楊 華，劉亞娜，郭德軍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

紅豆越橘釀酒優(yōu)良降酸酵母的篩選及分離鑒定

楊 華，劉亞娜，郭德軍*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

以紅豆越橘果汁為原料，在24 ℃的恒溫條件下自然發(fā)酵，從中篩選出一株優(yōu)良的降酸菌株，對其進行分離鑒定，并研究其降酸性能。結(jié)果表明，菌株BY-9降酸性能最好，適合對紅豆越橘果酒進行生物降酸處理。對菌株BY-9進行形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征鑒定以及內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）序列解析，鑒定出菌株BY-9為酵母屬中的二孢結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）。將菌株BY-9接入酒精發(fā)酵結(jié)束的紅豆越橘果酒中，發(fā)現(xiàn)其使紅豆越橘果酒總酸含量降低了12.26%。

紅豆越橘；降酸酵母；篩選；分離；鑒定

酵母菌種的好壞直接影響果酒的品質(zhì)，大部分營養(yǎng)豐富的漿果其酸度相對較高，以至于果酒釀成后依舊有較高的酸度，口感酸澀，嚴(yán)重影響果酒的品質(zhì)。近年來國內(nèi)外逐步興起對果酒降酸方法的探索性研究，現(xiàn)今用于果酒降酸的方法主要有3 種：物理降酸法、化學(xué)降酸法、生物降酸法［1］。物理降酸法，所需時間長，酸度降低的幅度低；化學(xué)降酸法雖然見效快，效果明顯，但是對果酒的品質(zhì)損害較大，且物理降酸法和化學(xué)降酸法，主要是使果酒中的酒石酸含量降低，而對蘋果酸的含量幾乎無影響［2］；生物降酸法因降酸效果明顯，對果酒品質(zhì)無損害，近年來成為國內(nèi)研究的熱點。生物降酸主要有2 種代謝途徑：蘋果酸乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）和蘋果酸酒精發(fā)酵（maloalcohol fermentation，MAF）。MLF降酸所要求的條件比較高，降酸能力有限；MAF降酸通常會有不良氣味生成，影響果酒品質(zhì)［3］。所以，近年來國內(nèi)外都在探索更完善的生物降酸方法，并積極篩選優(yōu)良的降酸菌種。研究發(fā)現(xiàn)，與果酒釀造相關(guān)的酵母涉及24 個屬120多個種，有許多非釀酒酵母可以比釀酒酵母產(chǎn)生更多的酯類物質(zhì)，增加果酒的香氣［4-5］。某些非釀酒酵母還具有良好的降酸功效。趙玉平等［6］篩選出一株能降解檸檬酸的畢赤酵母（Pichia sp.）Y1；Delcourt等［7］發(fā)現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）236對蘋果酸具有良好的降解作用；Corte-Real等［8］研究發(fā)現(xiàn)漢遜酵母（Hansenula anomala），在一定條件下對L-蘋果酸有一定降解作用。積極將非釀酒酵母利用到果酒發(fā)酵中，是未來果酒行業(yè)發(fā)展的趨勢［9-10］。

紅豆越橘果實是一種營養(yǎng)價值很高的天然野生漿果，主要產(chǎn)自我國的大興安嶺地區(qū)；富含多種具有生物活性的天然成分（如單寧、花色苷、黃酮、VC、VE等）；其具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗輻射、抗菌、明目、治療糖尿病等多種功效［11-15］。紅豆越橘漿果不僅有較高的營養(yǎng)價值，而且具有較高的經(jīng)濟價值［16-20］。我國的紅豆越橘大部分被用于鮮食，加工成果汁及果干，紅豆越橘資源沒有得到較好的開發(fā)利用。利用紅豆越橘釀造果酒是未來紅豆越橘產(chǎn)品開發(fā)的一個方向，但至今鮮見利用紅豆越橘釀酒的報道。紅豆越橘果酒不僅可以提高紅豆越橘的經(jīng)濟價值，豐富紅豆越橘系列產(chǎn)品，更是為消費者提供了一種具有較高保健價值的飲品。但紅豆越橘果汁酸度過大，導(dǎo)致釀造的紅豆越橘果酒口感酸澀，這是利用紅豆越橘釀酒過程中急需解決的問題。本實驗在自然發(fā)酵的紅豆越橘果酒中，篩選出一株具有優(yōu)良降酸性能的菌株BY-9，以期為紅豆越橘果酒的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

紅豆越橘漿果由大興安嶺超越野生漿果加工有限公司提供，含糖量為53.15 g/L，含酸量為10.82 g/L（以蘋果酸計），pH值為2.2；蔗糖購自大慶市九區(qū)批發(fā)市場。

硫酸銨、亞硫酸 生工生物工程（上海）股份有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Premix、ITS Forward primer（20 pmol/μL）、ITS Reverse Primer（20 pmol/μL） 上海江萊生物科技有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酵母菌鑒定生化管 上海江萊生物科技有限公司；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；振蕩器 上海高興儀器設(shè)備有限公司；722可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PCR擴增儀日本TaKaRa公司；核酸電泳儀 美國Advanced Biotech生物技術(shù)公司；電泳成像裝置 英國Amersham Pharmacia Biotech公司；DNA測序儀 美國Applied Biosystem公司。

1.3 方法

1.3.1 紅豆越橘果酒理化指標(biāo)的測定方法

有機酸定量測定：采用GB/T 5009.157—2003《食品中有機酸的測定》方法進行?？偹岷繙y定：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用試驗方法》電位滴定法。酒精體積分?jǐn)?shù)測定：采用GB/T 15038—2006中蒸餾比重法?？偺呛繙y定：采用GB/T 15038—2006中斐林試劑滴定法。

1.3.2 紅豆越橘果酒感官評定標(biāo)準(zhǔn)［21-22］

感官評定指標(biāo)參考《葡萄酒工業(yè)手冊》及GB/T 15038—2006，請10 位品評人員品嘗紅豆越橘果酒，并對色澤、香氣、口味、風(fēng)味進行打分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.3 紅豆越橘果汁的預(yù)處理

挑選果形完整，無破損的紅豆越橘漿果，進行破碎過濾處理。向得到的紅豆越橘果汁中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%～0.05%的硫酸銨，以保證酵母發(fā)酵有充足的氮源。并向果汁中添加0.80 mL/L的亞硫酸，放置于24 ℃的恒溫條件下自然發(fā)酵。以發(fā)酵過程中總酸降低較多的紅豆越橘酒醪為選育降酸菌株的菌源。取上述發(fā)酵液1 mL進行梯度稀釋，取適量稀釋梯度為10-3～10-4的發(fā)酵液均勻涂布于含體積分?jǐn)?shù)為9%乙醇的YPD固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36 h，至少經(jīng)過3 次劃線分離，直至純化。

1.3.4 降酸菌株的篩選

在含體積分?jǐn)?shù)為9%乙醇的YPD液體培養(yǎng)基里，添加5 g/L的蘋果酸，滅菌以后，接入上述分離純化的菌株，活菌濃度需達到109CFU/mL以上。接種量為3%，28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，以不接入菌株的培養(yǎng)液作空白對照，以蘋果酸含量的降低為指標(biāo)，篩選30 株具有明顯降酸效果的菌株。選取3 株降蘋果酸效果最好的菌株，接入酒精發(fā)酵結(jié)束后的紅豆越橘果酒中，28 ℃發(fā)酵3 d，以降酸能力和感官評定為指標(biāo)，選出1 株綜合評價最好的降酸菌株。

1.3.5 降酸菌株的形態(tài)學(xué)觀察

將分離純化得到的具有明顯降酸性能的菌株，通過劃線的方法接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36 h，對其細胞形態(tài)和菌落特征進行觀察。

1.3.6 降酸菌株的生理生化實驗

參照朱佳娜等［23］的方法進行降酸菌株的糖發(fā)酵、同化碳源、同化氮源實驗。將酵母菌接種到發(fā)酵糖類、同化碳源、同化氮源、分解尿素的酵母菌鑒定生化管中，觀察其產(chǎn)氣及生長反應(yīng)情況。

1.3.7 降酸菌株的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）序列解析鑒定

1.3.7.1 降酸菌株基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取

挑取菌體于50 μL PCR緩沖液（NO. 9164）中變性后離心，取上清液，得到菌株的基因組DNA。

1.3.7.2 ITS區(qū)的PCR擴增

以提取到的菌株基因組DNA為模板，使用ITS區(qū)的通用引物：ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），擴增引物的ITS區(qū)基因。

PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性條件：94 ℃，5 min；變性條件：94 ℃，30 s；退火條件55 ℃，30 s；延伸條件：72 ℃，1 min；體系運行循環(huán)30 次，72 ℃延伸5 min，在4 ℃條件下進行保存。PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5.0 μL、PCR premix 1 μL、ITS up primer（20 pmol/μL）0.5 μL、ITS down primer（20 pmol/μL）0.5 μL、ddH2O 23 μL，共50 μL。

1.3.7.3 ITS區(qū)的測定與分析

對得到的PCR擴增產(chǎn)物，進行瓊脂糖凝膠電泳處理，將含有目的片段的產(chǎn)物送到寶生物工程（大連）有限公司進行測序。將測得的ITS區(qū)序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）進行BLAST分析，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中搜索同源序列，并進行比較分析，以鑒定菌株的種屬。并利用MEGA Version 5軟件構(gòu)建菌株與相關(guān)種ITS區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.8 降酸菌株生長特性及耐受性能的確定［24］

1.3.8.1 降酸菌株最適生長溫度的確定

將降酸菌株以3%的接種量接入100 mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，分別在22、24、26、28、30、32 ℃條件下，培養(yǎng)24 h。通過測定其在660 nm波長處的吸光度確定降酸菌株的最適生長溫度。

1.3.8.2 降酸菌株最適生長pH值的確定

將降酸菌株以3%的接種量接入100 mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)整到2、3、4、5、6、7，在24 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)24 h。通過測定其在660 nm波長處的吸光度確定降酸菌株的最適生長pH值。

1.3.8.3 降酸菌株最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的確定

將降酸菌株以3%的接種量接入100 mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，在24 ℃恒溫水浴振蕩器中，分別調(diào)節(jié)振蕩器的轉(zhuǎn)速為120、140、160、180、200、220 r/min，培養(yǎng)24 h。通過測定其在660 nm波長處的吸光度確定降酸菌株的最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

1.3.8.4 降酸菌株酒精耐受性的測定

將降酸菌株以3%的接種量接入酒精體積分?jǐn)?shù)分別為8%、11%、14%、17%、20%、23%的100 mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，24 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h。通過測定其在660 nm波長處的吸光度確定降酸菌株的酒精耐受性。

1.3.8.5 降酸菌株滲透脅迫耐受性的測定

將活菌數(shù)量達到109CFU/mL以上的降酸菌株，以3%的接種量接入KCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為11%、12%、13%、14%、15%、16%的100 mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，24 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h。通過測定其在660 nm波長處的吸光度確定降酸菌株的滲透脅迫耐受性。

1.3.8.6 降酸菌株SO2耐受性的測定

用亞硫酸調(diào)節(jié)YPD液體培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中SO2質(zhì)量濃度分別達到100、150、200、250、300、350 mg/L。將降酸菌株以3%的接種量接入100 mL不同SO2含量的YPD液體培養(yǎng)基，24 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h。通過測定其在660 nm波長處的吸光度確定降酸菌株的SO2耐受性。

2 結(jié)果與分析

2.1 降酸菌株的篩選

選取30 株降蘋果酸效果較好的菌株，將其編號為BY-1～BY-30［24］，降蘋果酸效果最好的菌株編號分別為BY-7、BY-9、BY-21。將這3 株菌分別接入酒精發(fā)酵結(jié)束后，酒精體積分?jǐn)?shù)為9.6%，總酸含量為10.1 g/L（以蘋果酸計）的紅豆越橘果酒中，28 ℃發(fā)酵4 d，以降酸能力和感官評定為指標(biāo)，評價結(jié)果如表2所示。

由表2可知，與菌株BY-7和BY-21相比，接入菌株BY-9后的紅豆越橘果酒，總酸含量較低，與沒有進行降酸處理的紅豆越橘果酒相比，菌株BY-9可使紅豆越橘果酒的總酸降低12.87%，酒精體積分?jǐn)?shù)有微量升高，殘?zhí)呛康停泄僭u定得分最高，色澤及口感最佳。所以綜合考慮，選擇菌株BY-9，作為紅豆越橘果酒酒精發(fā)酵結(jié)束后優(yōu)良的降酸菌株。

2.2 菌株BY-9的形態(tài)學(xué)特征

對菌株BY-9進行形態(tài)學(xué)觀察其細胞和菌落形態(tài)，結(jié)果見圖1。細胞形態(tài)為圓形或橢圓形細胞，不透明。菌落形態(tài)光滑濕潤，突起，邊緣整齊，質(zhì)地松軟黏稠，呈乳白色。菌株接入YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，培養(yǎng)基變混濁，4 ℃條件下放置一段時間后，形成較厚實的白色沉淀。

2.3 菌株BY-9的生理生化實驗結(jié)果

由表3可知，菌株BY-9能利用葡萄糖，而不能利用半乳糖、蔗糖、麥芽糖等糖源，這也說明利用菌株BY-9在紅豆越橘果酒酒精發(fā)酵結(jié)束后進行降酸，菌株BY-9不會與釀酒酵母競爭利用蔗糖，不影響發(fā)酵進程。通過實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株BY-9能同化的碳源：丙三醇、核糖醇、甘露醇，而不能同化淀粉、D-木糖、L-阿拉伯糖等碳源。菌株BY-9能同化的氮源有硫酸銨、乙胺，不能同化硝酸鹽及尿素。

2.4 菌株BY-9的ITS的PCR擴增結(jié)果

由圖2可知，對純種菌株BY-9的基因組DNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果后，菌株BY-9 DNA的片段長度大約為800～900 bp。

2.5 菌株BY-9的ITS序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

對菌株BY-9的ITS序列進行同源性分析，以確定菌株BY-9類型。將菌株BY-9的ITS序列輸入GenBank，利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST軟件分析菌株BY-9與已發(fā)現(xiàn)菌株的相似度，并進行同源性比較，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果表明菌株BY-9與結(jié)合酵母屬菌株有較好的同源性。結(jié)合菌株BY-9的形態(tài)學(xué)特征和生理生化實驗結(jié)果，確定其為二孢結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）。

2.6 菌株BY-9生長特性及耐受性能

由圖4菌株BY-9生長特性的測定結(jié)果可得，菌株BY-9的最適生長溫度為30 ℃，最適生長pH值為5.0，最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180 r/min。

根據(jù)菌株BY-9耐受性的測定結(jié)果（圖5），可得菌株BY-9對酒精的耐受體積分?jǐn)?shù)為20%，然而果酒的體積分?jǐn)?shù)一般不會高于20%，所以用菌株BY-9來降低果酒酸度，菌株的活性不會受到酒精的抑制，效果不受影響；菌株BY-9對于KCl的耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%，耐滲透脅迫性較好；其對于SO2的耐受質(zhì)量濃度是300 mg/L，相對于其他菌株［25］，菌株BY-9不但降酸效果好，對SO2的耐受性也比較強，果酒釀造的SO2添加量在140 mg/L左右，所以釀造過程中添加SO2，不會對菌株BY-9的活性起到抑制作用。

3 結(jié) 論

本實驗篩選出一株對紅豆越橘果酒具有明顯降酸效果的酵母菌，通過形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)實驗對其種屬進行鑒定，確定其為二孢結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）。該菌適合用于紅豆越橘果酒酒精發(fā)酵結(jié)束后的降酸，因為它不能利用蔗糖，不會與釀酒酵母競爭利用蔗糖，不影響發(fā)酵進程，可以使紅豆越橘果酒的總酸含量降低12.26%。降酸酵母BY-9的最適生長溫度為30 ℃、pH值為5.0、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min，對酒精的耐受體積分?jǐn)?shù)為20%，對于KCl的滲透脅迫耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%，對SO2耐受質(zhì)量濃度為300 mg/L。降酸酵母BY-9對于紅豆越橘果酒有良好的降酸作用，豐富了用于果酒降酸的微生物種類，而降酸酵母BY-9的詳細降酸機理，更是值得進一步研究的內(nèi)容。

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［25］ 李箏， 韓北忠. 優(yōu)良釀酒酵母菌的發(fā)酵性能研究［J］. 中國釀造， 2008，27（10）： 10-12. DOI：10.3969/j.issn.0254-5071.2008.10.003.

Screening， Isolation and Identification of Acid-Degrading Yeast from Vaccinium vitis-idaea Wine

YANG Hua， LIU Yana， GUO Dejun*

（School of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

A yeast strain with high acid-degrading ability from Vaccinium vitis-idaea juice fermented in a a thermostatically controlled incubator at 24 ℃ was isolated and identified. Its acid degradation capacity was investigated. The results indicated that strain BY-9， which had the highest acid-degrading capacity， was found to be the most suitable for reducing acidity of Vaccinium vitis-idaea wine. Based on morphological and physiological characterization， and internally transcribed spacer （ITS） analysis， strain BY-9 was identified as Zygosaccharomyces bisporus. The total acid content of Vaccinium vitis-idaea wine was reduced by 12.26% when BY-9 was inoculated after alcoholic fermentation.

Vaccinium vitis-idaea； acid-degrading yeast； selection； isolation； identification

10.7506/spkx1002-6630-201609033

Q815

A

1002-6630（2016）09-0175-06

楊華， 劉亞娜， 郭德軍. 紅豆越橘釀酒優(yōu)良降酸酵母的篩選及分離鑒定［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 175-180. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609033. http：//www.spkx.net.cn

YANG Hua， LIU Yana， GUO Dejun. Screening， isolation and identification of acid-degrading yeast from Vaccinium vitisidaea wine［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 175-180. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609033. http：//www.spkx.net.cn

2015-07-02

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目（YJSCX2014-Y45）；黑龍江省農(nóng)墾總局科學(xué)技術(shù)開發(fā)課題（HNK13KF-15-01）

楊華（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：1157836297@qq.com

*通信作者：郭德軍（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：187013609@qq.com