王星晨，胡 凱，陶永勝,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

葡萄汁有孢漢遜酵母和釀酒酵母的混合酒精發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

王星晨1，胡 凱1，陶永勝1,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

利用課題組前期優(yōu)選的具有高β-葡萄糖苷酶活性的葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）研究其與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株混合發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)，為其葡萄酒增香釀造的應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持。實(shí)驗(yàn)選用陜西楊凌的愛格麗葡萄為原料，設(shè)計(jì)優(yōu)選菌株提前釀酒酵母48 h接種和同時(shí)接種兩個(gè)發(fā)酵處理，接種量1.0×106CFU/mL，同時(shí)用YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行兩個(gè)處理的模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)以純釀酒酵母發(fā)酵為對(duì)照。發(fā)酵過程中監(jiān)測不同酵母菌數(shù)量、酒精體積分?jǐn)?shù)、還原糖等指標(biāo)，建立動(dòng)力學(xué)模型。結(jié)果表明，提前接種處理中優(yōu)選菌株生存數(shù)量最多，生存時(shí)間最長，在其對(duì)數(shù)生長期酒精生成和還原糖消耗速率最慢，但整體酒精發(fā)酵正常，酒精生成量不受影響，說明發(fā)酵過程中不良副產(chǎn)物生成量有限。因此，優(yōu)選菌株提前釀酒酵母接種的混合發(fā)酵具有葡萄酒增香釀造的應(yīng)用可能。

有孢漢遜酵母；β-葡萄糖苷酶；釀酒酵母；混合酒精發(fā)酵；動(dòng)力學(xué)

葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)過程中應(yīng)用純種釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的活性干粉啟動(dòng)酒精發(fā)酵越來越普遍，單一菌種發(fā)酵在帶來發(fā)酵純正、酒精生成率高的同時(shí)，也引起葡萄酒風(fēng)味特征同質(zhì)化現(xiàn)象，因此混合菌種發(fā)酵逐漸受到釀酒師們的關(guān)注。事實(shí)上，葡萄自然酒精發(fā)酵過程是由非釀酒酵母（non-Saccharomyces）觸發(fā)的[1]，一些非釀酒酵母菌種的發(fā)酵會(huì)給葡萄酒質(zhì)量帶來消極影響，比如醋酸、乙醛、甲硫醇含量的升高[2-3]。但進(jìn)一步研究表明，某些非釀酒酵母可以增加葡萄酒感官質(zhì)量特征的復(fù)雜性[4]，有效接種優(yōu)選非釀酒酵母與釀酒酵母進(jìn)行混合酒精發(fā)酵對(duì)提升葡萄酒感官質(zhì)量有重要意義。有研究揭示了某些非釀酒酵母具有高活性的糖苷酶，能夠有效促進(jìn)葡萄香氣前體物質(zhì)的水解，生成游離的活性香氣成分，提升葡萄酒香氣質(zhì)量[5]。不同非釀酒酵母菌株的活動(dòng)對(duì)香氣物質(zhì)生成的貢獻(xiàn)有差異，如美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）可促進(jìn)中鏈脂肪酸、苯乙醇、乙酸異戊酯等的生成[6]，戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）可以產(chǎn)生更多的苯乙醇和多糖以及更低的揮發(fā)酸[7]，有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）和嗜高壓有孢漢遜酵母（Hanseniaspora osmophila）等可發(fā)酵產(chǎn)生更高的乙酸酯類化合物，如乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯[8-9]。盡管有研究將β-葡萄糖苷酶從非釀酒酵母中提取出來用于釀酒實(shí)驗(yàn)并且取得了良好效果[10-12]，但是并不能完全體現(xiàn)相應(yīng)菌株在釀酒實(shí)驗(yàn)中的效果。因此，有研究篩選優(yōu)良的非釀酒酵母菌種，與釀酒酵母混合酒精發(fā)酵，報(bào)道其提高葡萄酒風(fēng)味成分和感官質(zhì)量的數(shù)據(jù)[13-14]，但是有關(guān)非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)的研究較少，非釀酒酵母混合發(fā)酵過程中有效活動(dòng)的數(shù)據(jù)缺乏。

本研究前期工作篩選獲得一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的葡萄汁有孢漢遜酵母，本實(shí)驗(yàn)研究其與釀酒酵母混合酒精發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)，目的是從理論上揭示混合發(fā)酵過程中優(yōu)選菌株生存數(shù)量、生存時(shí)間，糖消耗和酒精產(chǎn)率的規(guī)律，推斷其應(yīng)用于葡萄酒增香釀造的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

愛格麗（Ecolly）葡萄，2014年8月采自陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)釀酒葡萄官村基地，含糖量185.6 g/L、含酸量6.7 g/L（以酒石酸計(jì)）。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），其在WL固體培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)光滑、綠色、扁平狀，并帶有透明環(huán)，基因庫登錄序列號(hào)：JQ678682.1，中國典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號(hào)CCTCC M 2013658）；釀酒酵母（F33型號(hào)釀酒酵母活性干粉） 法國Laffort公司。

YPD培養(yǎng)基（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，培養(yǎng)72 h，取其培養(yǎng)物上清液的β-葡萄糖苷酶，測得其酶活力為0.075 U/mL。

1.3 混合發(fā)酵接種方案

1.3.1 葡萄汁酒精發(fā)酵

愛格麗葡萄經(jīng)除梗破碎后裝罐，同時(shí)加入50 mg/L的二氧化硫，在5 ℃條件下浸漬24 h后壓榨取汁，加入1.0 g/L膨潤土下膠澄清，澄清汁接種酵母菌。

提前接種：首先接種1.0×106CFU/mL優(yōu)選菌株（H.uvarum），48 h后接種1.0×106CFU/mL釀酒酵母（酵母菌干粉經(jīng)30 min活化，下同）；同時(shí)接種：1.0×106CFU/mL的H. uvarum和1.0×106CFU/mL的釀酒酵母同時(shí)接種；純釀酒酵母：只接種1.0×106CFU/mL釀酒酵母。其中H. uvarum采用YPD培養(yǎng)基濃縮菌懸液形式培養(yǎng)接種。

發(fā)酵溫度控制在18～20 ℃，待相對(duì)密度低于0.996，殘?zhí)呛康陀? g/L時(shí)，終止發(fā)酵。

1.3.2 模擬酒精發(fā)酵

在250 mL的三角瓶中裝入等量的YPD液體培養(yǎng)基，在20 ℃條件下恒溫靜止進(jìn)行模擬發(fā)酵。

模擬酒精發(fā)酵接種方案：提前接種、同時(shí)接種、純釀酒酵母，接種方案同1.3.1節(jié)。

1.4 指標(biāo)檢測及處理方法

1.4.1 取樣方法

接種酵母菌后，每隔24 h于發(fā)酵液中取一定體積酒樣。其中葡萄汁發(fā)酵液中取上層液體，模擬發(fā)酵體系取樣前進(jìn)行搖瓶，使沉淀的菌體均勻分布在發(fā)酵液中，然后取樣。

1.4.2 微生物計(jì)數(shù)方法

微生物菌落總數(shù)采用血球計(jì)數(shù)法，各菌種的數(shù)量采用WL固體培養(yǎng)基平板菌落計(jì)數(shù)法[15]。WL固體培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn)[16]方法。

1.4.3 酒精體積分?jǐn)?shù)及還原糖含量測定

酒精體積分?jǐn)?shù)采用密度瓶法測定；還原糖含量采用斐林試劑法測定[15]。

1.5 發(fā)酵模型建立方法[17-20]

菌體生長模型采用Monod模型，使用Logistic方程進(jìn)行非線性擬合，Logistic方程：

式中：X為t時(shí)刻的菌體濃度/（107CFU/mL）；Xm為最大菌體濃度/（107CFU/mL）；B為常數(shù)；t為發(fā)酵時(shí)間/d；k為最大比生長速率/d－1。

酵母菌的厭氧發(fā)酵產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型使用Luedeking-Piret模型建立：

式中：C為發(fā)酵產(chǎn)物酒精的體積分?jǐn)?shù)/%；α為與生長偶聯(lián)的產(chǎn)物形成系數(shù)；β為非生長偶聯(lián)的相關(guān)系數(shù)。

由于酒精是酵母菌生長的初級(jí)代謝產(chǎn)物，故其生長速率與菌體生長直接相關(guān)，所以酒精的生成屬于偶聯(lián)型，因此α≠0，β＝0。所以酒精生成方程可用Logistic方程直接進(jìn)行擬合：

式中：C為酒精生成體積分?jǐn)?shù)/%；Cm為酒精體積分?jǐn)?shù)最大值/%；D為常數(shù)；μ為酒精生成最大比生成速率/d－1。1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

描述性統(tǒng)計(jì)量使用SPSS 18.0（SPSS Inc., Chicago IL, USA）進(jìn)行計(jì)算，OriginPro 9.0進(jìn)行非線性擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中不同酵母菌生長趨勢的變化

圖1 愛格麗葡萄汁酒精發(fā)酵中提前接種（A）、同時(shí)接種（B）和純釀酒酵母（C）體系的不同酵母菌生長趨勢變化Fig.1 Evolution of different yeasts during alcohol fermentation of grape juice in asynchronous (A), simultaneous inoculation (B), and pure S. cerevisiae (C) treatments

圖1 A提前接種處理中，在釀酒酵母接種前，H. uvarum生長繁殖迅速，在接種48 h時(shí)種群數(shù)量達(dá)到大約2.0×107CFU/mL，并在24 h后達(dá)到極大值約3.0×107CFU/mL，此后隨著釀酒酵母數(shù)量的增多，H. uvarum數(shù)量開始波動(dòng)，并緩慢降低，但是直至發(fā)酵結(jié)束H. uvarum的數(shù)量仍維持在1.0×107CFU/mL左右。圖1B中，兩種酵母菌同時(shí)接種到葡萄汁中，H. uvarum只在接種后的24 h內(nèi)迅速生長繁殖且速率明顯大于在提前接種處理中的速率，其最大濃度為2.0×107CFU/mL，但是此后H. uvarum菌體數(shù)量開始逐漸減少并在發(fā)酵第8天消失。

圖2 模擬體系酒精發(fā)酵中提前接種（A）、同時(shí)接種（B）、純釀酒酵母（C）體系的不同酵母菌生長趨勢變化Fig.2 Evolution of different yeasts during alcohol fermentation of YPD medium in asynchronous (A), simultaneous inoculation (B), and pure S. cerevisiae (C) treatments

YPD培養(yǎng)基模擬酒精發(fā)酵過程中的各個(gè)接種處理不同酵母菌的數(shù)量變化過程見圖2。在模擬發(fā)酵體系中，H. uvarum表現(xiàn)了與在葡萄汁中相似的對(duì)比結(jié)果，H. uvarum的數(shù)量在提前接種處理中總體呈現(xiàn)增長的趨勢，且最大值達(dá)到了3.5×107CFU/mL（圖2A），而在同時(shí)接種處理中，H. uvarum的數(shù)量在開始時(shí)最大，為2.0×107CFU/mL，此后便一直呈現(xiàn)下降趨勢，并在發(fā)酵第8天消失（圖2B）。模擬發(fā)酵與葡萄汁發(fā)酵所得的相似的結(jié)果證明H. uvarum在提前接種混合發(fā)酵體系中比在同時(shí)接種混合發(fā)酵體系中存在的時(shí)間更長，數(shù)量更多，表明提前接種處理的發(fā)酵液更有潛力獲得更多的β-葡萄糖苷酶，進(jìn)而更有可能水解更多的香氣糖苷，因此具有葡萄酒增香釀造的應(yīng)用可能。

2.2 酵母菌生長動(dòng)力學(xué)

圖3A是葡萄汁酒精發(fā)酵過程中3 種接種方式的酵母菌生長動(dòng)力學(xué)曲線，模型使用發(fā)酵前5 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，后6 d未進(jìn)行擬合。圖3B是模擬體系3 種接種方式的酵母菌生長動(dòng)力學(xué)曲線。葡萄汁發(fā)酵和模擬體系發(fā)酵各個(gè)處理的酵母菌生長動(dòng)力學(xué)擬合的相關(guān)參數(shù)見表1。

圖3 葡萄汁酒精發(fā)酵（A）和模擬體系酒精發(fā)酵（B）微生物生長動(dòng)力學(xué)擬合Fig.3 Yeast growth kinetics for alcohol fermentation of grape juice (A) and YPD medium (B)

由圖3A可知，與其他兩種接種方式相比，提前接種處理差異明顯，具體表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量在接種初期增加緩慢，從第2天進(jìn)入對(duì)數(shù)期，且對(duì)數(shù)期細(xì)胞繁殖速率明顯高于另外兩個(gè)體系，第4天時(shí)進(jìn)入平衡期，在平衡期細(xì)胞最大濃度為12.6×107CFU/mL。在細(xì)胞數(shù)衰減階段，提前接種處理的衰減速率最慢，且在發(fā)酵結(jié)束后的菌體濃度大約是4.0×107CFU/mL。同時(shí)接種和純釀酒酵母發(fā)酵體系中酵母菌生長模型在發(fā)酵前3 d類似，即接種后的第2天進(jìn)入對(duì)數(shù)期，第4天進(jìn)入平衡期，差別在于平衡期兩個(gè)發(fā)酵體系的細(xì)胞最大濃度分別為12.0×107CFU/mL和10.0×107CFU/mL，平衡期后細(xì)胞基本同步衰減直至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的細(xì)胞濃度大約是1.0×107CFU/mL，明顯低于提前接種處理。結(jié)合圖1，在平衡期時(shí)提前接種處理的總酵母菌數(shù)量最多，且H. uvarum占總酵母菌數(shù)的比例大于同時(shí)接種處理的，因此提前接種處理中，H. uvarum對(duì)葡萄酒質(zhì)量的影響更大。

表1 葡萄汁與模擬體系酒精發(fā)酵酵母菌生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table1 Kinetic parameters of yeast growth during alcohol fermentation of grape juice and YPD medium

2.3 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)和底物消耗動(dòng)力學(xué)

圖4 葡萄汁酒精發(fā)酵產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)（A）和底物消耗動(dòng)力學(xué)（B）擬合圖Fig.4 Kinetics of ethanol production (A) and substrate consumption (B) during alcohol fermentation of grape juice

由圖4A可知，各處理酒精生成的最終結(jié)果相近，但累積過程差異明顯。提前接種處理的酒精累積速率最慢，在發(fā)酵開始的48 h內(nèi)，H. uvarum數(shù)量小，因而酒精的累積速率非常低，而隨著釀酒酵母的接種以及體系中總酵母菌數(shù)量的增加，酒精累積速率迅速升高并在發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最大值。由圖4B可知，還原糖消耗動(dòng)力學(xué)中同樣是提前接種處理最慢，在發(fā)酵開始的48 h內(nèi)，還原糖以微弱的速率被消耗，而隨后的2 d內(nèi)還原糖含量快速降低，此后以較為平緩的速率被消耗直到發(fā)酵結(jié)束。結(jié)合圖3中微生物群體演變規(guī)律，可以發(fā)現(xiàn)酵母菌數(shù)量的變化過程正是酒精體積分?jǐn)?shù)累積速率和還原糖消耗速率變化的直接原因。

表2是酒精生成動(dòng)力學(xué)參數(shù)擬合結(jié)果，3 個(gè)發(fā)酵體系最終擬合的最大酒精體積分?jǐn)?shù)均大約為11.5%，表明H. uvarum的接種生長并沒有顯著地影響到底物糖的代謝和產(chǎn)物酒精的生成，產(chǎn)生不良風(fēng)味副產(chǎn)物的可能性很小。

表2 酒精生成動(dòng)力學(xué)擬合參數(shù)Table2 Kinetic parameters for alcohol production

3 討 論

在葡萄酒酒精發(fā)酵過程中，采用干質(zhì)量法測定的酵母菌生長趨勢變化規(guī)律遵循典型的“S”形曲線[21]，但是自發(fā)酵平衡期末，酵母菌總數(shù)量包括活菌體和死亡菌體，死亡菌體對(duì)于酒精發(fā)酵速率沒有直接貢獻(xiàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)中愛格麗葡萄汁酒精發(fā)酵過程中酵母菌的數(shù)量變化采用WL固體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，顯示了活酵母菌在酒精發(fā)酵中的數(shù)量演變過程，有助于揭示不同接種發(fā)酵處理的發(fā)酵過程中酵母菌變化的差異，從而以此判斷優(yōu)選酵母菌株對(duì)葡萄酒質(zhì)量可能的影響。

在單一酵母菌的酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，酵母菌總數(shù)一般在第3天便達(dá)到最大值[21-22]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示酵母菌數(shù)量在第3天達(dá)到最大值。有研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母與季也蒙有孢漢遜酵母（H. guilliermondii）和異常畢赤酵母（P. anomala）的混合酒精發(fā)酵處理中，釀酒酵母在發(fā)酵第5天便占據(jù)主導(dǎo)地位，且兩種非釀酒酵母完全消失[22]。而本實(shí)驗(yàn)的接種處理中，葡萄汁有孢漢遜酵母（H. uvarum）在同時(shí)接種處理中第8天消失，但是在提前接種處理的發(fā)酵過程中一直存活，表明H. uvarum在釀酒酵母前48 h接種有助于其自身的生長繁殖和生存。

Comitini等[6]研究發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母對(duì)于發(fā)酵液中酵母菌生長動(dòng)力學(xué)的影響可能與它的細(xì)胞濃度和存活的時(shí)間有關(guān)系，當(dāng)非釀酒酵母與釀酒酵母的接種體積比是1∶1時(shí)，釀酒酵母的生長不受影響，而當(dāng)比例提高時(shí)（100∶1或者10 000∶1），非釀酒酵母就會(huì)對(duì)釀酒酵母的生長產(chǎn)生顯著的影響。本實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)接種處理和純釀酒酵母發(fā)酵體系中酵母菌生長曲線相似，同樣說明當(dāng)非釀酒酵母與釀酒酵母接種數(shù)量接近時(shí)，釀酒酵母的生長不受非釀酒酵母的影響。Yamaoka等[23]在釀酒酵母與乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）的混合發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)后者代謝產(chǎn)生的甘油、丙氨酸等物質(zhì)可以改變釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)氨基酸水平，延長其細(xì)胞生命周期。由此推斷，本實(shí)驗(yàn)提前接種處理表現(xiàn)出最高的細(xì)胞濃度以及后期較低的衰減速率和較少的衰減數(shù)量，極有可能是由于H. uvarum在發(fā)酵前期產(chǎn)生并積累了的一些物質(zhì)，使得酵母菌生長周期延長。發(fā)酵后期較高的菌群密度可以有效避免葡萄酒酒精發(fā)酵的意外終止，同時(shí)酵母菌總體中H. uvarum的高比例和更長的存活時(shí)間會(huì)提高發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶的含量，從而有利于香氣前體物質(zhì)的水解釋放。

此前有研究得出，非釀酒酵母和釀酒酵母混合酒精發(fā)酵在平衡期的酵母菌總數(shù)多于純釀酒酵母發(fā)酵的處理，但是前者的發(fā)酵速率和產(chǎn)酒精率低于后者[24-25]。研究[26]發(fā)現(xiàn)，將釀酒酵母接種到非釀酒酵母發(fā)酵一段時(shí)間的葡萄汁中，所釀葡萄酒與同時(shí)接種的混合發(fā)酵所釀葡萄酒在最終風(fēng)味產(chǎn)物上大不一樣，前者香氣更為復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)中不同酵母菌的接種處理并不影響酒精發(fā)酵的正常進(jìn)行，雖然H. uvarum提前接種處理開始的糖消耗和酒精生成率較低，但隨著酵母菌數(shù)量的增加，底物消耗和產(chǎn)物生產(chǎn)的速率與對(duì)照開始接近，最終不同接種處理的發(fā)酵過程在底物消耗量和產(chǎn)物生成量上沒有顯著差別。

以上優(yōu)選葡萄汁有孢漢遜酵母和釀酒酵母混合酒精發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)分析顯示，在酒精發(fā)酵全過程中，提前接種處理的優(yōu)選菌株生存數(shù)量最多，生存時(shí)間最長，雖然在其對(duì)數(shù)生長期酒精生成和還原糖消耗速率最慢，但整體酒精發(fā)酵正常，酒精生成量不受影響，說明優(yōu)選菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生不良?xì)馕陡碑a(chǎn)物的可能性較小，優(yōu)選菌株提前釀酒酵母48 h接種進(jìn)行混合酒精發(fā)酵具有葡萄酒增香釀造的應(yīng)用潛力。

[1] 李華, 王華, 袁春龍, 等. 葡萄酒工藝學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2007: 68-73; 165-178.

[2] ANFANG N, BRAJKOVICH M, GODDARD M R. Co-fermentation with Pichia kluyveri increases varietal thiol concentrations in Sauvignon Blanc[J]. Australian Journal of Grape and Wine Research, 2009, 15(1): 1-8. DOI:10.1111/j.1755-0238.2008.00031.x.

[3] MOREIRA N, MENDES F, HOGG T, et al. Alcohols, esters and heavy sulphur compounds production by pure and mixed cultures of apiculate wine yeasts[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 103(3): 285-294. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2004.12.029.

[4] HONG Y A, PARK H D. Role of non-Saccharomyces yeasts in Korean wines produced from Campbell Early grapes: potential use of Hanseniaspora uvarum as a starter culture[J]. Food Microbiology, 2013, 34(1): 207-214. DOI:10.1016/j.fm.2012.12.011.

[5] CHAROENCHAI C, FLEET G H, HENSCHKE P A, et al. Screening of non-Saccharomyces wine yeasts for the presence of extracellular hydrolytic enzymes[J]. Australian Journal of Grape and Wine Research, 1997, 3(1): 2-8. DOI:10.1111/j.1755-0238.1997.tb00109.x.

[6] COMITINI F, GOBBI M, DOMIZIO P, et al. Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae[J]. Food Microbiology, 2011, 28(5): 873-882. DOI:10.1016/j.fm.2010.12.001.

[7] RENAULT P, MIOT-SERTIER C, MARULLO P, et al. Genetic characterization and phenotypic variability in Torulaspora delbrueckii species: potential applications in the wine industry[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 134(3): 201-210. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2009.06.008.

[8] MOREIRA N, MENDES F, GUEDES de PINHO P P, et al. Heavy sulphur compounds, higher alcohols and esters production profile of Hanseniaspora uvarum and Hanseniaspora guilliermondii grown as pure and mixed cultures in grape must[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 124(3): 231-238. DOI:10.1016/ ijfoodmicro.2008.03.025.

[9] VIANA F, GIL J V, VALLéS S, et al. Increasing the levels of 2-phenylethyl acetate in wine through the use of a mixed culture of Hanseniaspora osmophila and Saccharomyces cerevisiae[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 135(1): 68-74. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.07.025.

[10] WANG Yuxia, XU Yan, LI Jiming. A novel extracellular β-glucosidase from Trichosporon asahii: yield prediction, evaluation and application for aroma enhancement of Cabernet Sauvignon[J]. Journal of Food Science, 2012, 77(8): 505-515. DOI:10.1111/j.1750-3841.2012.02705.x.

[11] PALOMO E S, HIDALGO D M, GONZ?LEZ M ?, et al. Aroma enhancement in wines from different grape varieties using exogenous glycosidases[J]. Food Chemistry, 2004, 92(4): 627-635. DOI:10.1016/ j.foodchem.2004.08.025.

[12] 陶永勝, 牟含, 李國, 等. 野生膠紅酵母糖苷酶水解媚麗新酒中香氣糖苷研究[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2014(12): 249-254. DOI:10.6041/ j.issn.1000-1298.2014.12.037.

[13] SADINENI V, KONDAPALLI N, OBULAM V S R. Effect of co-fermentation with Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii or Metschnikowia pulcherrima on the aroma and sensory properties of mango wine[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(4): 1353-1360. DOI:10.1007/s13213-011-0383-6.

[14] CLEMENTE J J M, MINGORANCE C L, MART?NEZ R S, et al. Influence of sequential yeast mixtures on wine fermentation[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 98(3): 301-308. DOI:10.1016/j.ijfoodchem.2004.06.007.

[15] 王華. 葡萄酒分析檢驗(yàn)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011: 113-135; 201-204.

[16] 程雷, 李梓, 王軍. 葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌的研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2010, 10(2): 131-137.

[17] 曹軍衛(wèi), 馬輝文, 張甲耀. 微生物工程[M]. 2版. 北京: 科學(xué)出版社, 2007: 167-184.

[18] 張卉. 微生物工程[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2010: 84-89.

[19] 戚以政, 汪叔雄. 生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與反應(yīng)器[M]. 3版. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2007: 54-75.

[20] 許贛榮, 胡鵬剛. 發(fā)酵工程[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2013: 127-134.

[21] WANG D, XU Y, HU J, et al. Fermentation kinetics of different sugars by apple wine yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal of the Institute of Brewing, 2004, 110(4): 340-346. DOI:10.1002/j.2050-0416.2004.tb00630.x.

[22] ROJAS V, JOSé V G, PI?AGA F, et al. Acetate ester formation in wine by mixed cultures in laboratory fermentations[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 86(1): 169-180. DOI:10.1016/ S0168-1605(03)00255-1.

[23] YAMAOKA C, KURITA O, KUBO T. Improved ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae in mixed cultures with Kluyveromyces lactis on high-sugar fermentation[J]. Microbiological Research, 2014, 168(12): 907-914. DOI:10.1016/j.micres.2014.04.007.

[24] ANDORR¤ I, BERRADRE M, ROZ?S N, et al. Effect of pure and mixed cultures of the main wine yeast species on grape must fermentations[J]. European Food Research and Technology, 2010, 231(2): 215-224. DOI:10.1007/s00217-010-1272-0.

[25] CIANI M, BECO L, COMITINI F. Fermentation behaviour and metabolic interactions of multistarter wine yeast fermentations[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 108(2): 239-245. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2005.11.012.

[26] ROMANO P, FIORE C, PARAGGIO M, et al. Function of yeast and strains in wine flavour[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 86(1/2): 169-180. DOI:10.1016/S0168-1605(03)00290-3.

Kinetics of Alcohol Fermentation by Mixed Cultures of Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae

WANG Xingchen1, HU Kai1, TAO Yongsheng1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

A strain of Hanseniaspora uvarum with high activity β-glucosidase has been isolated in our previous study. In this work we conducted a ki netic study on alcohol fermentation by mixed cultures of the isolate and Saccharomyces cerevisiae with the aim to find out the theoretical basis and technical support for the application of the strain of Hanseniaspora uvarum in winemaking for aroma enhancement. Ecolly grapes in Yangling, Shaanxi were used as raw materials for winemaking. Two treatments, inoculation of the isolate 48 h earlier than S. cerevisiae and simultaneous inoculation, were designed. The inoculation amount of the isolate was 1.0 × 106CFU/mL. The fermentation of these two treatments with YPD liquid medium as grape juice model system was also performed. The fermentation with S. cerevisiae alone was set as the control. During fermentation, the amount of different yeast strains, alcohol production and residual sugar were recorded. Then the kinetic equations were built. Results showed that, in the asynchronous inoculation treatment, the live isolate subsisted for a longer time and its amount was higher than that in the other treatment and the control. In the logarithmic period of the isolate, alcohol production and sugar consumption were both lower than those in the other treatment and the control. In addition, its alcohol fermentation was normal and the final alcohol production was the same as that in two other treatments. It could be concluded that inoculation of the isolate 48 h earlier than S. cerevisiae could show better hydrolysis of aroma precursors by β-glucosidase during winemaking, and it will have promising applications in winemaking for aroma enhancement.

Hanseniaspora uvarum; β-glucosidase; Saccharomyces cerevisiae; mixed culture fermentation; kinetics

10.7506/spkx1002-6630-201603020

TS261.4

A

1002-6630（2016）03-0103-06

王星晨, 胡凱, 陶永勝. 葡萄汁有孢漢遜酵母和釀酒酵母的混合酒精發(fā)酵動(dòng)力學(xué)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 103-108. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603020. http://www.spkx.net.cn

WANG Xingchen, HU Kai, TAO Yongsheng. Kinetics of alcohol fermentation by mixed cultures of Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae[J]. Food Science, 2016, 37(3): 103-108. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603020. http://www.spkx.net.cn

2015-09-29

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371724）

王星晨（1990—），男，碩士研究生，主要從事葡萄酒釀造技術(shù)研究。E-mail：xing-chenwang@qq.com

*通信作者：陶永勝（1977—），男，副教授，博士，主要從事葡萄酒釀造與風(fēng)味化學(xué)研究。E-mail：taoyongsheng@nwsuaf.com.cn