王 瑋 古桑德吉 德吉卓嘎

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所藥理室，西藏 拉薩 850000

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二十五味珊瑚丸的微生物限度檢查方法驗(yàn)證

王 瑋 古桑德吉 德吉卓嘎

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所藥理室，西藏 拉薩 850000

目的：建立二十五味珊瑚丸微生物檢查方法。 方法：分別采用傾注法和薄膜過濾法對(duì)4種陽性菌株進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：二十五味珊瑚丸有較強(qiáng)的抑菌作用，采用薄膜過濾法才能徹底消除其抑菌作用，3種菌株回收率均能達(dá)到50%。結(jié)論：采用薄膜過濾法測(cè)定二十五味珊瑚丸中的需氧菌，霉菌和酵母菌可按傾注法測(cè)定，控制菌可按常規(guī)法測(cè)定。

二十五味珊瑚丸；傾注法；薄膜過濾法

藏藥二十五味珊瑚丸(藏藥名：球瑪爾尼阿日布)由公元18世紀(jì)著名藏醫(yī)藥學(xué)家帝瑪爾·丹增彭措研制，轉(zhuǎn)載于公元19世紀(jì)藏醫(yī)藥學(xué)家迷旁·朗杰加措編撰的《集藥利樂庫(kù)》，該書記載了二十五味珊瑚丸的配方及功能主治，并沿用至今[1]，現(xiàn)收載于1995年版中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥第1冊(cè))中。該藏藥由珊瑚、珍珠、訶子、木香、青金石、麝香、紅花等25味藏藥材組成的復(fù)方制劑，具有開竅、通絡(luò)、止痛等功效。用于“白脈病”神志不清、身體麻木、頭昏目眩、腦部疼痛、血壓不調(diào)、頭痛、癲癇及各種神經(jīng)性疼痛。此標(biāo)準(zhǔn)中沒有規(guī)定具體的微生物限度檢查方法，為確保微生物檢查方法的科學(xué)性和結(jié)果的準(zhǔn)確性，研究按照《中國(guó)藥典》2015年版第四部的規(guī)定對(duì)其微生物限度檢查進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。

1儀器與材料

1.1 樣品 二十五味珊瑚丸(A企業(yè)，批號(hào)141104;B企業(yè)，批號(hào)20150506；C企業(yè)，批號(hào)20150407；D企業(yè)，批號(hào)150401)。

1.2 試驗(yàn)用培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，批號(hào)：151228)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號(hào)：151230)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號(hào)：151219)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：151219)、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基(批號(hào)：150916)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：151210)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào)：151204)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：141016)均為北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。 1.3 試驗(yàn)菌株 大腸埃希菌(CMCC(B)44 102)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26 003)、枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63 501)、白色念珠菌(CMCC(F)98 001)、乙型副傷寒沙門菌(CMCC(B)50 094)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.4 儀器 BPG-9200BH型高溫鼓風(fēng)干燥箱(上海-恒科技有限公司)；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；PYX-PHS-60×75-BS-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；1300系列Ⅱ級(jí)A2型生物安全柜(美國(guó)熱電公司)；HTV-200型集菌儀(杭州泰林醫(yī)療器械廠)；2H-2型自動(dòng)漩渦混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)；PL202-S電子天平(梅特勒-托多儀器(上海)有限公司)；YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備 按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查[2]。2.1.1 菌液制備 接種大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門菌和金黃色葡萄球新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)液中，30～35℃培養(yǎng)36h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)36h。乙型副傷寒沙門菌為控制菌檢查用菌，不用于菌株回收率測(cè)定。

2.1.2 供試液制備 稱取樣品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，制成1∶10供試液；吸取1∶10供試液1mL，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10mL，制成1∶100供試液。

2.1.3 試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入制備好的菌液，混勻，分別制成每1mL含菌數(shù)為10～100CFU的試驗(yàn)菌液。

2.1.4 供試液對(duì)照組 取“2.1.2”制備好的供試液，以稀釋液代替菌液其他同試驗(yàn)組。

2.1.5 菌液對(duì)照組 取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入菌液來進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

2.2 傾注法

2.2.1 試驗(yàn)組 取1∶10試驗(yàn)菌液1mL注入平皿中，含白色念珠球菌組傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，除含白色念珠球菌組外傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，待凝固后，含白色念珠菌組置于25～28℃培養(yǎng)5d，除白色念珠菌組外置于30～35℃培養(yǎng)72h，觀察結(jié)果測(cè)定菌落數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)菌株平行制作2個(gè)平皿。

2.2.2 供試品對(duì)照組 取“2.1.4”試液1mL注入平皿中，按傾注法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

2.2.3 菌液對(duì)照組 取“2.1.5”試液1mL注入平皿中，其他同試驗(yàn)組。

2.2.4 稀釋劑對(duì)照組 取稀釋液1mL注入平皿中，其他同試驗(yàn)組。

2.2.5 結(jié)果 經(jīng)試驗(yàn)，表1中選取的4個(gè)廠家樣品均對(duì)白色念珠球菌無明顯抑制作用，回收率在50%以上，采用傾注法即可滿足對(duì)樣品中霉菌及酵母菌的檢查。樣品對(duì)大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用，回收率在50%以上，但對(duì)枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用，回收率大部分在50%以下。表2采用1∶100供試液測(cè)定了菌株的回收率，回收率大部分在50%以下。結(jié)果表明采用傾注法可能無法滿足對(duì)樣品中需氧菌的檢查，故接下來采用薄膜過濾法法對(duì)谷草芽孢桿菌回收率進(jìn)行測(cè)定。表3為稀釋劑試驗(yàn)用菌回收率。

表1 傾注法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)菌株的回收率 (%)

表2 傾注法測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株的回收率 (%)

表3 稀釋液對(duì)照組實(shí)驗(yàn)菌株的回收率 (%)

2.3 薄膜過濾法

2.3.1 試驗(yàn)組 取1∶10試驗(yàn)菌液2mL注入薄膜過濾器中，用100mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，使分散均勻，全量過濾，再以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100mL沖洗4次，全量濾過，轉(zhuǎn)帖至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上。由表1中看出樣品對(duì)于枯草芽孢桿菌的抑制作用比較強(qiáng)，先進(jìn)行枯草芽孢桿菌回收率的測(cè)定。

2.3.2 供試品對(duì)照組 取“2.1.4”制備的試液2mL加入薄膜過濾器中，不加試驗(yàn)菌液，其它同試品驗(yàn)組。

2.3.3 菌液對(duì)照組 取“2.1.5”制備的試驗(yàn)液2mL加入薄膜過濾其中，用100mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，使分散均勻，全量過濾，轉(zhuǎn)帖至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上。

2.3.4 稀釋劑對(duì)照組 取稀釋液2mL薄膜過濾器中，用100mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，使分散均勻，全量過濾，轉(zhuǎn)帖至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上。

2.3.5 結(jié)果 表4中，1∶10供試液任對(duì)試驗(yàn)菌有一定的抑制作用。表5為稀釋液對(duì)照組實(shí)驗(yàn)菌株的回收率。表6中，用同樣薄膜過濾法法取1∶100供試液測(cè)定了菌株的回收率，結(jié)果表明，各試驗(yàn)菌株回收率均大于50%，故采用1∶100供試品溶液進(jìn)行薄膜過濾法，適用于二十五味珊瑚丸的細(xì)菌的微生物限度測(cè)定試驗(yàn)。

表4 薄膜過濾法測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株的回收率 (%)

表5 稀釋液對(duì)照組實(shí)驗(yàn)菌株的回收率 (%)

表6 薄膜過濾法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)菌株的回收率 (%)

2.4 控制菌檢查法的驗(yàn)證 本品為含藥材原粉的固體口服藥，因此以大腸埃希菌和沙門菌為控制菌進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4.1 試驗(yàn)組 取1∶10供試液10mL及大腸埃希試驗(yàn)菌液1mL加入100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中；直接稱取供試品10g及乙型副傷寒沙門菌液1mL加入200mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)液中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。試驗(yàn)菌液溶度均在10～100CFU。

2.4.2 供試品對(duì)照組 其他同供試品組但不加入試驗(yàn)菌液。

2.4.3 稀釋劑對(duì)照組 取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1mL加入10mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

2.4.4 結(jié)果 采用常規(guī)控制菌檢查法，均能檢出試驗(yàn)菌，表明此法可適用于二十五珊瑚丸的控制菌檢查。結(jié)果見表7。

表7 控制菌驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

二十五味珊瑚丸是含有多種成分的復(fù)合制劑，通過傾注法不難發(fā)現(xiàn)二十五味珊瑚丸是一種抑菌作用較強(qiáng)的藥品，在本次驗(yàn)證過程中首先考慮增加稀釋液和薄膜過濾法聯(lián)用來去除藥品中的抗菌活性。薄膜過濾法能很好的把外界影響和操作者的主觀因素減少到最低，所以該方法更為客觀，能夠全面反映藥品的染菌情況[3]。

由于西藏自然環(huán)境特殊，海拔高，含氧量?jī)H為平原地區(qū)的60%左右，在制備金黃色葡萄球菌和其他試驗(yàn)用菌時(shí)，需將培養(yǎng)時(shí)間由《中國(guó)藥典》2015年版第四部中規(guī)定的18～24h延長(zhǎng)至36h，才能良好生長(zhǎng),故將試驗(yàn)用菌培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至36h。

[1] 杜文兵，黃福開，羅遠(yuǎn)帶，等. 二十五味珊瑚丸藥理及臨床研究進(jìn)展[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，8(5)：537-540.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(四部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1105-1106.

[3]王亞婷. 薄膜過濾法在藥品微生物限度檢查中的應(yīng)用[J].河北化工，2013，36(4)：8-9.

(編輯：程鵬飛)

Validation Method for Microbial Limit of Ershiwuwei Shanhu Wan

WANG wei GU Sangdeji DEJi zhuoga

Pharmacological Room,Tibet Institute for Food and Drug Control,Lhasa 850000,China

Objective Set up Ershiwuwei shanhu wan microbiological examination method. Methods Pouring method and membrane filtration method were used respectively for four kind of positive strain rate experiments. Result Ershiwuwei shanhu wan strong bacteriostasis, finally USES the membrane filtration method can eliminate the bacteriostatic action, Three strains of recovery rate can reach 50%.Conclusion Using the membrane filter method for determination of aerobe in Ershiwuwei shanhu wan,Mold and yeast can press pour method,Control bacteria can according to the conventional method.

Ershiwuwei Shanhu Wan;Pour Method;Membrane Filtration Method

2016-07-21

王瑋(1985-)，女，漢族，本科，研究方向?yàn)樗幤肺⑸锵薅?。E-mail:67597683@qq.com

R284

A

1007-8517(2016)20-0027-03