張穎，曾艷，邱廣君，李星碩，孫媛霞**

（1.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308；2.黑龍江國譽生物科技發(fā)展股份有限公司，黑龍江雞東158200）

〈生理生化〉

刺五加栽培基質(zhì)對黑木耳多糖化學(xué)組成及抗氧化性的影響*

張穎1，曾艷1，邱廣君2，李星碩1，孫媛霞1**

（1.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308；2.黑龍江國譽生物科技發(fā)展股份有限公司，黑龍江雞東158200）

為探討刺五加栽培基質(zhì)對黑木耳及其多糖化學(xué)組成、抗氧化性的影響。以刺五加基質(zhì)栽培的黑木耳為原料，以非刺五加栽培的黑木耳為對照，測試了2種黑木耳總糖、總蛋白、脂肪、總酚和灰分的含量；通過纖維素酶酶解、NaOH提取和水洗連續(xù)提取黑木耳多糖，并對提取物的化學(xué)組成與抗氧化性進行了分析。結(jié)果表明，2種黑木耳的總糖含量均超過55%，其多糖均由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和巖藻糖組成。然而，與對照相比，刺五加黑木耳的多酚含量明顯提高，含有蛋白質(zhì)7.9%，單糖組成中的葡萄糖含量明顯降低，半乳糖含量明顯增加。其中，含蛋白的刺五加黑木耳多糖中半乳糖的摩爾百分含量為32.4%，是對照的4.8倍，其氧自由基和ABTS自由基清除能力也分別提高了3.2倍和2.7倍。刺五加栽培基質(zhì)的使用，能改變黑木耳化學(xué)成分的合成代謝途徑，對黑木耳活性成分的產(chǎn)量與功能提升具有重要作用。

刺五加基質(zhì)；黑木耳；多糖；單糖組成；抗氧化性

黑木耳（Auricularia auricula）屬于真菌門（Eumycota）擔子菌亞門（Basidiomycotina）木耳目（Auriculariales）木耳科（Auriculariaceae）木耳屬（Auricularia）真菌，生長于木質(zhì)基質(zhì)上。其起源于我國，距今已有14 000年的歷史，在我國食用菌產(chǎn)業(yè)體系中占有重要地位［1］。作為公認的高營養(yǎng)保健食品，黑木耳被報道的眾多功效如促進血液循環(huán)、潤肺、降血糖、止血、消炎、抑制潰瘍和吸附作用等［2］與其多糖成分密切相關(guān)［3］。而真菌多糖的生物活性又與其來源、理化性質(zhì)、單糖組成、結(jié)構(gòu)和分支度，甚至提取、分離手段等密切相關(guān)［4］。傳統(tǒng)中藥材刺五加（Eleutherococcus senticosus）具有調(diào)節(jié)機體紊亂、益氣健脾、補血安神、抗疲勞、改善體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)等功能［5］。黑龍江省的農(nóng)技人員，利用刺五加的生長地域優(yōu)勢，開展了刺五加或刺五加渣栽培黑木耳的技術(shù)研究［6-7］，發(fā)現(xiàn)刺五加栽培的黑木耳肉質(zhì)厚、味甘平、口感好。然而，目前未見刺五加栽培基質(zhì)對黑木耳和其多糖化學(xué)組分與功能影響的相關(guān)報道。本研究對刺五加、非刺五加基質(zhì)栽培黑木耳的主要化學(xué)成分進行比較分析，在此基礎(chǔ)上提取黑木耳多糖提取物，對多糖提取物的組成和抗氧化性進行分析比較，以期為刺五加栽培黑木耳的營養(yǎng)功能改善提供理論依據(jù)，促進刺五加栽培黑木耳及其下游相關(guān)產(chǎn)品的研究開發(fā)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

同一菌種，刺五加與普通基質(zhì)栽培的黑木耳均由黑龍江國譽生物科技發(fā)展股份有限公司提供。其中普通基質(zhì)栽培的黑木耳作為對照。

2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽［2，2'-Azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH］、牛血清蛋白BSA、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖購自美國Sigma-Aldirch公司；肌醇、半乳糖醛酸、間羥基聯(lián)苯（3-phenylphenol）購自北京索萊寶科技有限公司公司。纖維素酶（Cellulase）ACCF-4740購自日本明治制果藥業(yè)株式會社。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1800紫外分光光度計，日本島津公司；Spectra Max M5多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司；Sorvall Evolution RC高速落地離心機，美國Thermo Scientific公司；IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA集團；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，河南省予華儀器有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Agilent 1200 Series高效液相色譜、Agilent 5975C GC/7200 Q-TOF精確質(zhì)量四級桿飛行時間質(zhì)譜，美國安捷倫公司。

1.3方法

1.3.1黑木耳子實體中主要化學(xué)成分測試方法

蛋白質(zhì)：參照GB 5009.5-2010食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定第一法；總糖（以葡萄糖計，干基）：參照GB/T 15672-2009食用菌中總糖含量的測定；脂肪：參照GB/T 5009.6-2003食品中脂肪的測定第二法；灰分：參照GB 5009.4-2010食品安全國家標準食品中灰分的測定；總酚：福林酚法，參考Kim等［8］方法，以沒食子酸為標準品。

1.3.2黑木耳子實體多糖的提取

參考王金鳳［9］、Sone等［10］的方法。具體提取工藝見圖1。

圖1　黑木耳多糖提取步驟Fig.1Fractional preparation of polysaccharides from Auricularia auricula

取干燥、粉碎后的黑木耳以1∶40（m·V-1）的料液比加入二次水，調(diào)節(jié)pH為4.0，加入樣品質(zhì)量1%的纖維素酶Cellulase ACCF-4740，在45℃酶解2 h，95℃滅酶15 min，離心取上清液；在殘渣中加入二次水在120℃下高壓處理20 min后，離心；其上清液與酶解上清液合并，減壓濃縮后加入4倍體積的無水乙醇沉淀，凍干后得到酶解多糖。剩余殘渣用濃度為1 mol·L-1NaOH在60℃下繼續(xù)提取2 h，提取結(jié)束后用鹽酸中和，離心，上清液透析后，減壓濃縮，再加入4倍體積的無水乙醇沉淀，凍干后得到堿提多糖；剩余殘渣用二次水徹底清洗，透析后，減壓濃縮，再加入4倍體積的無水乙醇沉淀，凍干后得到水提多糖。

1.3.3黑木耳子實體多糖理化指標測試

采用硫酸苯酚法，以葡萄糖為標準品，測試糖質(zhì)量分數(shù)［11］；采用Bradford法，以牛血清蛋白（BSA）為標準品，測試蛋白質(zhì)量分數(shù)［12］；采用間羥基聯(lián)苯法，以半乳糖醛酸為標準品，測試糖醛酸質(zhì)量分數(shù)［13］。

1.3.4黑木耳子實體多糖的單糖組成分析

各取2 mg不同組分多糖樣品，分別加1 mL的2 mol·L-1三氟乙酸（TFA），密封，110℃，水解2 h，冷卻后通N2吹干，再用硼氫化鈉NaBH4還原，經(jīng)乙?；幚砗螅确螺腿?次，用水反洗4次～5次，無水硫酸鈉（Na2SO4）脫水，進行GC-MS/GC上機分析。

氣相色譜條件：安捷倫5975C氣相色譜儀，色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度250℃，載氣為高純He，流速為16.2 mL·min-1，柱溫度170℃下保持0 min，1℃·min-1至190℃保持0 min，2℃·min-1至240℃保持5 min。進樣量1 μL，分流比10∶1。

質(zhì)譜條件：用電子轟擊（electron impact EI）源分析，電子能量為70 eV，離子源溫度200℃，接口溫度280℃。選取全程離子碎片掃描（full scan）模式時，質(zhì)量掃描范圍為45～550，溶劑延遲4.0 min。

1.3.5黑木耳子實體多糖清除氧自由基測試方法

采用張穎等［14］方法進行氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORACFL）測試。以水溶性的維生素E衍生物Trolox為標準品，計算每克多糖樣品相當于Trolox物質(zhì)的量（μmol），即ORACFL值，以μmol Trolox·g-1表示。

1.3.6黑木耳子實體多糖清除ABTS自由基測試方法

采用張穎等［14］方法，以水溶性的維生素E衍生物Trolox為標準品，計算每克多糖樣品相當于Trolox物質(zhì)的量（μmol），即TEAC值，以μmol Trolox·g-1表示。

2　結(jié)果與分析

2.1黑木耳子實體主要化學(xué)成分

對照黑木耳與刺五加黑木耳的主要化學(xué)成分分析結(jié)果見表1。

表1　黑木耳主要化學(xué)成分分析Tab.1Chemical components of Auricularia auricula

從表1可以看出，與對照黑木耳比較，刺五加基質(zhì)栽培的黑木耳的總糖、總蛋白、脂肪含量略有提高，總酚含量比對照黑木耳提高了1.6倍。文獻表明［15-16］，在使用木質(zhì)纖維素栽培木腐菌時，當菌絲體進入分解木質(zhì)纖維素的階段，由于一些酶分子量太大，無法深入到木材的內(nèi)部，木腐菌會產(chǎn)生一些自由基類化合物對木材內(nèi)部進行攻擊，同時會產(chǎn)生多糖、酚類、黃酮類物質(zhì)進行防御，抵抗自由基對自身的進攻。而且木質(zhì)纖維素的降解代謝產(chǎn)物會通過生物轉(zhuǎn)化進入菌多糖的合成途徑，對木腐菌的多糖生產(chǎn)及組成產(chǎn)生影響。表1中刺五加黑木耳與對照黑木耳的總糖含量均達到55%（wt·wt-1），說明多糖是黑木耳子實體主要的組成成分。因此后期以多糖為主要研究指標，進行了刺五加黑木耳與對照黑木耳多糖的提取，并對所提多糖的化學(xué)組成和抗氧化性進行了深入分析比較。

2.2黑木耳子實體多糖理化指標

與對照黑木耳比較，刺五加黑木耳子實體多糖理化指標分析結(jié)果見表2。

從表2可以看出，與對照黑木耳相比，刺五加黑木耳酶解、堿提、水提多糖提取物中糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量均不同。

酶解刺五加黑木耳多糖提取物含有7.9%的蛋白質(zhì)，由于纖維素酶酶解方法比較溫和，不容易使蛋白發(fā)生裂解［17］，因此酶解提取的刺五加黑木耳多糖中能檢測到蛋白質(zhì)的存在，而其它方法提取的黑木耳多糖中，未檢測到蛋白質(zhì)。蛋白多糖復(fù)合物是食用菌子實體中重要的功能成分，具有抗氧化、降血糖、抗疲勞等作用，可作為癌癥和皰疹病人非特異性免疫刺激的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物質(zhì)，對疾病預(yù)防、治療具有重要應(yīng)用價值［18］。

表2　黑木耳子實體多糖理化指標Tab.2Physicochemical property on different fractions of Auricularia auricula polysaccharides

進一步對酶解后的黑木耳殘渣用1 moL·L-1的NaOH在65℃下進行提取，堿有利于酸性多糖的浸出，可促使多糖與蛋白質(zhì)間的鍵裂解，減少多糖中蛋白結(jié)合［19］，因此2種黑木耳堿提多糖組分糖醛酸含量均較高，分別為21.3%和18.4%，卻均不含蛋白質(zhì)。

另有文獻表明［9-10］，黑木耳子實體中存在堿不溶性多糖，因此最后用二次水清洗堿提殘渣，獲得的多糖組分水溶性較差，在應(yīng)用上存在局限性。

2.3單糖組成分析結(jié)果

對照黑木耳多糖與刺五加黑木耳多糖的單糖組成分析色譜圖見圖2。各單糖組分的摩爾百分比結(jié)果見表3。

圖2　黑木耳多糖的單糖組成氣相色譜圖Fig.2GC chromatograms on monosaccharide composition of different polysaccharides from Auricularia auricula

表3　不同組分黑木耳子實體多糖的單糖組成Tab.3Monosaccharide composition of different polysaccharides from Auricularia auricula

從圖2可以看出，同種提取方式獲得的對照黑木耳與刺五加黑木耳多糖的單糖組成基本相同，但摩爾含量均不同。刺五加黑木耳酶解多糖的葡萄糖含量明顯降低，半乳糖含量明顯增加，半乳糖在單糖組成中的摩爾百分含量為32.4%，是對照的4.8倍；刺五加黑木耳水提多糖由摩爾比1.2∶1的葡萄糖和甘露糖組成，而對照的葡萄糖和甘露糖摩爾比為7.2∶1。單糖組成變化結(jié)果與已有報道類似，如Chen等［20］使用玉米秸稈替代普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基生產(chǎn)Inonotus obliquus菌多糖，發(fā)現(xiàn)菌多糖的甘露糖和半乳糖比例均有所提高。文獻表明［21］，不同來源的葡甘聚糖、半乳甘露聚糖具有非常明顯的抗氧化、抗炎、抗凝血、抗病毒、降血糖脂等功能，還對多種致癌、促癌物有抑制作用。

2.4清除氧自由基能力

對照黑木耳多糖與刺五加黑木耳多糖清除氧自由基的結(jié)果見圖3。

圖3　黑木耳多糖抗氧化性O(shè)RACFL值比較Fig.3ORACFLvalues of different polysaccharides from Auricularia auricular

從圖3可以看出，刺五加黑木耳酶解多糖和水提多糖的清除氧自由基的能力均強于對照，其中酶解刺五加黑木耳多糖的ORACFL值最高，是對照的3.2倍。

2.5清除ABTS自由基能力

對照黑木耳多糖與刺五加黑木耳多糖清除ABTS自由基的結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，與氧自由基清除能力趨勢一致，刺五加黑木耳酶解多糖和水提多糖的清除ABTS自由基的能力均強于對照，其中酶解刺五加黑木耳多糖的TEAC值最高，是對照的2.7倍。

綜前所述，含有蛋白的刺五加黑木耳酶解多糖的抗氧化能力最強，其次是甘露糖含量較高的水提多糖。而刺五加黑木耳的堿提多糖清除氧自由基和ABTS自由基的能力均比對照低，說明1 mol·L-1NaOH提取時，堿對多糖結(jié)構(gòu)的破壞性較大，刺五加黑木耳受到堿的影響較大，導(dǎo)致其抗氧化能力較弱。

圖4　黑木耳多糖抗氧化性TEAC值比較Fig.4TEAC values of different polysaccharides from Auricularia auricular

3　結(jié)論

使用刺五加基質(zhì)栽培黑木耳，盡管黑木耳子實體中總蛋白、總糖和脂肪含量變化不明顯，但是總酚含量和多糖提取物中蛋白含量明顯提高。同時黑木耳多糖的單糖組成比例發(fā)生改變，抗氧化性提高，如含蛋白的刺五加黑木耳多糖中半乳糖含量提高4.8倍，其氧自由基與ABTS自由基的清除能力分別提高3.2和2.7倍。

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Influence of Eleutherococcus senticosus Substrate on the Chemical Composition and Antioxidant Activities of Auricularia auricular Polysaccharides

ZHANG Ying1，ZENG Yan1，QIU Guang-jun2，LI Xing-shuo1，SUN Yuan-xia1
（1.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China；2.Heilongjiang Guoyu Biological Science and Technology Development Co.Ltd.，Jidong 158200，China）

This study was aimed to investigate the influence of Eleutherococcus senticosus substrate on Auricularia auricular and the chemical composition，antioxidant activities of its polysaccharides，using A.auricular cultivated on ordinary substrate as the control.The contents of total sugar，protein，polyphenol，lipid and ash in the two A.auricular were analyzed.The polysaccharide extracts of the two A.auricular were further prepared by sequently enzymolysis，alkali and water extraction.The chemical composition and antioxidant activity of the polysaccharides were also determined.The results showed that the content of total sugar in the two A.auricular both exceeded 55%（wt·wt-1），the polysaccharides of the two A.auricular were both consisted of glucose，mannose，galactose，xylose and fucose.However，compared to the control，the A.auricular cultivated on E.senticosus substrate had an obvious higher content of polyphenol，and the content of protein was 7.9%（wt·wt-1），and in the monosaccharide composition of its polysaccharide，the content of glucose decreased and the content of galactose obviously increased.The polysaccharide extract containing the polysaccharide-bound protein，which was from A.auricular cultivated on E.senticosus substrate，had a mole content of galactose of 32.4%，about 4.8 times higher than that of the control.Moreover，its oxyradical and ABTS radical scavenging capacities were improved 3.2 and 1.7 times against that of the control.The above results indicated thatE.senticosus substrate could change the metabolic pathway of the active ingredients in A.auricular，and played an important role on the yield of active ingredients and the related bioactivities.

Auricularia auricular；Eleutherococcus senticosus substrate；polysaccharides

S646.6

A

1003-8310（2016）03-0044-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.03.010

中國科學(xué)院重點部署項目2013（KSZD-EW-Z-019）；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目（2014GB2A100504）。

張穎（1980-），女，博士，助理研究員，主要從事食用菌及其天然產(chǎn)物方面研究。E-mail：zhang_ying@tib.cas.cn

**通信作者：孫媛霞（1963-），女，博士，教授，主要從事功能糖及天然產(chǎn)物方面研究。E-mail：syx0430@hotmail.com

2016-03-16