劉鑫龍王立暉 湯衛(wèi)華 潘志恒 程秀瑋 孫勇民

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350）

固定化半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究

劉鑫龍*王立暉 湯衛(wèi)華 潘志恒 程秀瑋 孫勇民

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350）

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，是人體腸道中有益菌群極好的營(yíng)養(yǎng)源和有效的增殖因子，對(duì)平衡腸道中的有益菌群，保障人體的發(fā)育及提高免疫力具有巨大的價(jià)值。同時(shí)，由于低聚牛乳糖不被人體胃酸、胃酶降解，難以被小腸吸收，又具有糖類(lèi)的共有屬性和較好的口感，因而被廣泛用于制作高血脂、肥胖、糖尿病人的無(wú)熱量食品，成為提供甜味的主要原料之一。此外，低聚半乳糖同蛋白質(zhì)共熱會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，可以用于特殊性質(zhì)的食品如面包、糕點(diǎn)等的加工，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

目前，低聚半乳糖的的合成主要有3種方式：天然高聚物的水解（酸法和酶法），糖苷酶的催化合成，化學(xué)合成法?；瘜W(xué)合成法目前只在實(shí)驗(yàn)室研究中使用，不具有工業(yè)化前景。酸法降解高聚糖雖然可以獲得較高產(chǎn)率的半乳糖，但因?yàn)楦狈磻?yīng)較多，使產(chǎn)物提純工序的難度加大，應(yīng)用受到了很大的限制。因此在低聚半乳糖工業(yè)化的生產(chǎn)中主要采用酶法合成，尤以微生物來(lái)源的β-半乳糖苷酶為主。盡管直接以β-半乳糖苷酶催化合成，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率較高，但游離酶因?yàn)橹荒茉谒芤褐惺褂?，穩(wěn)定性差，不利于連續(xù)反應(yīng)，回收困難，重復(fù)利用性差等原因，限制了其廣泛應(yīng)用，而將酶固定化是解決這些問(wèn)題的有效方法之一。本課題組采用殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑固定化β-半乳糖苷酶，酶的活力回收率達(dá)70.5%。同時(shí)，固定化酶具有良好的儲(chǔ)存和操作穩(wěn)定性，在儲(chǔ)存4周后，保持88.5%的酶活力；重復(fù)操作5次后，保持67.3%的酶活力，具有良好的應(yīng)用前景。本文將在此基礎(chǔ)上研究以β-半乳糖苷酶作為催化劑，催化合成低聚半乳糖過(guò)程中各反應(yīng)因素對(duì)產(chǎn)物得率的影響，包括底物濃度、酶用量、溫度、pH、離子添加劑等，篩選最優(yōu)反應(yīng)條件。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

β-半乳糖苷酶，來(lái)源于米曲霉，13.4 U/mg，Sigma公司；殼聚糖，脫乙酰度≥90%，深圳市中發(fā)源生物科技有限公司；乳糖，化學(xué)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；戊二醛，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

UV-5500（PC）紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；HNY2012C恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱，上海百典儀器有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋，嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1殼聚糖-戊二醛固定化酶的制備

用乙酸溶液配制體積濃度4%的殼聚糖（分子量為3×105）溶液，真空脫泡后逐滴滴入到4 mol/L的NaOH與甲醇的混合液（體積比為3∶1）中，過(guò)濾并用蒸餾水洗滌和磷酸緩沖液浸泡12 h，晾干得到殼聚糖微球。將其加入到戊二醛（10 g/L）中，常溫振蕩反應(yīng)1 h后，過(guò)濾并用磷酸緩沖液洗滌。在4 ℃條件下，將洗滌后的殼聚糖微球加入到β-半乳糖苷酶溶液反應(yīng)12 h。離心分離并用磷酸緩沖液洗滌沉淀，冷凍干燥后即可得到固定化的半乳糖苷酶。

1.2.2低聚半乳糖的合成

用pH7.5的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液配制一定濃度的乳糖溶液20 mL，置于50 mL 錐形瓶中，加入一定量的β-半乳糖苷酶酶液，置于一定溫度的恒溫水浴搖床中160 r/min反應(yīng)一段時(shí)間。

1.2.3分析方法

取250 μL樣品稀釋40 倍，用孔徑0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)液相色譜檢測(cè)，并根據(jù)預(yù)先繪制的乳糖、葡萄糖、半乳糖（色譜純）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到低聚半乳糖的得率。

檢測(cè)條件： Aminex HPX-87H 色譜柱，流動(dòng)相為濃度0.05 mol/L的H2SO4，流速0.6 mL/min，柱溫65 ℃，示差檢測(cè)器，進(jìn)樣量20 μL。

2　結(jié)果與討論

2.1乳糖質(zhì)量濃度的選擇

底物乳糖質(zhì)量濃度的高低不僅影響低聚半乳糖最終產(chǎn)量，而且對(duì)反應(yīng)速率也有顯著影響。分別以20 mL質(zhì)量濃度為25%、35%、40%、45%、50%、55%的乳糖溶液為底物，在40 ℃、pH7.0 、酶量為240 g/L的條件下反應(yīng)，乳糖質(zhì)量濃度對(duì)GOS的產(chǎn)率的影響如圖1所示。

圖1　乳糖質(zhì)量濃度對(duì)GOS產(chǎn)率的影響

由圖1可知，在不同底物濃度下反應(yīng)4 h后，GOS產(chǎn)率達(dá)到最大值。隨著乳糖溶液質(zhì)量濃度的增大，GOS的生成速率也在不斷增加，反應(yīng)4 h后達(dá)到反應(yīng)平衡。其中底物濃度為50%時(shí)，GOS最大產(chǎn)率為49%。進(jìn)一步增加底物濃度，產(chǎn)物產(chǎn)率沒(méi)有明顯變化。這個(gè)現(xiàn)象可以做出如下解釋?zhuān)孩偃樘欠肿釉讦?半乳糖苷酶作用下生成半乳糖基，水和糖類(lèi)分子均可作為半乳糖基的受體分別生成半乳糖和低聚半乳糖，兩者作為受體的幾率基本相同，而增加初始乳糖質(zhì)量濃度從另一方面而言也降低了反應(yīng)體系中水的含量，促進(jìn)了GOS的合成；②乳糖質(zhì)量濃度增大，可增加乳糖作為受體的幾率，這是乳糖質(zhì)量濃度影響GOS產(chǎn)率的主要原因。盡管乳糖價(jià)格低廉，但綜合分析成本，選擇質(zhì)量濃度50%的乳糖為最佳底物濃度。

2.2酶用量的選擇

以50%的乳糖為底物濃度，分別以120 g/L、240 g/L、480 g/L、640 g/L、800 g/L的酶溶液為催化劑，在40 ℃、pH7.0條件下反應(yīng)，考察酶用量對(duì)GOS產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，加酶量越大，乳糖的產(chǎn)率越高。當(dāng)酶濃度為640 g/L時(shí)，最大產(chǎn)物產(chǎn)率為60.2%。進(jìn)一步增加酶用量，并不會(huì)使產(chǎn)率發(fā)生明顯變化。這是因?yàn)楫?dāng)加酶量較小時(shí)，酶催化能力不足，增加酶用量能使更多的底物分子接觸到吸附的酶分子的活性中心，提高反應(yīng)速率和產(chǎn)物產(chǎn)率。這種在大量酶用量條件出現(xiàn)產(chǎn)物產(chǎn)率趨于平衡的現(xiàn)象很有代表性，與以前的研究報(bào)道完全相符。鑒于酶制劑價(jià)格較高，選擇640 g/L作為最適酶液濃度。

圖2　酶用量對(duì)GOS產(chǎn)率的影響

2.3反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH的選擇

以50%的乳糖為底物濃度，640 g/L為酶液濃度，先后改變反應(yīng)體系的pH和溫度，從而測(cè)定其對(duì)GOS產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖3和圖4所示。結(jié)果表明，固定化β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性和水解活性的最適溫度均為40 ℃，最適反應(yīng)pH為6.5，且溫度、pH 變化對(duì)酶活影響顯著，是影響β-半乳糖苷酶酶活的主要因素。這主要是因?yàn)闅ぞ厶禽d體表面的潤(rùn)濕性促使酶分子表面電荷發(fā)生改變，促使弱堿性酶最適pH變?yōu)槠嵝?。此外，反?yīng)溫度對(duì)于低聚半乳糖得率也有影響，通常提高溫度能夠促進(jìn)低聚半乳糖的合成，但溫度如果太高也增加了酶失活的可能性，導(dǎo)致GOS產(chǎn)率降低。

圖3　pH對(duì)GOS產(chǎn)率的影響

圖4　溫度對(duì)GOS產(chǎn)率的影響

2.5離子添加劑的選擇

金屬離子能夠通過(guò)可以激活或抑制酶的活性位點(diǎn)影響酶的催化性能，不同金屬離子對(duì)固定化半乳糖苷酶的活性存在影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為2 mmol/L時(shí)，Mg2+的存在使低聚半乳糖的產(chǎn)率提高了10%以上，達(dá)到70.5%；其他金屬離子因?yàn)闀?huì)破壞酶蛋白的構(gòu)象導(dǎo)致酶失活，促使GOS產(chǎn)率降低。這對(duì)于提高生產(chǎn)效率和設(shè)備利用率都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2.6催化劑的重復(fù)利用性

在最優(yōu)條件下，測(cè)定固定化半乳糖苷酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性。將反應(yīng)后的固定化酶用pH6.5的緩沖溶液沖洗干凈后，作為催化劑重復(fù)下一輪試驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。在重復(fù)使用第2次時(shí)出現(xiàn)GOS產(chǎn)率最大值（73%），原因可能是經(jīng)過(guò)浸泡，殼聚糖的通透性和表面潤(rùn)濕性得到提高，底物乳糖更容易透過(guò)與乳糖酶接觸，同時(shí)酶分子的活性中心得到激活展開(kāi)，從而提高了反應(yīng)速率。在固定化酶重復(fù)使用7次后，產(chǎn)物產(chǎn)率下降為64.9%，展現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性。

圖5　固定化酶的重復(fù)使用性

3　總結(jié)

隨著社會(huì)對(duì)功能性食品、保健食品要求的不斷提高，低聚半乳糖的重要性也逐漸得到更多的人重視。本文研究了以殼聚糖吸附與戊二醛交聯(lián)固定化的半乳糖苷酶為催化劑合成低聚半乳糖的過(guò)程，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，固定化半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最佳反應(yīng)條件為：以質(zhì)量濃度50%的乳糖為底物，溶液pH 值為6.5，反應(yīng)溫度為40 ℃，體系中加入2 mmol/L的Mg2+，640 g/L的酶用量，反應(yīng)4 h后，低聚半乳糖的產(chǎn)率為71.5%。在重復(fù)使用7次后，催化得到的GOS產(chǎn)率為64.9%，展現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性。

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Study on immobilized galactosidase enzymatic synthesis of galactooligosaccharides

LIU Xinlong*WANG Lihui TANG Weihua PAN Zhiheng CHENG Xiuwei SUN Yongmin
（Tianjin modern vocational and technical college，Tianjin 300350，China）

隨著社會(huì)對(duì)功能性食品、保健食品要求的不斷提高，低聚半乳糖的重要性也逐漸得到更多人的重視。研究了以殼聚糖吸附與戊二醛交聯(lián)固定化的半乳糖苷酶為催化劑合成低聚半乳糖的過(guò)程，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳反應(yīng)條件為：質(zhì)量濃度50%的乳糖為底物，溶液pH 值6.5，反應(yīng)溫度40 ℃，體系中加入2 mmol/L的Mg2+，640 g/L的酶用量，反應(yīng)4 h后，低聚半乳糖的產(chǎn)率為71.5%。在重復(fù)使用7次后，催化得到的GOS產(chǎn)率仍為64.9%，展現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性。

β-半乳糖苷酶；殼聚糖；交聯(lián)法；低聚半乳糖

As society continues to raise the requirements for functional foods，the importance of galactooligosaccharides gradually get more people's attention. Study on the adsorption chitosan and glutaraldehyde cross-linked immobilized galactosidase synthesis catalyst for the oligomerization process galactose，and the reaction conditions were optimized. The test results showed that the optimum reaction conditions were： mass concentration of 50% lactose as a substrate，the pH value of 6.5，the reaction temperature of 40 ℃，the system was added 2 mmol/L of Mg2+，the enzyme dosage of 640 g/L，the reaction after 4 h ，galactooligosaccharides yield of 71.5%. After repeated 7 times，GOS producing catalytic obtained was still 64.9%，showing good stability.

β-galactosidase；chitosan；crosslinking；galactooligosaccharide

TS245.5

A

1673-6044（2016）01-0020-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.01.007

* 劉鑫龍，男，1988年出生，2014年畢業(yè)于河北工業(yè)大學(xué)生物工程專(zhuān)業(yè)，助教。

2015-12-22