王宇航, 馬旻軒, 徐婭雯, 李　凱, 潘興元, 錢　莉, 龔衛(wèi)娟, 季明春

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)和免疫學(xué)教研室, 江蘇 揚州, 225001)

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NOD鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞間關(guān)系

王宇航, 馬旻軒, 徐婭雯, 李凱, 潘興元, 錢莉, 龔衛(wèi)娟, 季明春

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)和免疫學(xué)教研室, 江蘇 揚州, 225001)

目的探討NOD鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞間關(guān)系。方法動態(tài)監(jiān)測NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T及CD8+NKG2D+T細(xì)胞在不同周齡頻率。利用IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠，對其外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率進行分析。將磁珠分選所得CD4+NKG2D+T細(xì)胞分別與經(jīng)CFSE標(biāo)記的純CD4+NKG2D-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)4 d, 檢測體系中CD4+NKG2D-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞CFSE的熒光強度變化。結(jié)果NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率均隨其1型糖尿病疾病進程發(fā)展逐漸升高，且二者之間呈正相關(guān)。IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠，外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞頻率隨CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率降低顯著下降。與單獨培養(yǎng)的CD4+NKG2D-T細(xì)胞相比，加入CD4+NKG2D+T細(xì)胞的培養(yǎng)體系中, CD4+NKG2D-T細(xì)胞增殖加快。但CD4+NKG2D+T細(xì)胞對CD8+T增殖作用不明顯。結(jié)論NOD鼠體內(nèi)存在著一群與1型糖尿病疾病進程正相關(guān)的CD4+NKG2D+T細(xì)胞，且該群細(xì)胞極有可能是通過直接作用于CD4+NKG2D-T細(xì)胞而間接對CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生作用。

CD4+NKG2D+T細(xì)胞; CD8+T細(xì)胞; 1型糖尿病; NOD鼠

Relationship between CD4+NKG2D+T and CD8+T cells in NOD rats

1型糖尿病(T1D)是一種自身反應(yīng)性T細(xì)胞攻擊自身胰島β細(xì)胞使其受損的自身免疫性疾病[1-2]。該過程，主要是由效應(yīng)性的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞實施，其他多種免疫細(xì)胞共同參與而形成的。NKG2D為NK細(xì)胞活化性受體，近來研究發(fā)現(xiàn)亦可表達于人NKT、γδT、激活的巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞亞群、CD8+T細(xì)胞及鼠的NKT、γδT細(xì)胞亞群、激活的CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞亞群。有研究[3-6]表明，1型糖尿病的動物模型NOD鼠的胰島β細(xì)胞表達NKG2D的配體Rae-1，因此產(chǎn)生了表達NKG2D受體的自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞，大量浸潤在胰島中，并且NOD鼠體內(nèi)的CD4+NKG2D+T細(xì)胞是一群與正常小鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T不同的細(xì)胞亞群，它隨著NOD鼠T1D疾病病程的發(fā)展而變化[7]。在人類中，Rodacki等[8]報道同NOD小鼠類似，在炎癥等因素刺激下，NKG2D 配體可能誘導(dǎo)表達于胰島細(xì)胞，這將激活表達NKG2D 受體的CD4+T細(xì)胞及自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞等單個核細(xì)胞。

1　材料與方法

1.1實驗小鼠

NOD鼠，引種于南京大學(xué)模式動物研究所，飼養(yǎng)于揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實驗室SPF級鼠房。所有飼料、飲水以及墊料均經(jīng)過滅菌處理。所有實驗操作均在無菌超凈工作臺內(nèi)進行，操作都符合實驗動物福利。

1.2主要試劑

Anti-Mouse CD8a APC、Anti-Mouse CD4FITC、Anti-Mouse CD314(NKG2D) PE均購自美國eBioscience公司。BD FACSTMLysing Solution購自美國BD公司。

1.3NOD鼠動態(tài)血糖監(jiān)測

從10周齡至30周齡進行血糖監(jiān)測，1次/周。血糖檢測前更換新的墊料，并進行禁食6 h。當(dāng)連續(xù)2周的空腹血糖值高于13.9 mmol/dL時，則認(rèn)定該只NOD鼠發(fā)生糖尿病。

1.4流式檢測CD4+NKG2D+T、CD8+NKG2D+T細(xì)胞頻率

小鼠眼眶靜脈叢采血后，標(biāo)記相應(yīng)抗體，裂解紅細(xì)胞。PBS洗滌后，調(diào)整體系至200 μL用流式細(xì)胞儀進行檢測。

1.5CFSE標(biāo)記淋巴細(xì)胞增殖

利用磁珠分選試劑盒(購自德國美天妮公司)所得細(xì)胞數(shù)調(diào)整至0.5×106至10×107/mL。用1 mL 5%HIFCS充分混勻細(xì)胞，加入適量CFSE保證其終濃度應(yīng)在5 mmol/L。室溫避光孵育5 min后PBS洗滌細(xì)胞，重復(fù)2次。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism5進行統(tǒng)計，采用t檢驗或ANOV方差檢驗進行分析，當(dāng)P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率隨T1D疾病進程顯著上升

NOD鼠的血糖值隨著1型糖尿病的疾病發(fā)展逐漸升高，且在30周左右的發(fā)病率高達80%, 故分別在6、8～10、12～16、20、25、30周以及發(fā)病期，取NOD鼠外周血進行監(jiān)測。結(jié)果顯示，隨NOD鼠1型糖尿病疾病發(fā)展其外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞的頻率顯著上升。見圖1和表1。

表1　各周齡NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率　%

圖1 NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率變化典型流式圖

2.2IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠外周血中CD8+NKG2D+/CD8+T與CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞頻率均降低

本課題組前期已成功制備IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠模型，且實驗結(jié)果表明實驗組較對照組在降低NOD鼠血糖及發(fā)病率方面均有明顯效果。利用該小鼠模型，取同為35周齡的處理組及同周齡PBS對照組小鼠(已發(fā)病)的外周血，對其CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率進行分析。結(jié)果顯示與CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率變化趨勢相同，外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞頻率也降低。見表2和圖2。

表2　IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠外周血CD8+NKG2D+/CD8+T及CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞頻率　%

與PBS比較, *P<0.05。

圖2IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠外周血CD8+NKG2D+/CD8+T及CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞頻率典型流式圖

2.3NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T與CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率呈正相關(guān)

將上述所得的NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞頻率與相應(yīng)個體相同周齡的外周血CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率做線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞頻率與CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率成正向線性相關(guān)(P<0.0001,n=24)。見圖3。

圖3 NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T與CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率線性回歸

2.4NOD鼠中CD4+NKG2D+T細(xì)胞直接促進CD4+NKG2D-T細(xì)胞增殖但對CD8+T細(xì)胞增殖影響不大

為觀察NOD鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細(xì)胞對CD4+NKG2D-T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的作用方式，作者取20周齡尚未發(fā)病的NOD雌鼠脾臟，采用磁珠分選方式分別獲取CD4+NKG2D+T細(xì)胞、CD4+NKG2D-T細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞。將所得的CD4+NKG2D+T細(xì)胞分別與經(jīng)CFSE標(biāo)記的CD4+NKG2D-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)。4 d后檢測體系中的CD4+NKG2D-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞CFSE的熒光強度變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨的CD4+NKG2D-T細(xì)胞相比，加入CD4+NKG2D+T細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，其CD4+NKG2D-T細(xì)胞的增殖加快。而CD8+T的增殖則幾乎無變化。見圖4。

圖4 NOD鼠中CD4+NKG2D+T細(xì)胞直接促進CD4+NKG2D-T細(xì)胞增殖,但對CD8+T細(xì)胞增殖影響不大

3　討　論

NKG2D為NK細(xì)胞活化性受體，近來研究[9]發(fā)現(xiàn)亦可表達于其他多種免疫細(xì)胞。有研究[10]顯示，NOD鼠的胰島β細(xì)胞表達NKG2D的配體Rae-1, 并且其胰島中有大量CD8+NKG2D+T細(xì)胞浸潤。那么NOD鼠體內(nèi)的CD4+NKG2D+T、CD8+NKG2D+T細(xì)胞極有可能參與了其T1D的疾病進程。本研究表明，隨著NOD鼠T1D疾病發(fā)生發(fā)展，NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T、CD8+NKG2D+T細(xì)胞頻率均是逐漸上升的。本課題組前期成功制備的IGRP206-214特異性CTL清除的NOD模型鼠較普通NOD鼠在降低NOD鼠血糖及發(fā)病率方面均有明顯效果，并且CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞隨著模型鼠外周血CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率降低亦下降。這從另一方面證實了CD4+NKG2D+/CD4+T與CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞之間是存在關(guān)系的，且該種關(guān)系是與NOD鼠T1D相關(guān)的。

在小鼠體內(nèi), NKG2D僅僅表達在活化的CD8+T細(xì)胞表面[11], 而CD8+T細(xì)胞又為T1D的主要效應(yīng)細(xì)胞。將所得的NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞頻率與相應(yīng)個體同周齡的外周血CD8+NKG2D+/CD8+T細(xì)胞頻率做線性回歸分析，結(jié)果顯示，二者間呈正向線性相關(guān)。那么CD4+NKG2D+/CD4+T細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞的增殖是否起到促進作用呢？結(jié)果顯示CD4+NKG2D+T細(xì)胞可以直接促進CD4+NKG2D-T細(xì)胞增殖，但對CD8+T細(xì)胞增殖并無直接作用。所以作者推斷, NOD鼠體內(nèi)的CD4+NKG2D+T細(xì)胞可能是通過直接對CD4+NKG2D-T細(xì)胞作用從而對CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生作用[12-13]。這個想法在青少年肺炎中被得到了證實[14-15]。

綜上所述, NOD鼠外周血中的CD4+NKG2D+T、CD8+NKG2D+T細(xì)胞頻率隨著T1D疾病進程逐漸升高，二者之間呈正向線性關(guān)系。該群細(xì)胞可以直接促進CD4+NKG2D-T細(xì)胞增殖，但對CD8+T細(xì)胞增殖則無直接作用。

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WANG Yuhang, MA Minxuan, XU Yawen, LI Kai, PAN Xingyuan,QIAN Li, GONG Weijuan, JI Mingchun

(DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,TheMedicalCollege

ofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ObjectiveTo explore the relationship between CD4+NKG2D+T and CD8+T cells in NOD rats. MethodsThe frequency of CD4+NKG2D+T and CD8+NKG2D+T cells in peripheral blood of NOD rats in different weeks were dynamically monitored. By using IGRP206-214-SAP NOD rats, the frequencies of CD4+NKG2D+/CD4+T and CD8+NKG2D+/CD8+T cells in peripheral blood were analyzed. CD4+NKG2D+T cells was purified and CFSE CD4+NKG2D-T cells or CD8+T were co-cultured 4 days were marked. The CFSE fluorescence intensity change of CD4+NKG2D-T cells or CD8+T cells were detected. ResultsThe frequency of CD4+NKG2D+/CD4+T and CD8+NKG2D+/CD8+T cells in peripheral blood of female NOD rats during the development of type 1 diabetes disease process gradually increased, and they were positively correlated to the linear. In the NOD rats with IGRP206-214-SAP, the frequency of CD4+NKG2D+/CD4+T cells in peripheral blood was reduced by CD8+NKG2D+/CD8+T cells reduction. Compared with alone CD4+NKG2D-T cells, the proliferation of CD4+NKG2D-T cells was speeded up in cell culture system incubated with CD4+NKG2D+T. CD4+NKG2D+T cells is no direct effect on the CD8+T cell. ConclusionAn increased CD4+NKG2D+T cells subsets in NOD mice might have an effect on CD8+T cells through activation of CD4+NKG2D-T cells.

CD4+NKG2D+T cells; CD8+T cells; T1D; NOD

2016-01-21

國家自然科學(xué)基金(30771955)

季明春, E-mail: mcji@yzu.edu.cn

R 392.2

A

1672-2353(2016)19-005-04DOI: 10.7619/jcmp.201619002