實驗中所使用的枸杞多糖是市售的，純度較低，僅為70%，導(dǎo)致枸杞多糖有效劑量過低。枸杞多糖是否對亞硝酸鹽所致生殖系統(tǒng)的損害具有修復(fù)功效，尚需進一步確認。

〔1〕羅瓊，黃曉蘭，李卓能，等.枸杞多糖對雄性大鼠性功能及生殖功能的影響〔J〕.營養(yǎng)學(xué)報，2006，28（1）：62-65.

〔2〕趙穎，臧明伍，馮偉，等.模擬腌肉制品體系中亞硝酸鈉殘留量預(yù)測模型的建立〔J〕.中國食品添加劑，2014（3）：130-138.

〔3〕何杰明，王麗麗，王尚明，等.亞硝酸鈉短期暴露對雄性小鼠生殖的影響〔J〕.中國計劃生育學(xué)雜志，2015，23（3）：165-168.

〔4〕郝恩柱，高永.亞硝酸鈉對小鼠免疫功能的影響〔J〕.中國公共衛(wèi)生學(xué)報，1995，14（3）：192.

〔5〕TAN Q H，AN C X，XIAO Y，et al.Protective effect of lycium barbarum polysaccharides against heat stress-induced germ cell apoptosis in rats and its mechanism〔J〕.National journal of andrology，2012，18（1）：88-92.

〔6〕MA L H，QIU Z J，YAN S N，et al.Influence of lycium barbarum polysaccharides on proliferation of spermatogonial stem cells in vitro〔J〕.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2011，15（23）：4277-4281.

〔7〕許忠新，單鐵英，蘇安英，等.枸杞多糖對人外周血巨噬細胞活性的影響〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（16）：2177-2178.

Study on the Sodium Nitrite Injury and Repair Mechanisms to the Male Mice

Zhang Wang，Shen Yuanying，Chen Hongyun，Song Zhengrui，Ji Shoulian，Wang Jinyong*
（College of Public Health，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To study the sodium nitrite injury and repair mechanisms to the male mice.Methods:Kunming species male mice were used in the experiment.Dose groups were administered by oral with NaNO2（15，30，60 mg/（kg·d）），while the control groups had been given normal saline of the same volume for 14 days.After 24 hours of the last exposure to NaNO2，one-third of mice in three dose groups were killed.The remaining mice were divided into two groups.One group was given Lyceum barbarum polysaccharide，while another group was given normal saline of the same volume for 14 days and then killed all the mice.Experiment measured index included the main organ weight，organ coefficient，serum testosterone level and sperm deformity rate.Results:With the increasing dose of NaNO2，the mice serum testosterone level and the spleen weight were decreased significantly（all P value＜0.05），the sperm deformity rate was increased significantly（all P value＜0.05）.After stopping giving NaNO2，the level of serum testosterone were increased，the sperm deformity rate and spleen organ coefficient were declined in 15，30 mg/（kg·d）NaNO2groups，the three indexes were statistically significant comparing with previous experiments（all P value＜0.05）.The other indexes had no change.Conclusion:NaNO2had the ability to inhibit the level of serum testosterone and induce the sperm deformity in mice.After stopping exposing to NaNO2，the mice can repair some damages by themselves，the Lyceum barbarum polysaccharide may also have recovery effect，which needs further study.

NaNO2；organ coefficient；hormone level；sperm deformity

R285

A

2096-2266（2016）10-0035-04

（責(zé)任編輯李楊）

大理大學(xué)開放實驗室基金資助項目（2014-79）；大理大學(xué)大學(xué)生科研基金資助項目（KYSX2013013）

2015-11-18

2016-05-19

張旺，2010級衛(wèi)生檢驗專業(yè)本科生.

*通信作者：王金勇，副教授.