朱學(xué)伸，黃雪方，魯小訊，王 艷，趙凱斌，徐 銘，王仁雷*

（江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇省生物功能分子重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210013）

結(jié)合低場核磁共振分析反復(fù)凍融處理對(duì)肉雞不同部位肌肉品質(zhì)的影響

朱學(xué)伸，黃雪方，魯小訊，王 艷，趙凱斌，徐 銘，王仁雷*

（江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇省生物功能分子重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210013）

利用低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)研究反復(fù)凍融處理對(duì)肉雞不同部位肌肉品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，反復(fù)凍融期間pH值變化不顯著（P＞0.05）。隨著凍融次數(shù)的增加，肉雞胸肉和腿肉解凍汁液損失顯著下降（P＜0.05），硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（thiobabituric acid reactive substance，TBARS）值顯著增大，總蛋白溶解度以及肌原纖維小片化凍融初期呈現(xiàn)上升趨勢，總水分含量均逐漸降低。低場核磁共振T2弛豫時(shí)間分析顯示，其自由水占比顯著下降（P＜0.05）。以上結(jié)果說明反復(fù)凍融使解凍汁液損失伴隨自由水比例顯著下降而逐步降低，由于肌肉pH值保持穩(wěn)定，推測反復(fù)凍融過程中反復(fù)形成的冰晶對(duì)肌肉微觀結(jié)構(gòu)的破壞，尤其對(duì)肌原纖維蛋白質(zhì)溶解度的影響起到一定的作用。

低場核磁共振；反復(fù)凍融；肉雞；肌肉品質(zhì)

現(xiàn)代肉雞生長周期短，產(chǎn)肉率高，但食用品質(zhì)有所下降。而且市場上基本上以大量的冰鮮、冷凍雞肉為主，客觀上無法避免運(yùn)輸、貯藏和銷售過程造成現(xiàn)凍融過程，繼而導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)特征的變化以及保水性變差［1-2］。低場核磁共振技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于肉品持水性的研究，通過檢測肉品中1H質(zhì)子的弛豫時(shí)間來獲得肉品中的水分分布的信息。弛豫時(shí)間越短，表示水與底物結(jié)合越緊密，否則表明水分越自由，所以可以用弛豫時(shí)間間接表明水分的自由度，從而分析凍融對(duì)肌肉品質(zhì)的影響［3］。李玫等［4］利用低場核磁共振分析了雞胸肉在不同凍融循環(huán)和凍融時(shí)間下的品質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)凍融循環(huán)及凍藏時(shí)間的延長會(huì)顯著影響雞胸肉色澤及持水力等食用品質(zhì)，其中T21與亮度值及凍融次數(shù)間顯著相關(guān)且與解凍損失、心損失等持水性指標(biāo)高度負(fù)相關(guān)，其結(jié)果與韓敏義等［5］報(bào)道的隨著凍融次數(shù)的增加肉雞肌肉解凍損失和蒸煮損失均顯著增加不一致。根據(jù)李金平等［6］報(bào)道的隨著反復(fù)凍融次數(shù)的增加牛外脊肉解凍時(shí)間縮短，解凍損失逐漸增大；而戚軍等［7］研究得出隨著凍融次數(shù)增加，羊肉解凍損失逐漸增加，但蒸煮損失逐步降低，可以看出以上報(bào)道結(jié)果存在的差異。目前，結(jié)合核磁共振研究反復(fù)凍融對(duì)蛋白特性和保水性的影響研究報(bào)道較少，從工廠到顧客的消費(fèi)過程中凍融次數(shù)一般在數(shù)次內(nèi)，因此十分有必要從水分狀態(tài)和肌原纖維蛋白特性角度，分析數(shù)次反復(fù)凍融對(duì)肉雞不同部位肌肉品質(zhì)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三黃肉雞（12 周齡，6 只）宰后4 h分別分離出雞胸肉及腿肉。冷凍條件：溫度為-20 ℃，24 h；解凍條件：溫度為5 ℃，24 h。分別于反復(fù)凍融0（凍融前）、1、2、3 次后取樣用于指標(biāo)分析。

氯化鉀、磷酸鉀、氯化鎂、三氯乙酸（均為分析純）上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碘乙酸、硫代巴比妥酸（thiobabituric acid，TBA）、乙二胺四乙酸、疊氮化鈉 南京生興生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-FL270低溫冰箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；KA62NV20TI冰箱 中國海爾集團(tuán)；PB10 pH計(jì)德國Satorious公司；5804R高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；FSH-2高速勻漿器 江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；T6紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Micro MR核磁共振分析儀 上海紐邁電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值測定

肌肉pH值是通過測定肉樣提取物的pH值得到。提取物處理方法：1 g肉樣在10 mL的5 mmol/L碘乙酸溶液中用剪刀剪碎后勻漿［2］。校正及測定均在室溫下進(jìn)行。

1.3.2 解凍汁液損失測定

肌肉準(zhǔn)確稱質(zhì)量（m1）后密封在自封袋中，-20 ℃凍結(jié)24 h之后于5 ℃條件下解凍并保存24 h，取出擦干并準(zhǔn)確稱質(zhì)量（m2）。試樣解凍汁液損失按如下公式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 水分含量的測定

按照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》的直接干燥法，干燥溫度為103 ℃。測得容器加試樣的質(zhì)量m1，容器加干燥后試樣的質(zhì)量m2，容器質(zhì)量m3。容器為稱量瓶，事先進(jìn)行過干燥處理。試樣中水分含量按如下公式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 硫代巴比妥酸反應(yīng)物值（thiobabituric acid reactive substance，TBARS）測定

參照黃鴻兵等［3］的方法，略有修改。取2 g肉樣，加入5 mL 25%三氯乙酸和4 mL蒸餾水，高速勻漿1 min之后1 000×g離心20 min，上清液通過濾紙過濾；取2 mL濾液加2 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸沸水浴20 min，流水冷卻5 min，于532 nm波長處測定溶液吸光度。其中空白樣為1 mL三氯乙酸+1 mL蒸餾水+2 mL 0.02 mol/L TBA。TBARS以丙二醛含量計(jì)算，計(jì)算公式如下。

TBARS/（mg/kg）=A532nm×9.48 （3）1.3.5 肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）測定

準(zhǔn)確稱取2 g肉樣，加入20 mL 4 ℃的MFI抽提緩沖液（100 mmol/L 氯化鉀、20 mmol/L 磷酸鉀、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L 氯化鎂、1 mmol/L疊氮化鈉，pH 7.0），用手術(shù)剪刀剪碎后勻漿60 s；勻漿液在4 ℃條件下離心15 min（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），棄去上清保留沉淀。沉淀中加入20 mL 冰冷的MFI緩沖液后勻漿得到懸浮液，之后通過4 層紗布過濾，濾液即為肌原纖維提取液。使用雙縮脲法測其蛋白質(zhì)濃度，然后用MFI抽提緩沖液把肌原纖維提取液蛋白質(zhì)量濃度調(diào)為0.5 mg/mL，測定該溶液在540 nm波長處吸光度。MFI按下式計(jì)算［10］。

參照J(rèn)oo等［4］的方法進(jìn)行總蛋白和肌漿蛋白溶解度測定分析。準(zhǔn)確稱取1.0 g肉樣加10 mL 4 ℃預(yù)冷提取液（1.1 mol/L KI、0.1 mol/L K3PO4，pH 7.2），剪碎后勻漿1 min，4 ℃搖動(dòng)抽提16 h，于4 ℃、4 500 r/min離心20 min，上清液用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度即為總蛋白溶解度（mg/g）；之后準(zhǔn)確稱取1.0 g肉樣加10 mL 4 ℃預(yù)冷提取液（0.025 mol/L K3PO4，pH 7.2），剪碎后勻漿1 min，4 ℃搖動(dòng)抽提16 h，于4 ℃、4 500 r/min離心20 min，上清液用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度，得到肌漿蛋白溶解度（mg/g）。

1.3.7 低電場核磁共振分析

低電場核磁共振分析條件主要是參照戚軍等［7］的測試方法進(jìn)行。具體測試條件如下：質(zhì)子共振頻率為22 MHz，測量溫度為32 ℃。準(zhǔn)確稱取2.0 g肉樣放入核磁管后放入分析儀中。自旋-自旋弛豫時(shí)間T2用CPMG序列進(jìn)行測量。所使用的參數(shù)為：τ值（90b脈沖和180b脈沖之間的時(shí)間）為200 μs。NMR弛豫測量得到的圖為自由誘導(dǎo)指數(shù)衰減曲線，其數(shù)學(xué)模型為：

式中：A（t）表示衰減到時(shí)間t時(shí)的幅值；A0為平衡時(shí)的幅值；T2i為第i個(gè)組分的自旋-自旋弛豫時(shí)間。CMPG指數(shù)衰減曲線用儀器自帶的MultiExp InvAnalysis軟件進(jìn)行反演，得到T2值。該軟件使用綜合迭代算法，結(jié)果為離散型與連續(xù)型相結(jié)合的T2譜。反演得到弛豫幅值、峰值及每個(gè)峰所占的面積分?jǐn)?shù)、起始時(shí)間和結(jié)束時(shí)間等。采用弛豫圖每個(gè)組分峰值對(duì)應(yīng)的時(shí)間作為T2。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件。每個(gè)指標(biāo)測定重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凍融次數(shù)對(duì)肌肉品質(zhì)的影響

許多酒店企業(yè)已逐漸意識(shí)到知識(shí)型員工在酒店戰(zhàn)略與經(jīng)營決策中的重要作用，有的酒店發(fā)現(xiàn)問題后不惜重金聘用海外高級(jí)人才。但是目前在國內(nèi)仍有許多中規(guī)中矩不愿求新的酒店的激勵(lì)理念還比較落后，與國外發(fā)達(dá)國家酒店和國內(nèi)的外資酒店相比，存在一定的誤區(qū)和問題。

2.1.1 pH值

由圖1可知，雞胸肉反復(fù)凍融0、1、2、3 次時(shí)的 pH 值沒有顯著變化，其pH值維持在5.79左右；對(duì)于雞腿肉來說，凍融0、1、2、3 次pH值上下波動(dòng)，但不顯著，其pH值維持在6.33左右。在整個(gè)凍融過程中，雞腿肉的pH值都顯著高于雞胸肉（P＜0.05），這是由于肌肉類型與組成不同。胸肉主要由白肌纖維組成，富含糖原，而腿肉主要由紅肌纖維組成，主要含有大量有氧代謝酶。本次實(shí)驗(yàn)中反復(fù)凍融過程中，宰后4 h肌肉已經(jīng)接近極限pH值，糖酵解過程受到反復(fù)凍融影響較?。?2］。

2.1.2 解凍汁液損失

由圖2可知，隨著凍融次數(shù)增加，雞胸肉解凍汁液損失逐漸下降，差異顯著（P＜0.05），雞腿肉解凍汁液損失也表現(xiàn)為下降，但后期差異不顯著。凍融1 次后胸肉解凍汁液損失顯著高于腿肉，之后與腿肉間差異不顯著。該結(jié)果與冉俊等［13］報(bào)道的豬肉15 次的凍融過程中解凍汁液損失變化趨勢不同，由此可以看出凍融次數(shù)的顯著增加一定程度上也可影響解凍損失的變化趨勢，反復(fù)凍融導(dǎo)致肉品水分大量流失，凍融次數(shù)越多，水分累積損失越大。李媛惠等［14］研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融同樣對(duì)蒸煮損失也有顯著影響，雞骨肉相連凍融1 次前后蒸煮損失相比差異顯著。與凍融3 次相比，凍融4、5 次后蒸煮損失率顯著下降；凍融過程中，肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到一定破壞和蛋白質(zhì)特性發(fā)生變化，可能是導(dǎo)致保水能力呈現(xiàn)下降趨勢的主要原因。

2.1.3 水分含量

由圖3可知，隨著凍融次數(shù)增加，胸肉中水分含量逐步減少，差異顯著（P＜0.05）；而腿肉在凍融處理后水分含量整體呈現(xiàn)下降趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融第1次前后水分含量變化較大。腿肉與肌肉變化略微不同原因可能跟肌肉中結(jié)締組織含量有關(guān)，而腿肉結(jié)締組織含量顯著高于胸肉，一定程度上可以維持肌肉的保水性。肉品中水分含量在74%左右，是反映肉品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。肉品中水分含量的減少一定程度上反映了肉品品質(zhì)在反復(fù)凍融過程中降低［15］。

2.1.4 TBARS值

由圖4可知，隨著凍融次數(shù)增加，雞胸肉和腿肉中TBARS值均顯著增加（P＜0.05），說明肌肉中脂肪氧化加速。肉品中的脂肪氧化大多發(fā)生在細(xì)胞膜水平上，反復(fù)凍融過程中，細(xì)胞中冰晶多次重新形成，會(huì)損壞肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，使得肌纖維細(xì)胞喪失完整性，進(jìn)而加速了脂肪氧化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有研究認(rèn)為TBARS值最主要的影響因素是冷凍時(shí)間，其值隨著冷凍貯藏時(shí)間或反復(fù)凍融次數(shù)的增加而變大［9］的結(jié)論一致。

2.1.5 肌原纖維小片化指數(shù)

由圖5可知，雞胸肉MFI的值呈先上升后下降的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。腿肉MFI在第1次凍融顯著上升，之后差異不顯著（P＞0.05）。胸肉MFI顯著高于腿肉。反復(fù)凍融過程中，隨著凍融次數(shù)的增加，MFI的變化趨勢說明肌原纖維的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化，推測造成以上變化的部分原因跟凍融過程中反復(fù)形成的冰晶對(duì)肌絲微觀結(jié)構(gòu)破壞作用有關(guān)［16］。肌原纖維結(jié)構(gòu)小片化一定程度上會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度的提升，宰后肌肉微觀結(jié)構(gòu)的變化同樣受到凋亡酶、組織蛋白酶等一系列組織內(nèi)源酶的影響，以上過程一定程度也影響了MFI變化趨勢［17］。

2.1.6 蛋白質(zhì)溶解度

反復(fù)凍融過程中，隨著凍融次數(shù)的增加，肌漿蛋白溶解度在3 次反復(fù)凍融過程中對(duì)比變化不顯著（P＞0.05）（圖6A），但均呈現(xiàn)一定的下降趨勢，而該過程中胸肉肌漿蛋白溶解度一直顯著高于腿肉肌漿蛋白溶解度（P＜0.05）；隨著凍融次數(shù)的增加肉雞肌肉總蛋白溶解度逐漸升高（圖6B），尤其肉雞腿肉總蛋白溶解度變化尤為顯著（P＜0.05），肉雞胸肉和腿肉間總蛋白溶解度差異不顯著。反復(fù)凍融一定程度上可以提高肌肉蛋白質(zhì)溶解度，主要是由于冰晶的反復(fù)形成會(huì)破壞肌細(xì)胞完整結(jié)構(gòu)，更利于提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)［18］，2.1.5節(jié)中肌原纖維小片化的變化一定程度上可能也說明了肌絲微觀結(jié)構(gòu)被破壞。另外本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肌漿蛋白變化并不顯著，其主要原因可能在于反復(fù)凍融第1次后肌漿蛋白便伴隨大量解凍汁液流出，另外凍結(jié)過程中蛋白質(zhì)分子由于發(fā)生聚集而變性也可能是部分的原因［16］。

2.2 低場核磁共振分析水分狀態(tài)

2.2.1 水分組成變化

由圖7可知，NMR T2弛豫測量結(jié)果顯示有3 個(gè)峰，分別代表了肌肉中的3 種主要組分的水。各個(gè)峰面積占總峰面積的比例可以相應(yīng)地代表結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水含量［19］。峰1、2、3分別用T2b、T21、T22表示，依次代表結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水。由表1可知，隨著反復(fù)凍融的進(jìn)行，不易流動(dòng)水含量顯著上升（P＜0.05）；自由水含量顯著下降（P＜0.05）；結(jié)合水含量幾乎無變化。以上研究結(jié)果與李媛惠等［14］報(bào)道的結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示凍融過程中結(jié)合水含量穩(wěn)定不變，雞胸肉維持在0.03%，腿肉保持在0.02%。結(jié)合水是與蛋白質(zhì)分子表面緊密結(jié)合的水分子層，不易解離和蒸發(fā)，不易受肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及電荷變化的影響，甚至嚴(yán)重的外力條件也不能改變結(jié)合狀態(tài)。結(jié)合水對(duì)肌肉的保水性沒有影響。分別凍融1、2、3 次后，雞胸肉和腿肉中自由水比例呈顯著下降趨勢（P＜0.05），自由水存在于肌細(xì)胞外間隙中，靠毛細(xì)管力作用存在于肌肉中［21］。反復(fù)凍融過程中，由于肌細(xì)胞受到冰晶的物理性破壞，自由水以解凍汁液的形式流失，從而其含量顯著下降。該規(guī)律與戚軍等［7］在羊肉凍融實(shí)驗(yàn)中得到結(jié)果一致。

2.2.2 水分自由度

表2顯示了不同凍融次數(shù)雞肉中水分橫向弛豫時(shí)間的T2變化，可以看出胸肉和腿肉T2b（結(jié)合水）在反復(fù)凍融過程中無明顯差異。而胸肉和腿肉中T21（不易流動(dòng)水）自凍融1、2 次后減小，胸肉差異不顯著而腿肉差異顯著。T21隨凍融次數(shù)增加而下降可能是由于凍融使肌原纖維蛋白分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，即高級(jí)構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響其與水分子的結(jié)合能力，另外與解凍時(shí)汁液的流失有關(guān)［22］，也說明凍融后T21對(duì)應(yīng)水分的移動(dòng)性即自由度下降了，因?yàn)門21時(shí)間越短，表示水與底物結(jié)合越緊密。T22（自由水）在胸肉和腿肉中變化過程一致：呈現(xiàn)為先上升但后下降，說明此部分的水分移動(dòng)性存在波動(dòng)，最終變小，以上結(jié)果與Bertram等［23］的部分研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

反復(fù)凍融中雞肉解凍汁液損失逐步降低，同時(shí)伴隨著肌肉中自由水比例的下降。需要指出的是，該過程中反復(fù)凍融對(duì)肌肉pH值影響不大，但由于肌肉中冰晶反復(fù)產(chǎn)生對(duì)肌絲微觀結(jié)構(gòu)，尤其可能對(duì)肌原纖維蛋白分子空間構(gòu)象變化有影響，最終一定程度上影響肌肉保水性。反復(fù)凍融過程中的肌肉蛋白質(zhì)具體的變化情況仍有待于進(jìn)一步詳細(xì)的研究。

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Effect of Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Broiler Breast and Thigh Muscles as Evaluated by Low-Field Nuclear Magnetic Resonance

ZHU Xueshen， HUANG Xuefang， LU Xiaoxun， WANG Yan， ZHAO Kaibin， XU Ming， WANG Renlei*
（Jiangsu Key Laboratory of Biofunctional Molecule， School of Life Science and Chemistry， Jiangsu Second Normal University，Nanjing 210013， China）

In the present study， the effect of freeze-thaw cycles on the quality of broiler breast and thigh muscles was explored by low-field nuclear magnetic resonance （LF-NMR）. Results showed that thaw exudate loss of chicken breast and thigh muscles significantly declined with increasing number of freeze-thaw cycles （P < 0.05）， whereas no significant change in pH was observed （P > 0.05）. The thiobabituric acid reactive substance （TBARS） value of chicken breast and thigh muscles rose significantly， and total protein solubility and myofibrillar fragmentation index （MFI） showed an increasing trend initially. However， total water content gradually fell. At the same time， the proportion of free water as indicated by LF-NMR T2relaxation times significantly dropped. These above results suggested that freeze-thaw cycles resulted in a reduced proportion of free water and consequently enhanced loss of thaw exudate in chicken muscles. pH maintenance during freezethaw cycles confirmed that ice crystal formation caused damage to the microstructure of muscles， especially having a certain influence on the solubility of myofibrillar protein.

low-field nuclear magnetic resonance （LF-NMR）； freeze-thaw cycles； broiler； meat quality

10.7506/spkx1002-6630-201609005

TS251.1

A

1002-6630（2016）09-0023-06

朱學(xué)伸， 黃雪方， 魯小訊， 等. 結(jié)合低場核磁共振分析反復(fù)凍融處理對(duì)肉雞不同部位肌肉品質(zhì)的影響［J］. 食品科學(xué)，2016， 37（9）： 23-28. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609005. http：//www.spkx.net.cn

ZHU Xueshen， HUANG Xuefang， LU Xiaoxun， et al. Effect of freeze-thaw cycles on the quality of broiler breast and thigh muscles as evaluated by low-field nuclear magnetic resonance［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 23-28. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609005. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-15

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301507）；江蘇省高校自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（13KJB550006）

朱學(xué)伸（1984—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：xueshen_zhu@163.com

*通信作者：王仁雷（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锕δ芊肿印-mail：wrl3501988@163.com