何華偉，位曙光，王葉菁，劉莉娜，李珍珍，趙朋，常懷普，趙萍

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家蠶bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bmsage可溶性表達(dá)、純化與結(jié)構(gòu)分析

何華偉1,2，位曙光1，王葉菁1,2，劉莉娜1，李珍珍1，趙朋1，常懷普1,2，趙萍1

1 西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715;2 西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院重慶市蠶絲纖維新材料工程技術(shù)研究中心，重慶 400715

堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic helix-loop-helix, bHLH) 轉(zhuǎn)錄因子在生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Bmsage是家蠶絲腺中高量表達(dá)的一類(lèi)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與了絲腺細(xì)胞在胚胎期的發(fā)育調(diào)控，而且對(duì)蠶絲蛋白的合成也有至關(guān)重要的調(diào)控作用，然而當(dāng)前對(duì)其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)了解不多。為研究其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，構(gòu)建了NusA、MBP、SUMO、Trx和His融合標(biāo)簽的Bmsage重組原核表達(dá)載體，通過(guò)改變誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度，確定了Bmsage在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的最佳載體和表達(dá)條件，進(jìn)而通過(guò)鎳柱親和層析純化獲得了Bmsage，利用圓二色光譜研究了其二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，NusA與MBP標(biāo)簽可顯著增強(qiáng)Bmsage在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，但難以與Bmsage分離。SUMO標(biāo)簽有一定的助溶效果，并且能夠與Bmsage有效分離。其他標(biāo)簽對(duì)Bmsage可溶性表達(dá)的效果不明顯。圓二色光譜分析表明Bmsage含有α-helix結(jié)構(gòu)，推測(cè)SUMO標(biāo)簽可能促進(jìn)了Bmsage折疊形成類(lèi)天然的結(jié)構(gòu)。這些工作為深入研究Bmsage的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能建立了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他類(lèi)似蛋白的表達(dá)純化提供了參考。

堿性螺旋-環(huán)-螺旋，Bmsage，MBP，NusA，SUMO，純化

生命活動(dòng)受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic helix-loop-helix，bHLH) 轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，它們?cè)谏窠?jīng)元發(fā)生、性別決定、腸組織發(fā)育、肌細(xì)胞及血細(xì)胞生成[1]等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究者們根據(jù)bHLH類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子作用的DNA元件和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將其分為6類(lèi)，同時(shí)又根據(jù)其調(diào)控基因的功能將它們分成了45個(gè)亞家族[2-4]。

1989年，Murre等在小鼠中首次鑒定了bHLH轉(zhuǎn)錄因子E12和E47[5]。bHLH結(jié)構(gòu)域大約由60個(gè)氨基酸殘基組成，包含1個(gè)與DNA結(jié)合的堿性區(qū)域和1個(gè)可調(diào)節(jié)蛋白二聚化的HLH結(jié)構(gòu)域[6-7]。1994年，MyoD的bHLH結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)被解析[8]，促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄因子參與DNA識(shí)別和轉(zhuǎn)錄激活方面的研究。Imayoshi與Kageyama發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控端腦發(fā)育方面具有多樣化的功能[9]。果蠅唾液腺特異因子sage屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，在果蠅唾液腺的發(fā)生和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[10-11]。2007年，王勇等以黑腹果蠅bHLH氨基酸序列為查詢(xún)模板，從家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到了52個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子[12]。本實(shí)驗(yàn)室劉春等[13]在家蠶絲腺中鑒定了1個(gè)與果蠅sage同源高量表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，將其命名為Bmsage。本實(shí)驗(yàn)室趙小明等在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，Bmsage可以與絲腺因子1 (Silk gland factor-1，SGF-1) 相互作用，調(diào)控絲素重鏈基因的表達(dá)[14]。Xin等借助CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除了家蠶基因，發(fā)現(xiàn)敲除突變體的家蠶絲腺發(fā)育不正 常[15]，但是其具體的調(diào)控機(jī)制并不清楚。

盡管Bmsage在家蠶絲腺發(fā)育和蠶絲蛋白的合成方面發(fā)揮著重要的功能，然而，迄今為止，我們對(duì)該蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)仍然了解不多。本文希望借助體外重組原核表達(dá)技術(shù)，利用溶解性高的多肽序列標(biāo)簽和Transetta (DE3) 表達(dá)菌株，通過(guò)改變誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度來(lái)表達(dá)并純化獲得可溶性Bmsage蛋白，從而為研究其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

pET-50b(+)購(gòu)自Novagen (默克，德國(guó))；pCold-SUMO和pET 32M.3C分別由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樊惠英教授和中國(guó)科技大學(xué)周叢照教授惠贈(zèng)；ppSUMO、pSKB2和pET-MBP來(lái)自美國(guó)西南醫(yī)學(xué)中心張學(xué)武教授的饋贈(zèng)?？寺【?) DH5α和表達(dá)菌株Transetta (DE3) 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。限制性?xún)?nèi)切酶H Ⅰ、d Ⅲ購(gòu)自TaKaRa寶生物工程 (大連) 有限公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自New England Biolabs公司；RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；氨芐青霉素(Amp)、硫酸卡納霉素(Kana)、氯霉素(Cam) 以及異丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；常規(guī)蛋白分子量Marker購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

分別利用RACC (http://nihserver.mbi.ucla. edu/RACC/) 和Protparam (http://web.expasy.org/ protparam/)分析基因稀有密碼子及其氨基酸特征。利用IBS 1.0軟件構(gòu)建其基因與蛋白結(jié)構(gòu)模式圖。以Bmsage氨基酸序列為模板，在Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) 中進(jìn)行Blast分析，選取果蠅、蟻、蝶、蚊等種屬中相似的氨基酸序列，利用Clustal X[16]進(jìn)行序列比對(duì)，并利用ESPript[17](http://espript.ibcp.fr/ ESPript/ESPript/index.php) 對(duì)bHLH結(jié)構(gòu)域同源比對(duì)結(jié)果渲染，借助Mega 6.0[18]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)5齡3天家蠶各組織芯片基因表達(dá)譜(http://www.silkdb.org/microarray/)，借助HemI[19]分析基因表達(dá)模式。

1.3 表達(dá)載體構(gòu)建

取5齡3 天家蠶后部絲腺組織，利用Trizol RNA提取試劑盒提取總RNA，然后以其為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中(ID: BGIBMGA005127) 的CDS序列，利用Primer Premier設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)orward：5′-CGCATGTACAATCAAACATACGACGAT-3′ (下劃線部分為H Ⅰ酶切位點(diǎn))；Reverse：5′-CCCTTAGTATCTCTGTTGACGCCTTC-3′ (下劃線部分為d Ⅲ酶切位點(diǎn))。通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并通過(guò)DNA凝膠回收試劑盒對(duì)目的DNA片段純化回收。將質(zhì)粒與目的DNA片段利用H Ⅰ和d Ⅲ在37 ℃同時(shí)雙酶切4 h，然后利用T4 DNA連接酶在16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單克隆并提取質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切與基因測(cè)序?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 蛋白可溶性表達(dá)條件探索

將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Transetta (DE3) 細(xì)胞，挑取單克隆菌落在37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后按照1∶100的比例接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至600達(dá)到0.5–1.0，加入0.01–1 mmol/L IPTG，在12–37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)。160 r/min、37 ℃培養(yǎng)4 h，25 ℃培養(yǎng)10 h，12 ℃、14 ℃和16 ℃培養(yǎng) 20 h，對(duì)照為37 ℃下不加IPTG培養(yǎng)4 h的菌液，離心收集細(xì)胞。按培養(yǎng)物∶裂解液=10∶1比例加入預(yù)冷的裂解液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L氯化鈉，10%甘油)，充分懸浮細(xì)胞。冰浴超聲破碎。菌體裂解物于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清和沉淀經(jīng)15% SDS-PAGE電泳鑒定，比較不同標(biāo)簽融合蛋白在不同條件下的表達(dá)量，篩選較好的表達(dá)載體與表達(dá)條件。

1.5 目的蛋白純化

根據(jù)篩選的表達(dá)載體和表達(dá)條件，大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌。細(xì)胞破碎后離心收集上清，將上清通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾，在4 ℃下利用鎳柱親和層析對(duì)細(xì)胞裂解液中的融合蛋白進(jìn)行分離提純，利用15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)不同咪唑濃度的洗脫結(jié)果。將純化的融合蛋白通過(guò)HiPrep 26/10 (GE Healthcare) 除去咪唑并同時(shí)置換為酶切緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L氯化鈉，5%甘油)，加入蛋白酶在4 ℃酶切16 h。將酶切產(chǎn)物再次通過(guò)鎳柱除去融合標(biāo)簽，從而純化獲得不含標(biāo)簽的Bmsage。

1.6 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用圓二色光譜儀MOS-500 (Bio-Logic，法國(guó))對(duì)Bmsage的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，蛋白樣品溶于磷酸緩沖液PBS中，波譜掃描范圍為190–250 nm，比色皿光程1 mm，蛋白濃度為 0.1 mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

基因位于家蠶第25號(hào)染色體，共有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子 (圖1A)，cDNA全長(zhǎng)705 bp，編碼234個(gè)氨基酸殘基。Bmsage分子量28.1 kDa，等電點(diǎn)5.97，帶電荷氨基酸占整個(gè)蛋白的41%。Bmsage中152–205位氨基酸殘基為bHLH結(jié)構(gòu)域 (圖1B)，該區(qū)域等電點(diǎn)為10.1；N末端結(jié)構(gòu)域(1–140) 富含酸性氨基酸殘基，其等電點(diǎn)為4.77。N末端和bHLH結(jié)構(gòu)域之間可能存在電荷-電荷相互作用，從而維持Bmsage構(gòu)象的穩(wěn)定。疏水性分析表明，Bmsage的親水性指數(shù)為–1.223，表明該蛋白趨向于親水。然而，我們發(fā)現(xiàn)，Bmsage容易形成包涵體表達(dá)。將Bmsage與可溶性標(biāo)簽融合表達(dá)，融合蛋白雖然以可溶性的形式表達(dá)，但是當(dāng)去除標(biāo)簽之后，Bmsage容易發(fā)生聚沉，這可能是因?yàn)锽msage分子之間可能通過(guò)電荷-電荷相互作用結(jié)合，從而導(dǎo)致蛋白聚集沉淀。

大腸桿菌對(duì)外源基因的表達(dá)具有密碼子偏好性。分析發(fā)現(xiàn)，基因包含多個(gè)稀有密碼子，可能會(huì)影響其在大腸桿菌中的表達(dá)。Transetta (DE3)細(xì)胞可以補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，從而提高外源基因的表達(dá)水平。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了Transetta (DE3)細(xì)胞作為表達(dá)菌株。

圖1 Bmsage基因結(jié)構(gòu)(A)及其蛋白結(jié)構(gòu)域 (B) 分析

2.2 基因的組織表達(dá)譜分析

根據(jù)5齡3天家蠶各組織芯片基因表達(dá)譜，繪制在不同組織中表達(dá)的熱圖。結(jié)果顯示，在家蠶絲腺中高量表達(dá)，而在頭部等其他組織中表達(dá)量較低 (圖2A)。定量分析 (圖2B) 顯示，無(wú)論在雄蠶前中部絲腺，還是后部絲腺中的表達(dá)量都比雌蠶在相同組織中的表達(dá)量高。一般來(lái)說(shuō)，在相同的飼養(yǎng)條件下，同一品種雄蠶的產(chǎn)絲量要高于雌蠶。之前本實(shí)驗(yàn)室的趙小明等發(fā)現(xiàn)，在家蠶絲腺中高量表達(dá)，并且其在5齡期與絲素重鏈基因表達(dá)趨勢(shì)一致。在后部絲腺，在高絲量品種872中的表達(dá)量要比低絲量品種大造的 高[14]。這些結(jié)果表明可能與家蠶絲腺合成蠶絲蛋白的主要功能相關(guān)。

2.3 蛋白序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

以Bmsage氨基酸序列為模板，通過(guò)Pubmed進(jìn)行Blast分析。選取柑橘鳳蝶等物種的bHLH序列與Bmsage的bHLH序列進(jìn)行多序列比對(duì) (圖3)。結(jié)果表明，bHLH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在不同物種之間高度保守，暗示了bHLH類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在不同的物種中可能具有重要的生物學(xué)功能。

圖2 5齡3天家蠶Bmsage基因表達(dá)分析(A：不同組織中的表達(dá)熱圖分析. ♀：雌性；♂：雄性；Sg：性腺；Hd：頭；It：表皮；Fb：脂肪體；Mg：中腸；He：血細(xì)胞；Mt：馬氏管；A/MSG：前中部絲腺；PSG：后部絲腺.B：Bmsage在雌蠶和雄蠶絲腺中的表達(dá)差異分析)

以Blast結(jié)果為基礎(chǔ)，選取果蠅、蟻、蝶、蚊等物種中與Bmsage序列相似的蛋白構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹(shù) (圖4)。結(jié)果顯示，家蠶與冬尺蠖蛾、柑橘鳳蝶的親緣關(guān)系最近，可以聚為一枝，其次是果蠅屬的各物種，而與蟻、虱等物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 不同物種bHLH結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)

圖4 家蠶Bmsage與其他物種同源蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

2.4 表達(dá)載體構(gòu)建與可溶性表達(dá)分析

為研究Bmsage的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，利用PCR擴(kuò)增獲得了基因，然后通過(guò)雙酶切將其構(gòu)建到pSKB2等載體中進(jìn)行表達(dá)，其中pSKB2、ppSUMO和pCold-SUMO是以pET-28a (+) 載體為基礎(chǔ)改造而來(lái)，它們分別是將pET-28a (+) 中的Thrombin位點(diǎn)替換為PreScission和SUMO蛋白

酶切位點(diǎn)；pET 32M.3C中包含有6×His和Trx標(biāo)簽和PreScission酶切位點(diǎn)；pET-MBP基于pET-32a (+) 載體改造而來(lái)，包含6×His和MBP標(biāo)簽和煙草蝕紋病毒蛋白酶 (TEV) 酶切位點(diǎn)。

不同表達(dá)載體和表達(dá)條件下融合蛋白的表達(dá)效果如圖5所示。結(jié)果顯示，pSKB2-Bmsage (圖5A)、ppSUMO-Bmsage (圖5B)和pET 32M.3C-Bmsage (圖5F) 在37 ℃下融合蛋白以包涵體形式表達(dá)，而在其他溫度下可溶性蛋白的表達(dá)量較低，因此不適宜用這些載體表達(dá)可溶性的Bmsage。pCold-SUMO-Bmsage (圖5C) 在所有條件下都有表達(dá)，在16 ℃、0.1 mmol/L IPTG下表達(dá)較好。pET-50b (+)-Bmsage (圖5D) 在12 ℃和14 ℃下，融合蛋白主要以可溶性形式表達(dá)，在12 ℃、 0.1 mmol/L IPTG下表達(dá)較好。pET-MBP-Bmsage (圖5E) 在16 ℃、0.1 mmol/L IPTG下表達(dá)較好。有研究表明，30 ℃有助于大腸桿菌產(chǎn)生可溶有活性的蛋白。我們對(duì)部分表達(dá)載體設(shè)置為30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)Bmsage的可溶性表達(dá)影響不大，因此設(shè)置了12–16 ℃來(lái)篩選Bmsage的可溶性表達(dá)條件。根據(jù)以上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇pCold-SUMO-Bmsage、pET-50b (+)-Bmsage和pET-MBP-Bmsage載體，并根據(jù)它們最優(yōu)的表達(dá)條件來(lái)對(duì)Bmsage進(jìn)行表達(dá)純化。

圖5 誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度對(duì)不同重組表達(dá)載體表達(dá)Bmsage融合蛋白的影響(A：pSKB2-Bmsage；B：ppSUMO-Bmsage；C：pCold-SUMO-Bmsage；D：pET-50b(+)-Bmsage；E：pET-MBP-Bmsage；F：pET 32M.3C-Bmsage；M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；Control、C：對(duì)照；S：上清；P：沉淀)

2.5 蛋白表達(dá)和純化

2.5.1 利用pET-50b (+) 表達(dá)和純化Bmsage

利用鎳柱親和層析對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化 (圖6A)，上樣緩沖液A為20 mmol/L Tris-HCl、 (pH 8.0)、500 mmol/L氯化鈉、10%甘油、 20 mmol/L咪唑，利用包含不同咪唑濃度的緩沖溶液分步洗脫。結(jié)果顯示，在300 mmol/L咪唑的洗脫條件下得到的融合蛋白 (約90 kDa) 較純。將融合蛋白脫鹽并置換為酶切緩沖液B (50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L氯化鈉，10%甘油，5 mmol/L β-巰基乙醇)，加入PreScission酶在4 ℃酶切16 h。酶切產(chǎn)物再次通過(guò)鎳柱以除去NusA標(biāo)簽 (圖6B)。結(jié)果顯示，無(wú)論流穿，還是咪唑濃度梯度洗脫，Bmsage與NusA都不能被有效地分離。將圖6B中第4–6泳道的樣品收集除去咪唑后再次過(guò)鎳柱，蛋白損失較多，且仍然不能將Bmsage與NusA標(biāo)簽完全分開(kāi)。

2.5.2 利用pET-MBP表達(dá)和純化Bmsage

收集細(xì)胞，破碎離心后將上清通過(guò)鎳柱純化，利用15% SDS-PAGE檢測(cè)流穿和洗脫液(圖7A)。結(jié)果顯示，大部分His-MBP-Bmsage不與鎳柱結(jié)合，即使降低流速上樣，或者收集流穿二次上樣，也無(wú)法讓二者有效結(jié)合。利用包含不同咪唑濃度的緩沖溶液洗脫，在300 mmol/L咪唑的洗脫條件下得到的融合蛋白 (約70 kDa) 較純。收集該融合蛋白并脫鹽置換為酶切緩沖液B，加入TEV酶酶切，酶切產(chǎn)物通過(guò)鎳柱以除去His-MBP標(biāo)簽(圖7B)。結(jié)果顯示，部分融合蛋白沒(méi)有被TEV酶酶切，隨Bmsage一起出現(xiàn)在流穿中 (圖7B，泳道3)。利用不同濃度的咪唑分步洗脫，仍然不能將His-MBP標(biāo)簽與Bmsage有效地分離。

圖6 借助pET-50b (+) 表達(dá)和純化Bmsage. (A) 鎳柱親和層析純化(1：上清；2：沉淀；3：流穿；4–7：60、80、100和300 mmol/L咪唑洗脫液)；(B)酶切后通過(guò)鎳柱純化(1：重組蛋白；2：重組蛋白被PreScission蛋白酶酶切；3：流穿；4–8：20、40、50、60和500 mmol/L咪唑洗脫液. M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn))

圖7 借助pET-MBP表達(dá)和純化Bmsage. (A)鎳柱親和層析純化(1：上清；2：沉淀；3：流穿；4–7：40、60、80和300 mmol/L咪唑洗脫液)；(B)酶切后通過(guò)鎳柱純化(1：重組蛋白；2：重組蛋白被TEV蛋白酶酶切；3：流穿；4–9：20、30、40、50、60和300 mmol/L咪唑洗脫液；M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn))

2.5.3 利用pCold-SUMO表達(dá)和純化Bmsage

利用鎳柱親和層析純化His-SUMO-Bmsage，收集流穿和洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)(圖8A)，發(fā)現(xiàn)在300 mmol/L咪唑的洗脫條件下，獲得的His-SUMO-Bmsage (約55 kDa) 較純。將純化的融合蛋白脫鹽并置換為酶切緩沖液B，加入SUMO蛋白酶在4 ℃酶切16 h，再次通過(guò)鎳柱去除SUMO標(biāo)簽 (圖8B)。結(jié)果顯示His-SUMO-Bmsage差不多被酶切完全，在流穿和40 mmol/L咪唑洗脫液中，可以檢測(cè)到純化的Bmsage，表明Bmsage與His-SUMO標(biāo)簽可以被有效地分開(kāi)。

2.6 六種重組表達(dá)載體的表達(dá)純化分析

本文利用6種表達(dá)載體對(duì)Bmsage在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，并選擇了可溶性表達(dá)較好的載體和表達(dá)條件進(jìn)行了純化?，F(xiàn)將所有的表達(dá)和純化情況簡(jiǎn)要總結(jié)于表1，其中表達(dá)水平取該表達(dá)系統(tǒng)所有誘導(dǎo)條件下的最優(yōu)值。結(jié)果顯示，pSKB2-Bmsage、pET 32M.3C-Bmsage、ppSUMO- Bmsage主要以包涵體的形式表達(dá)，無(wú)法用于下一步純化。pCold-SUMO-Bmsage、pET-50b(+)- Bmsage、pET-MBP-Bmsage部分以可溶性的形式在上清中表達(dá)，尤其是后兩者，可溶性融合蛋白的表達(dá)量較高，但是難以將Bmsage與融合標(biāo)簽分離，而B(niǎo)msage與SUMO標(biāo)簽則可以被有效地分開(kāi)。因此，pCold-SUMO是Bmsage表達(dá)純化的最優(yōu)系統(tǒng)。

2.7 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

Bmsage屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，包含螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域。為證實(shí)純化的Bmsage是否包含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，利用遠(yuǎn)紫外圓二色光譜對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析 (圖9)。結(jié)果顯示，在圓二色光譜上208 nm與222 nm波長(zhǎng)處有2個(gè)明顯的負(fù)峰，193 nm波長(zhǎng)處有1個(gè)明顯的正峰，這些為α-螺旋結(jié)構(gòu)的典型特征，表明純化獲得的Bmsage具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，推測(cè)其可能形成了類(lèi)天然蛋白的空間構(gòu)象。

圖8 借助pCold-SUMO表達(dá)和純化Bmsage.(A) 鎳柱親和層析純化 (1：上清；2：沉淀；3：流穿；4–7：40、60、80和300 mmol/L咪唑洗脫液)；(B)酶切后通過(guò)鎳柱純化 (1：重組蛋白；2：重組蛋白被SUMO蛋白酶酶切；3：流穿；4–5：40和300 mmol/L咪唑洗脫液；M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn))

表1 6種重組表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)純化情況比較

“+” indicates the level of expression and solubility, and the effect of purification, the more the better. 0 presents no observable solubility, and blank area represents this experiment is not conducted.

圖9 Bmsage蛋白的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜

3 討論 蠶絲纖維因其優(yōu)異的性能而被譽(yù)為“纖維皇后”。蠶絲蛋白主要由絲素和絲膠組成，其中主要成分是絲素。絲素由絲素重鏈、絲素輕鏈和P25按6∶6∶1的比例組成[20]，其中絲素重鏈?zhǔn)墙z素蛋白中最重要的成分，它賦予了蠶絲纖維主要的力學(xué)性能。絲素重鏈基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平受多種轉(zhuǎn)錄因子 (SGF-1、SGF-2、SGF-3、SGF-4、FMBP-1、FBF-A1、Bmdimm等)[21-24]的調(diào)控。自本實(shí)驗(yàn)室劉春等[13]鑒定Bmsage以來(lái)， 研究表明Bmsage在絲蛋白合成[14]和絲腺器官發(fā)育[15]過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，然而迄今為止，對(duì)Bmsage的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)了解不多。本研究擬通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)純化Bmsage，從而為深入研究其結(jié)構(gòu)和功能建立基礎(chǔ)。 基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)速率和蛋白理化性質(zhì)是影響外源基因在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的主要因素。基因結(jié)構(gòu)可以通過(guò)密碼子優(yōu)化或者利用攜帶稀有密碼子tRNA的表達(dá)菌株來(lái)克服其表達(dá)問(wèn)題；基因表達(dá)速率可以通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度來(lái)下調(diào)，從而使外源蛋白有充分的時(shí)間折疊形成正確的空間構(gòu)象促進(jìn)其溶解；外源蛋白可以通過(guò)與親水的標(biāo)簽融合表達(dá)來(lái)提高其在大腸桿菌中表達(dá)的可溶性。20世紀(jì)末，融合標(biāo)簽技術(shù)快速發(fā)展起來(lái)，在輔助蛋白純化、提高外源蛋白表達(dá)產(chǎn)量、溶解性和穩(wěn)定性等方面顯示出了巨大的應(yīng)用價(jià)值。pET-50b(+)中的NusA[25]和pET-MBP中的MBP標(biāo)簽[26-27]具有較好的親水性，可以幫助提高外源蛋白的可溶性；pCold-SUMO與ppSUMO中的SUMO標(biāo)簽[28]不僅有助于提高外源蛋白的溶解性，還可以促進(jìn)其在體內(nèi)的折疊；pET 32M.3C中的Trx標(biāo) 簽[29]不僅能夠提高蛋白的溶解性，還能促進(jìn)蛋白質(zhì)中二硫鍵的正確配對(duì)。本研究將NusA、MBP、SUMO和Trx等標(biāo)簽分別與Bmsage融合表達(dá)，并利用Transetta (DE3)表達(dá)菌株，結(jié)合降低誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度的方式成功實(shí)現(xiàn)了Bmsage在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。高中生物課程是學(xué)生學(xué)習(xí)的重要科目，對(duì)學(xué)生的綜合知識(shí)學(xué)習(xí)能力的提高有著積極作用，生物課堂教學(xué)過(guò)程中，注重教學(xué)方法的科學(xué)應(yīng)用比較關(guān)鍵，這也是促進(jìn)教學(xué)質(zhì)量的重要舉措。通過(guò)從理論層面深化生物課堂生活化教學(xué)發(fā)展研究，能為實(shí)際教學(xué)工作的開(kāi)展提供相應(yīng)參考。 我們的結(jié)果顯示，NusA與MBP標(biāo)簽具有較好的助溶效果，能夠顯著地提高Bmsage的可溶性表達(dá)，這與其他的研究結(jié)果基本一致[30-31]。然而，當(dāng)酶切之后，NusA標(biāo)簽與Bmsage無(wú)法有效地分離。NusA標(biāo)簽含有大量的酸性氨基酸殘基，等電點(diǎn)約為4.62，推測(cè)其可能與Bmsage中堿性氨基酸殘基之間存在非特異性電荷-電荷相互作用從而導(dǎo)致二者無(wú)法分開(kāi)。His-MBP-Bmsage大部分不與鎳柱結(jié)合，并且不能被酶切完全，即使加大蛋白酶用量、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或者提高酶切反應(yīng)溫度也無(wú)法提高酶切產(chǎn)率，這可能是因?yàn)槿诤系鞍妆旧頉](méi)有折疊形成良好的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致組氨酸標(biāo)簽和蛋白酶切位點(diǎn)被包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，組氨酸標(biāo)簽無(wú)法與鎳親和填料結(jié)合，同時(shí)TEV酶切位點(diǎn)兩端的MBP與Bmsage也可能會(huì)對(duì)TEV酶產(chǎn)生空間位阻，導(dǎo)致融合蛋白無(wú)法被TEV酶識(shí)別和切割。Trx標(biāo)簽有助于富含二硫鍵蛋白的正確折疊，并且在一定程度上也能幫助提高外源蛋白的溶解性[30]，但其對(duì)于Bmsage的可溶性表達(dá)并沒(méi)有明顯的幫助。SUMO標(biāo)簽可以幫助提高Bmsage的可溶性表達(dá)，其效果不如NusA與MBP標(biāo)簽明顯，但經(jīng)過(guò)SUMO蛋白酶酶切后，SUMO標(biāo)簽與Bmsage可以通過(guò)鎳柱被有效地分離。圓二色光譜顯示，利用SUMO標(biāo)簽表達(dá)純化的Bmsage包含α-螺旋結(jié)構(gòu)，推測(cè)其可能折疊形成了類(lèi)天然的空間結(jié)構(gòu)，這表明SUMO標(biāo)簽不僅具有一定的助溶效果，而且也有助于Bmsage的正確折疊。 bHLH轉(zhuǎn)錄因子在生命活動(dòng)過(guò)程中具有多種重要的生物學(xué)功能，然而之前的研究很少涉及此類(lèi)蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，這可能與其難以表達(dá)純化相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，Bmsage容易形成包涵體表達(dá)，并且易于聚沉，這可能與其氨基酸組成和性質(zhì)相關(guān)。本研究利用SUMO標(biāo)簽和鎳親和層析的方法表達(dá)純化了Bmsage蛋白，為深入研究其結(jié)構(gòu)性質(zhì)和功能建立了很好的基礎(chǔ)，同時(shí)，我們的研究對(duì)其他類(lèi)似蛋白的表達(dá)和純化也有一定的借鑒意義。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Soluble expression, purification and structural analysis of the bHLH transcription factor Bmsage of

Huawei He1,2, Shuguang Wei1, Yejing Wang1,2, Lina Liu1, Zhenzhen Li1, Peng Zhao1, Huaipu Chang1,2, and Ping Zhao1

1,,400715,Chongqing Engineering and Technology Research Center for Novel Silk MaterialsCollege of BiotechnologySouthwest UniversityChongqingChina

Basic helix loop helix (bHLH) transcription factor plays an important role in biological processes. Bmsage is a class of bHLH transcription factor highly expressed in the silk gland of, which is not only involved in the developmental regulation of the silk gland cells at the embryonic period, but also plays a crucial regulatory role during the synthesis of silk protein. However, currently, much of the property and structure of Bmsage is still remained unknown. To study the property, structure and biological role of Bmsage, we constructed several prokaryotic expression vectors of Bmsage fused with NusA, MBP, SUMO, Trx and His tags, respectively, then screened and determined the best soluble expression vector and condition of Bmsage incombining with the induction temperature and IPTG concentration, and further purified the recombinant Bmsage by Ni-column affinity chromatography according to the established expression condition and characterized its secondary structure using circular dichroism spectra. The results showed that NusA and MBP could significantly enhance the soluble expression of Bmsage in, but it was difficult to separate Bmsage from these tags. SUMO could not only increase the soluble expression of Bmsage into a certain degree, but also be effectively separated from Bmsage. Other tags did not effectively promote the soluble expression of Bmsage in. Circular dichroism spectra showed that the purified Bmsage had well-defined α-helix structure in solution, indicating that SUMO may promote the correct folding of Bmsage into native-like structure. These work not only establish a foundation for further study of the property, structure and function of Bmsage, but also provide a reference for the expression and purification of other similar proteins.

basic helix-loop-helix, Bmsage, MBP, NusA, SUMO, purification

March 21, 2016; Accepted:May 12, 2016

Huawei He. Tel: +86-23-68251575; E-mail: hehuawei@swu.edu.cn

時(shí)間：2016-06-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160613.0955.001.html

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