龍　泉, 朱　淳, 鄒　軍, 劉秀英, 蔣更如

(1. 上海國(guó)際醫(yī)學(xué)中心 腎臟內(nèi)科, 上海, 201318;2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院 腎臟內(nèi)科, 上海, 202150;3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 腎臟內(nèi)科, 上海, 200092)

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IgA腎病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體4的表達(dá)及血清炎癥趨化因子的水平

龍泉1, 朱淳2, 3, 鄒軍3, 劉秀英3, 蔣更如3

(1. 上海國(guó)際醫(yī)學(xué)中心 腎臟內(nèi)科, 上海, 201318;2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院 腎臟內(nèi)科, 上海, 202150;3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 腎臟內(nèi)科, 上海, 200092)

目的研究IgA腎病(IgAN)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體4(TLR4)的表達(dá)及血清中趨化因子MCP-1和炎癥因子IL-6的水平，探討TLR4在IgAN發(fā)病中可能的作用。方法將在本科經(jīng)腎組織活檢確診為IgAN的60例患者(排除繼發(fā)性和遺傳性IgAN)根據(jù)蛋白尿程度進(jìn)行分組，分為輕度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量≤1.0 g), 中度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量1.0～3.0 g)和重度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量≥3.0 g)。另取年齡性別相匹配的健康志愿者20例作為健康對(duì)照組。分別使用流式細(xì)胞儀和Realtime-PCR方法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中TLR4蛋白和基因的表達(dá), ELISA法檢測(cè)血清中趨化因子MCP-1和炎癥因子IL-6的水平。結(jié)果IgAN組患者PBMC中TLR4的蛋白和基因表達(dá)水平以及血清中MCP-1和IL-6的濃度均較健康對(duì)照組顯著增加(P均<0.05)。PBMC中TLR4的蛋白和基因表達(dá)水平隨著蛋白尿的嚴(yán)重程度而逐漸增高。直線相關(guān)分析提示PBMC中TLR4 mRNA的表達(dá)水平與24 h尿蛋白定量呈顯著正相關(guān)(r=0.855,P<0.05), 而與GFR呈負(fù)相關(guān)(r= -0.735,P<0.05)。MCP-1和IL-6的水平與PBMC中TLR4 mRNA的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.746、0.821,P<0.05)。結(jié)論IgAN患者PBMC中存在TLR4的表達(dá)水平上調(diào)，與蛋白尿程度和腎功能水平密切相關(guān)。血清中趨化因子MCP-1和炎癥因子IL-6的水平也隨著PBMC中TLR4的表達(dá)水平升高而升高。TLR4可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體趨化因子和炎癥因子的釋放介導(dǎo)了IgA腎病中的炎癥損傷。

IgA腎病; Toll樣受體4; 單核細(xì)胞趨化因子-1; 白介素-6; 固有免疫

免疫球蛋白A腎病(IgAN)是亞洲人群最常見(jiàn)的腎小球疾病，也是導(dǎo)致終末期腎病的重要病因[1]。IgAN的確切發(fā)病機(jī)制不明，遺傳、環(huán)境、免疫失調(diào)等多種因素參與其中。Toll樣受體4(TLR4)是一種重要的模式識(shí)別受體，通過(guò)識(shí)別多種外源性和內(nèi)源性配體激活細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子從而釋放多種炎癥因子，是病原體感染后連接機(jī)體固有免疫和獲得性免疫的重要橋梁[2]。臨床上發(fā)現(xiàn)黏膜系統(tǒng)(如呼吸道、消化道、泌尿道)的感染(如細(xì)菌、病毒、不典型病原體等)往往能誘發(fā)或加重IgAN，因此作者推測(cè)TLR4可能參與了IgAN的發(fā)生。本研究通過(guò)觀察IgAN患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中TLR4的表達(dá)水平及其相應(yīng)的血清中趨化因子MCP-1和炎癥因子IL-6的水平，探討TLR4在IgAN發(fā)病中可能的作用機(jī)制。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2012年10月—2014年3月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院腎臟科行腎穿刺活檢確診的IgAN患者60例(男36例，女24例)作為病例組。患者同時(shí)需符合以下條件: ① 腎活檢前3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)激素和免疫抑制劑; ② 除外紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、乙肝/丙肝病毒相關(guān)性腎炎等繼發(fā)性IgAN以及家族遺傳性IgAN; ③ 無(wú)活動(dòng)性感染性疾病; ④ 年齡18～60歲。根據(jù)24 h尿蛋白定量結(jié)果將IgAN患者分為3組: 輕度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量≤1.0 g), 中度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量1.0～3.0 g)和重度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量≥3.0 g)。另選取20例(男10例，女10例)年齡性別相匹配的健康志愿者(既往無(wú)糖尿病，高血壓，心腦血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病的疾患)作為對(duì)照組。所有患者均簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2研究方法

所有IgAN患者和健康對(duì)照者于晨起空腹采靜脈血，用德國(guó)Bayer公司生產(chǎn)的全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血糖、腎功能(包括尿素氮，肌酐和血尿酸)、血清IgA、補(bǔ)體C3等生化指標(biāo)。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)MCP-1和IL-6的水平(試劑盒購(gòu)于北京晶美生物工程有限公司)。留取24 h尿液計(jì)算24 h尿蛋白定量。99mTc-DTPA核素法測(cè)定腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)。

1.2.1采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC): 抽取患者和健康對(duì)照者新鮮靜脈血5 mL于肝素抗凝管，加等體積的生理鹽水稀釋，吸取淋巴細(xì)胞分離液5 mL(購(gòu)于天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)，置于15 mL離心管中，然后小心地將2倍體積的稀釋血加在淋巴細(xì)胞分離液上, 2 000 r/min離心25 min, 小心吸出分層液與血漿交界處的灰白色渾濁層即為PBMC, PBS洗滌2次，臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)得活細(xì)胞>95%。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMC中TLR4的表達(dá): 取新鮮肝素抗凝全血各100 μL, 按試劑說(shuō)明書，分別加入20 μL單克隆抗體CD14-FITC/TLR4-PE及相應(yīng)的同型陰性對(duì)照小鼠抗人IgG1-FITC(熒光標(biāo)記抗體購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司)，混勻后室溫下避光反應(yīng)15 min后，加入1 mL紅細(xì)胞溶解素(購(gòu)自北京晶美基因谷科技有限公司), 37 ℃水浴約10 min, 待完全溶血后，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在Ex-po32ADC軟件下檢測(cè)和分析數(shù)據(jù)。

1.2.3PBMC中TLR4 mRNA的測(cè)定: 參照說(shuō)明書用Trizol試劑從分離的細(xì)胞中抽提約5×106個(gè)PBMCs的總RNA。以無(wú)模板的PCR產(chǎn)物為陰性對(duì)照。Trizol試劑、dNTP Mix、Rnasin、逆轉(zhuǎn)錄酶及緩沖系統(tǒng)、Taq DNA聚合酶及緩沖系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn), TLR4上游引物為: 5′-AAGTGTCTGAACTCCCTCCA-3′; 下游引物為: 5′-TCATTCCTTAC CCAGTCCTC-3′; 擴(kuò)增片段452 bp。β-actin上游引物為: 5′-CCGCGAGAAGATGACCCAGA-3′; 下游引物為: 5′-GCCGTGGTGGTGAAGCTGTA-3′, 擴(kuò)增片段269 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.4相關(guān)性分析: 將IgAN患者PBMC中TLR4mRNA的表達(dá)水平與24 h尿蛋白定量和GFR進(jìn)行相關(guān)性分析。將血清中MCP-1和IL-6的水平與PBMC中TLR4mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組資料的比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。由SPSS 10.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組間臨床指標(biāo)的比較

各組患者的年齡、性別無(wú)顯著差異。IgAN組較健康對(duì)照組24 h尿蛋白定量水平顯著升高(P均<0.05)。根據(jù)不同蛋白尿水平進(jìn)行分組，重度蛋白尿組患者與正常對(duì)照組以及輕度蛋白尿組患者相比，血壓(收縮壓和舒張壓)和血清IgA/C3水平顯著升高，而GFR和血清白蛋白水平顯著降低(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組臨床資料和生化指標(biāo)

與正常對(duì)照組比較, △P<0.05; 與輕度蛋白尿組比較, *P<0.05。

2.2PBMC中的TLR4表達(dá)水平

流式細(xì)胞儀檢測(cè)的PBMC中TLR4的蛋白表達(dá)水平在IgAN組患者中較在健康對(duì)照組中顯著升高(P均<0.05)，見(jiàn)圖1。IgAN患者PBMC中TLR4的表達(dá)水平隨著蛋白尿嚴(yán)重度增加而逐漸升高。流式細(xì)胞儀檢測(cè)的TLR4蛋白的熒光陽(yáng)性比例: 輕度蛋白尿組(12.38±3.29)%, 中度蛋白尿組(19.52±5.71)%，重度蛋白尿組(30.15±9.25)%。RT-PCR法檢測(cè)的TLR4 mRNA水平: 輕度蛋白尿組4.04±0.83, 中度蛋白尿組8.49±2.66, 重度蛋白尿組15.89±4.37。見(jiàn)表2。

圖1　流式細(xì)胞儀檢測(cè)IgAN組和正常對(duì)照組患者PBMC中TLR4的表達(dá)水平

與正常對(duì)照組比較, △P<0.05; 與輕度蛋白尿組比較, *P<0.05; 與中度蛋白尿組比較, #P<0.05。

2.3血清MCP-1和IL-6的濃度

IgAN組患者較健康對(duì)照組血清中MCP-1和IL-6的水平顯著升高(P均<0.05)。IgAN患者血清中MCP-1和IL-6的濃度隨著蛋白尿水平增加而逐漸升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4相關(guān)性分析

將TLR4的表達(dá)水平與24 h尿蛋白定量和GFR水平分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果提示IgAN患者PBMC中TLR4 mRNA的表達(dá)水平與24 h尿蛋白定量呈顯著正相關(guān)(r=0.855,P<0.05), 而與GFR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.735,P<0.05)。將血清MCP-1和IL-6的濃度與PBMC中TLR4 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果提示血清MCP-1和IL-6的水平與TLR4mRNA的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.746、0.821,P均<0.05)。

3　討　論

IgAN是亞洲國(guó)家最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病。由于多種因素參與了IgAN的發(fā)生和發(fā)展，而其確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，因此IgAN的臨床表現(xiàn)和病理表現(xiàn)異質(zhì)性很高。臨床研究發(fā)現(xiàn)IgAN患者的血清中存在與環(huán)境中抗原起反應(yīng)的IgA, 腎小球中存在與扁桃體起交叉反應(yīng)的IgA的沉積，且沉積在系膜區(qū)的主要是典型的黏膜免疫反應(yīng)產(chǎn)物多聚體IgA和分泌型IgA[3]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)多種病原體(如仙臺(tái)病毒、流感嗜血桿菌、細(xì)小病毒，柯薩奇病毒、金黃色葡萄球菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒和幽門螺桿菌等)通過(guò)不同途徑可以誘發(fā)出類似IgAN病理改變的腎臟損傷[4-6]。臨床上觀察到黏膜感染(尤其是上呼吸道感染和化膿性扁桃體炎)往往是IgAN發(fā)生或加重的誘因。這些結(jié)果均提示病原體感染與誘發(fā)IgAN發(fā)病密切相關(guān)，但病原體感染后誘發(fā)IgAN的具體機(jī)制并不清楚。人體內(nèi)面積約400 m2的黏膜的固有免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗外源性病原體入侵的第一道防線。Toll樣受體(TLR)是一種重要的模式識(shí)別受體，在抗感染時(shí)黏膜的固有免疫中發(fā)揮重要作用，也控制著機(jī)體由固有免疫向獲得性免疫的轉(zhuǎn)變[7-8]。目前至少已經(jīng)報(bào)道了十多種人TLR亞型，而TLR4是TLR家族中的重要成員，通過(guò)識(shí)別多種外源性配體(如革蘭陰性細(xì)菌胞壁的脂多糖LPS)和內(nèi)源性配體(如: 纖維連接蛋白，熱休克蛋白、纖維蛋白原等)激活細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號(hào)通路，導(dǎo)致粘附分子、炎癥因子、趨化因子、促凝血因子和縮血管因子等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，在介導(dǎo)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9]。已有研究[10-14]發(fā)現(xiàn)TLR4激活參與了內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性腎損傷、腎間質(zhì)纖維化、腎移植排斥反應(yīng)、抗體介導(dǎo)的腎小球腎炎、糖尿病腎病等眾多腎臟疾病的發(fā)病過(guò)程，但I(xiàn)gAN的發(fā)病機(jī)制中是否有TLR4的參與相關(guān)報(bào)道很少。有體外研究[15-18]發(fā)現(xiàn)TLR4被外源性配體細(xì)菌LPS激活后，誘導(dǎo)Cosmc(IgA1分子糖基化相關(guān)的β-1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶的分子伴侶)甲基化，導(dǎo)致IgA1分子糖基化水平降低。最近又有一項(xiàng)體外研究[16]報(bào)道在刺激的系膜細(xì)胞中, TLR4mRNA和蛋白表達(dá)增加與蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示, IgAN患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4的蛋白和基因表達(dá)水平均較健康對(duì)照組顯著增加，并且TLR4的表達(dá)水平隨著蛋白尿的嚴(yán)重程度而逐漸增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。直線相關(guān)分析顯示PBMC中TLR4 mRNA的表達(dá)水平與24 h尿蛋白定量呈顯著正相關(guān)，與GFR呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示IgAN患者的血循環(huán)中存在TLR4的激活，TLR4的活化程度與蛋白尿的程度和腎功能情況密切相關(guān)。由于起病時(shí)的血壓水平、蛋白尿水平、腎功能以及腎活檢的病理評(píng)分(牛津分型的MEST評(píng)分)是目前公認(rèn)的決定IgAN患者預(yù)后的重要因素，因此檢測(cè)血循環(huán)中的TLR4將來(lái)也有望成為判斷IgAN嚴(yán)重程度和預(yù)后的一個(gè)無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物。本組資料結(jié)果還顯示IgAN患者血清中趨化因子MCP-1和炎癥因子IL-6的水平均較健康對(duì)照組顯著增加，IgAN患者血清中MCP-1和IL-6的濃度隨著蛋白尿水平增加而逐漸升高，三組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。直線相關(guān)分析顯示IgAN患者血清MCP-1和IL-6的水平與PBMC中TLR4mRNA的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果就提示了IgAN患者血循環(huán)中趨化因子和炎癥因子的水平與PBMC中TLR4的激活密切相關(guān)。由此作者推測(cè)病原體感染機(jī)體后可能通過(guò)激活PBMC中的TLR4引起趨化因子和炎癥因子等細(xì)胞因子釋放，細(xì)胞因子隨著血循環(huán)聚集在腎小球?qū)е孪的^(qū)局部的炎癥反應(yīng)繼而引起系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生。既往有研究證實(shí)炎癥因子反過(guò)來(lái)也可能通過(guò)激活腎臟固有細(xì)胞(腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞)上的TLR4進(jìn)一步加重腎臟局部的炎癥反應(yīng)和腎臟損害，形成惡性循環(huán)，由此介導(dǎo)了IgAN的發(fā)生發(fā)展[19-21]。但本實(shí)驗(yàn)由于僅僅檢測(cè)了外周血中TLR4、MCP-1和IL-6的表達(dá)，尚未在體內(nèi)的腎組織和體外的細(xì)胞試驗(yàn)中驗(yàn)證TLR4與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子之間的關(guān)系。因此，本課題組下一步擬在腎活檢的組織標(biāo)本中進(jìn)一步探討IgAN患者腎組織中TLR4的表達(dá)與腎臟局部炎癥因子表達(dá)之間的關(guān)系。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)IgAN患者的血循環(huán)中存在TLR4的激活, IgAN患者PBMC中TLR4的表達(dá)水平與蛋白尿程度和腎功能水平密切相關(guān)。血清中炎癥反應(yīng)的相關(guān)細(xì)胞因子MCP-1和IL-6的水平隨著PBMC中TLR4的水平升高而升高。TLR4可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥因子的釋放介導(dǎo)了IgAN中的炎癥反應(yīng)和腎臟損傷。這為固有免疫在IgAN發(fā)病中的作用奠定了一定理論基礎(chǔ)。

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Expression of Toll-like receptor 4 and level of inflammation cytokine IL-6 and chemokine MCP-1 in peripheral blood mononuclear cells of patients with IgA nephropathy

LONG Quan1, ZHU Chun2, 3, ZOU Jun3, LIU Xiuying3, JIANG Gengru3

(1.DepartmentofNephrology,ShanghaiInternationalMedicalCenter,Shanghai, 201318; 2.DepartmentofNephrology,ChongmingBranchofXinhuaHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 202150; 3.DepartmentofNephrology,XinhuaHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 2000920)

ObjectiveTo explore the expression of Toll-like receptor 4 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and serum concentration of chemokine MCP-1 and inflammation cytokine IL-6 in patients with IgA nephropathy. MethodsA total of 60 patients with IgAN confirmed by renal biopsy were divided into three groups according to 24 h proteinuria, which were mild proteinuria group, morderate proteinuria group and severe proteinuria group. Patients with secondary and hereditary IgAN were excluded. Another 20 healthy volunteers were selected as control group. Protein and gene expression of TLR4 in PBMC were evaluated with flow cytometry and real time-PCR respectively. Levels of MCP-1 and IL-6 were measured by commercial ELISA kit. ResultsExpression of TLR4 in PBMC and levels of MCP-1 and IL-6 in circulation were significantly higher in IgAN group than in

IgA nephropathy; Toll-like receptor 4; MCP-1; IL-6; innate immunity

2016-06-05

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院科研基金資助(12QYJ06)

朱淳, E-mail: zhuchun26@sina.cn

R 692

A

1672-2353(2016)19-023-05DOI: 10.7619/jcmp.201619007

control group (P<0.05). Protein and gene expression of TLR4 in PBMC increased with the severity of proteinuria (P<0.05). The Pearson correlation coefficient analysis suggested that gene expression of TLR4 in PBMC was positively correlated with 24 h urinary protein excretion (r=0.855,P<0.05), but negatively correlated with GFR (r=-0.735,P<0.05). Serum concentration of MCP-1 and IL-6 were positively correlated with gene expression of TLR4 in PBMC (r=0.746, 0.821,P<0.05). ConclusionExpression of TLR4 in PBMC and levels of MCP-1 and IL-6 in circulation are all up-regulated in patients with IgAN. Expression of TLR4 in PBMC is closely related with the severity of proteinuria and renal function. These findings suggest that TLR4 may mediate inflammatory injury of IgAN by releasing inflammation cytokine and chemokine.