艾志瓊，張　玲，2，李麗娟，李　澤，王云紅，申元英*

（1.大理大學公共衛(wèi)生學院，云南大理671000；2.自貢市疾病預防控制中心，四川自貢643000；3.大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理671000）

HAV RT-PCR檢測方法的建立及其在豬群中的流行調(diào)查

艾志瓊1，張玲1，2，李麗娟3，李澤1，王云紅1，申元英1*

（1.大理大學公共衛(wèi)生學院，云南大理671000；2.自貢市疾病預防控制中心，四川自貢643000；3.大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理671000）

目的：了解屠宰生豬中甲型肝炎的流行情況，探討豬作為HAV另一宿主和攜帶者的可能性，以期為人類甲肝的防治提供一定的理論依據(jù)。方法：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法對大理地區(qū)屠宰生豬血清中HAV IgG檢測，逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）對屠宰生豬的全血和膽汁標本進行HAV RNA檢測，以甲型肝炎患者的血液和膽汁為陽性對照標本。結果：①屠宰豬血清樣本中檢測出HAV的抗體陽性率為73.3%（374/510）；②建立了甲型肝炎病毒的RT-PCR檢測方法；③用RT-PCR在陽性對照標本中檢出HAV RNA；④用RT-PCR在屠宰豬的全血和膽汁樣本中未檢出HAV RNA。結論：成功建立起RTPCR檢測待測樣本中的HAV RNA的方法；屠宰豬血清樣本中檢測出HAV的抗體陽性率較高；豬是否可以感染人的HAV還有待于進一步研究。

HAV；屠宰生豬；酶聯(lián)免疫吸附試驗；逆轉錄-聚合酶鏈反應；大理地區(qū)

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.022

甲型肝炎（Hepatitis A，HA）是由甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）引起的一種急性病毒性肝炎，是急性病毒性肝炎中感染率和發(fā)病率最高的一種〔1-2〕，是一種世界范圍流行的常見腸道傳染病。我國是甲型肝炎的高發(fā)地區(qū)之一，甲型肝炎已成為我國的一個重要公共衛(wèi)生問題，越來越受到人們的重視〔3-4〕。1981年，詹美云等報道，HAV感染樹鼩后在其體內(nèi)檢測出相關抗原抗體，近年來，屠宰豬血清中檢出抗-HAV亦有報道〔5-6〕。這些研究表明，HAV除了能感染黑猩猩、恒河猴等靈長類動物，HAV也可能感染非靈長類動物。本研究用醫(yī)用HAV診斷試劑盒檢測屠宰豬血清中HAV標志物，以了解HAV在屠宰豬中的血清流行狀況；用人HAV基因序列擴增屠宰豬HAV核苷酸序列以確定豬體內(nèi)是否存在HAV的感染，由此探討豬作為HAV另一宿主和攜帶者的可能性，以期為人類甲肝的防治提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣本收集大理地區(qū)屠宰場屠宰生豬血清、全血各510份（每頭豬采血6 mL×2管，統(tǒng)一編號，其中1管用于分離血清，1管抗凝用于收集全血），收集膽囊176個，獲取膽汁176份；收集大理州各醫(yī)院甲肝患者的血液27份和膽汁32份，將擴增出目的條帶的標本作為陽性對照。

1.2主要實驗材料

1.2.1甲肝病毒來自凍干甲型肝炎減毒活疫苗。該疫苗是將甲型肝炎病毒H2減毒株接種于人倍體細胞KMB17株，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、提取病毒，加穩(wěn)定凍干劑制成。由大理市疾病預防控制中心提供。

1.2.2引物選取保守的VP3-VP1區(qū)的核苷酸序列設計引物，序列如下，上游引物P1∶5’-CCTT-GAGATTTCGTGTTC-3’，下游引物P2∶5’-CCTATTGGCTTTCCCTTT-3’，由上海生工生物技術有限公司合成。擴增的目的片段長度為347 bp。

1.2.3試劑盒TRNzol-A+總RNA提取試劑，北京TIANGEN公司。RevertAidFirstStrandcDNAsynthsis Kit、RT-PCR試劑盒、PCR Master Mix試劑盒均購自Thermo公司。

1.3方法

1.3.1血清學檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法對血清中HAV IgG檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2HAV疫苗復活備用將疫苗稀釋劑加入凍干粉劑后，可見澄明液體，1.0 mL中含甲型肝炎活病毒不低于6.5l g CCID50。

1.3.3核酸提取直接取病毒懸液（新鮮血液或膽汁上清）0.25 mL，加入0.75 mL TRNzol-A+，充分振蕩混勻，將樣品在室溫放置5 min；加入0.15 mL氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，4℃條件下12 000 r/min離心10 min，樣品分為3層∶黃色有機相，中間層和上層無水相，RNA主要溶于水相中，把水相轉移到新管中，在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置30 min；4℃條件下12 000 r/min離心10 min，去上清，加入0.75 mL 75%乙醇對沉淀進行洗滌；4℃條件下12 000 r/min離心5 min，去上清。室溫放置晾干，加入100 μL RNase-free dd H2O，反復吹打、混勻，充分溶解RNA。隨即進行RT或-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4RT-PCR擴增條件的摸索RT反應的摸索∶使用MMLV和AMV反轉錄酶分別進行實驗；PCR擴增條件的摸索∶退火溫度42～55℃，引物濃度從10～30 μmol/L，循環(huán)參數(shù)25～35。

1.3.5PCR產(chǎn)物的檢測PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖，TAE電泳緩沖液，100 V 60 min電泳后用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)觀察結果，以產(chǎn)物中出現(xiàn)347 bp條帶的樣品為陽性。

2　結果

2.1血清學檢測結果收集屠宰生豬血清510份，HAV-lgG陽性374份，陽性率73.3%。

2.2建立了甲型肝炎病毒的RT-PCR檢測方法反轉錄∶RT反應采用20 μL體系，其組成如下∶模板RNA 7 μL，引物P2（10 μmol/L）2 μL，RNase-free ddH2O 3 μL，65℃5 min后立即冰上冷卻；后繼續(xù)添加5×Reaction Buffer 4 μL，Ribolock RNase抑制劑（20 U/μL）1 μL，dNTP mix（10 mm）2 μL，Revert Aid M-Mulv-RT（200 U/μL）1 μL。RT反應條件42℃60 min后70℃5 min。

PCR反應∶PCR反應體系采用50 μL體系，其組成如下∶10×PCR Buffer 5 μL、dNTP mix（10mM）1 μL、引物P1（10 μmol/L）1.5 μL、引物P2（10 μmol/L）1.5 μL、Taq酶0.25 μL、模板（cDNA）4 μL，ddH2O 36.5 μL。反應條件為∶95℃預變性，5 min；進入循環(huán)94℃30 s→47℃30 s→70℃，30 s，30個循環(huán)，72℃延伸7 min，最后4℃保存。用甲型肝炎減毒疫苗作為實驗樣本，經(jīng)上述RT-PCR反應后電泳圖。見圖1。

圖1　甲型肝炎減毒疫苗RT-PCR電泳結果

2.3陽性對照RT-PCR結果運用建立的RT-PCR方法對收集的甲肝患者的27份血液和32份膽汁標本進行HAV RNA檢測，有2份血液標本和1份膽汁標本成功擴增出目的條帶，見圖2。將此兩份血液標本和1份膽汁標本作為陽性對照。

2.4豬血液和膽汁中HAV RNA檢測結果運用建立的甲型肝炎病毒的RT-PCR方法對屠宰生豬的血液和膽汁標本，經(jīng)RT-PCR擴增后電泳結果未見任何條帶。見圖2。

圖2　屠宰生豬甲肝病毒PCR產(chǎn)物電泳圖

3　討論

在甲肝血清標志物中抗HAV-IgM是新近感染的標志，一般在發(fā)病后3～6個月轉陰，是早期診斷甲型肝炎最簡便和最可靠的血清學標志。抗HAVIgG屬于保護性抗體，是機體具有免疫力的標志，一般在體內(nèi)可持續(xù)多年或終身，HAV-IgG抗體陽性，提示接種過甲肝疫苗或以往感染過甲肝病毒，具有流行病學意義，可為制定有效、合理的預防措施提供科學依據(jù)〔7-10〕。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)大理地區(qū)屠宰生豬的HAV-lgG陽性率為73.3%，提示大多數(shù)屠宰豬通過自然感染獲得了自身免疫，說明HAV在屠宰生豬中有較高的流行率。

PCR是具有高特異性和敏感性，是檢測病毒常用的一種方法〔11-12〕。本研究用甲肝減毒活疫苗作為研究樣本，成功建立起RT-PCR來檢測方法，已分別從樣人血液和膽汁標本中提取HAV RNA，并通過RT-PCR擴增出HAV目的基因片段，說明以血液和膽汁作為HAV RNA檢測的標本是可行可靠的。但本研究未能在屠宰生豬血液和膽汁標本中擴增出目的基因，可能原因有∶一是豬源HAV與人類HAV基因序列差異較大，用人類HAV的引物無法擴增出目的基因。諸多研究已表明人類HAV具有一定程度的核苷酸和氨基酸異質(zhì)性〔13-15〕。這些研究表明甲肝病毒如同其它RNA病毒一樣，在生物體內(nèi)存在密切相關的變異株分布。王昊〔16〕通過對不同甲型肝炎患者進行比較，發(fā)現(xiàn)不同患者各基因片段核苷酸變異率相差較大?？梢姡琀AV在同物種不同個體間核苷酸變異較大，在不同物種間的基因序列差異較大也是可能的。另一種可能原因是甲型病毒性肝炎不是一種人畜共患病，豬不會感染人類甲型肝炎病毒。豬的血清中HAV-lgG陽性的出現(xiàn)可能是因為豬的細胞上有類似甲型肝炎病毒的抗原決定簇，導致HAV-lgG檢測出現(xiàn)假陽性〔16〕。

目前，對HAV在不同物種間的研究甚少。本研究HAV血清學檢測結果顯示豬源HAV-lgG陽性率雖較高，但缺少分子生物學相關證據(jù)，因此，對于豬是否可以感染人類甲型肝炎病毒還有待于進一步的研究，甲型病毒性肝炎是否像戊型病毒性肝炎一樣〔17〕，是一種人畜共患疾病，也有待于不同物種間HAV的深入研究。

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Establishment of Hepatitis A Virus RT-PCR Detection Method and Its Epidemiological Investigation in Swinery

Ai Zhiqiong1，Zhang Ling1，2，Li Lijuan3，Li Ze1，Wang Yunhong1，Shen Yuanying1*
（1.College of Public Health，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Disease Control and Prevention Centers of Zigong，Zigong，Sichuan 643000，China；3.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To study the epidemic state of the Hepatitis A Virus（HAV）infection in swinery，and to explore the possibility of swine as another host or carrier of HAV for providing basis for prevention and controlling measures of human HA.Methods:Serum HAV-IgG of swine in Dali was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and HAV-RNA of swine blood and swine bile samples were tested by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR），with the blood and bile of HAV as positive control.Results:①HAV antibody positive rate of the blood samples of swine were detected as 73.3%（374/510）；②RT-PCR method was built to detect HAV；③HAV-RNA of positive control samples were detected with RT-PCR；④HAV-RNA of swine blood and swine bile samples were not detected with RT-PCR.Conclusion:RT-PCR method is successfully built to detect HAV-RNA.The antibody positive rate of HAV is rather high in the blood sample of swine.Further research is necessary to demonstrate whether the swine could infect human HAV.

Hepatitis A virus（HAV）；swine；Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）；Reverse transcription-Polymerase chain reaction（RT-PCR）；Dali

R512.91

A

2096-2266（2016）10-0081-04

（責任編輯董杰）

云南省科技廳青年基金資助項目（2012FD035）；云南省科技廳應用基礎研究面上項目基金資助（2013FB060）

2016-03-09

2016-05-02

艾志瓊，講師，主要從事分子流行病學研究.

*通信作者：申元英，教授.