李一鳴，張海嫻，汪曉虹，王意達(dá)，王 怡

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海 200040

超聲促釋載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

李一鳴，張海嫻，汪曉虹，王意達(dá)，王 怡

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海 200040

目的：探究載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)及其結(jié)合超聲輻照對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。方法：分為對(duì)照組、空白納米復(fù)合凝膠組、游離紫杉醇組、載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組、超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組，分別處理C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，利用四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法檢測(cè)C6細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng)率（relative growth rate，RGR），觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果：對(duì)照組與空白納米復(fù)合凝膠組比較RGR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，含藥物的游離紫杉醇組、載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組、超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組均有明顯的細(xì)胞增殖抑制作用（P＜0.05）。與游離紫杉醇組比較，載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組RGR減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組與超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組之間RGR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)的制備材料具有良好的生物相容性，紫杉醇可明顯抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。載紫杉醇納米復(fù)合凝膠影響紫杉醇對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，具有緩釋作用，超聲輻照可促進(jìn)載紫杉醇納米復(fù)合凝膠內(nèi)藥物釋放。

超聲；納米；凝膠；紫杉醇；膠質(zhì)瘤

腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱腦腫瘤，且惡性者居多，具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，患者5年生存率＜5%，手術(shù)切除后需聯(lián)合放療和化療殺傷浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的殘留腫瘤細(xì)胞［1］。因腦組織受血-腦屏障保護(hù)，傳統(tǒng)化療藥不僅無(wú)法發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用，反而易引發(fā)系統(tǒng)毒性作用，致使腦膠質(zhì)瘤的化療受到極大限制［2］。本研究利用納米生物技術(shù)，將紫杉醇（paclitaxel，PTX）制備成由納米材料包裹修飾的載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)，提高藥物的生物穩(wěn)定性和生物利用率，實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋作用［3-4］，從而使該載藥納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)原位穩(wěn)定聚集于膠質(zhì)瘤組織周圍，成功避開血腦屏障，在減低系統(tǒng)毒性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)特異靶區(qū)持續(xù)性腫瘤殺傷作用［5］。此外，將超聲作為一種觸發(fā)條件促進(jìn)載紫杉醇納米復(fù)合凝膠內(nèi)藥物釋放，可實(shí)現(xiàn)藥物在一定程度上的無(wú)創(chuàng)控釋［6-7］。

1　資料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株由上海市腫瘤研究所贈(zèng)予，用含10%滅活胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待C6細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，加入適量新鮮培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液密度至5×104個(gè)/mL，吸取單細(xì)胞懸液180 μL加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)、分布情況、有無(wú)污染，并于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)備用。

1.2載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)的制備與特性

采用超聲乳化法制備藥物濃度為100 μg/mL的載紫杉醇納米復(fù)合凝膠（PTX-NP-GEL）。設(shè)置紫杉醇:聚合物納米材料多聚乙二醇（mPEG）-聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］投藥比為5%，普朗尼克F68:二氯甲烷油水相體積比為10∶1，應(yīng)用超聲波乳化法制備載紫杉醇納米粒溶液，強(qiáng)度400 W，脈沖超聲2 s，15次/min，60次。將溶液充分乳化后，置于西林瓶?jī)?nèi)機(jī)械攪拌使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)，即制成載紫杉醇納米粒溶液。加入普朗尼克F127粉末后，將溶液置于冰浴中12 h，待充分溶解后攪拌均勻，制成20%載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)［4，8］。用高效液相色譜法檢測(cè)載紫杉醇納米粒的包封率，Zetasizer Nano ZS90激光粒度儀檢測(cè)載紫杉醇納米粒的粒徑和表面電位，轉(zhuǎn)子法檢測(cè)載紫杉醇納米復(fù)合凝膠的膠凝時(shí)間與膠凝溫度。同樣方法制備無(wú)紫杉醇的納米復(fù)合凝膠及藥物濃度為100 μg/mL的游離紫杉醇溶液。

1.3超聲輻照

選取日本伊藤公司US-750型低頻超聲波治療儀。聲波頻率設(shè)為1 MHz，脈沖波占空比為30%，強(qiáng)度設(shè)為0.75 W/cm2，時(shí)間設(shè)為30 s。選取該超聲波治療儀L型探頭，表面涂抹耦合劑后直接作用于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)［9］。

1.4超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（CONTROL）、空白納米復(fù)合凝膠組（BLANK-NP-GEL）、游離紫杉醇組（PTX）、載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組（PTX-NPGEL）、超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組（PTXNP-GEL-US）。將96孔板劃分為4×4個(gè)小孔組成的6大板塊，每一板塊作為一組實(shí)驗(yàn)單位。將上述各組溶液用培養(yǎng)液稀釋30倍，取20 μL分別加入孔中。并按1.3條件對(duì)第5組進(jìn)行超聲輻照一次。分別于24、48、72 h進(jìn)行四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各樣品在490 nm處的吸光度（optical density，OD），按以下公式計(jì)算反映細(xì)胞存活情況的指標(biāo)——細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率（relative growth rate，RGR），分析各組實(shí)驗(yàn)干預(yù)條件對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制作用。

RGR=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié) 果

2.1載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)特性

應(yīng)用超聲乳化法成功制備藥物濃度為100 μg/mL的載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)，檢測(cè)到載紫杉醇納米粒包封率達(dá)86.5%，載紫杉醇納米粒粒徑為（204.2±84.4） nm，分散指數(shù)（polydispersition index，PDI）為0.15（圖1）。轉(zhuǎn)子法測(cè)試膠凝溫度為（35.8±2.2） ℃，膠凝時(shí)間為（263±8） s。

2.2C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

圖1　載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)粒徑檢測(cè)圖

表1　各組別細(xì)胞RGR （%）統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖2　各組別細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率（%）統(tǒng)計(jì)條形圖

各組RGR統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1、圖2。首先比較各組內(nèi)不同時(shí)間的RGR，可分為兩類：一類為對(duì)照組、空白納米復(fù)合凝膠組，表現(xiàn)為與對(duì)照組相比，空白納米復(fù)合凝膠組中細(xì)胞RGR隨時(shí)間延長(zhǎng)未發(fā)生明顯變化，表明細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)；一類為游離紫杉醇組、載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組、超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組，表現(xiàn)為隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞RGR有逐漸降低趨勢(shì)，表明細(xì)胞生長(zhǎng)持續(xù)受到抑制。然后比較組間RGR，對(duì)照組與空白納米復(fù)合凝膠組細(xì)胞RGR無(wú)顯著差異，均為100%左右。游離紫杉醇組、載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組、超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組細(xì)胞RGR比對(duì)照組顯著減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），RGR為60%～80%。此3組均加入紫杉醇，3組之間RGR也存在差異，其中游離紫杉醇組RGR減低最明顯，24 h時(shí)RGR為64%，其次為超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組，RGR為69%，最后為載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組，RGR為78%。表明納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)對(duì)藥物的抑制效果產(chǎn)生明顯影響，可降低紫杉醇對(duì)C6細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；而在載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)基礎(chǔ)上結(jié)合超聲輻照，藥物所發(fā)揮的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。

3　討 論

傳統(tǒng)化療存在藥物溶解度小、生物穩(wěn)定性差、生物利用率低、不良反應(yīng)強(qiáng)等缺陷，嚴(yán)重限制了其在抗膠質(zhì)瘤方面的應(yīng)用［2］。通過(guò)納米生物技術(shù)將抗腫瘤藥物制備成載藥納米凝膠復(fù)合系統(tǒng)被廣泛研究，該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在以下幾方面：① 本研究制備的載紫杉醇納米粒粒徑為（204.2± 84.4） nm，PDI為0.15，載藥納米粒大小達(dá)納米級(jí)別，且粒徑均勻，可保證載藥納米粒的均一性。納米級(jí)粒徑可使藥物在機(jī)體微小的空間發(fā)揮作用，跨過(guò)機(jī)體生理屏障或通過(guò)殘缺的腫瘤血管滲入腫瘤內(nèi)部，還可根據(jù)不同組織需求調(diào)節(jié)乳化條件從而調(diào)節(jié)粒徑范圍［5，10-13］。② 本研究制備的載紫杉醇納米復(fù)合凝膠包封率達(dá)86.5%，膠凝溫度為（35.8±2.2） ℃，膠凝時(shí)間為（263±8） s，高分子聚合物外殼可將抗腫瘤藥暫時(shí)隔離，提高藥物生物穩(wěn)定性，減低其非特異細(xì)胞毒性，從而在實(shí)現(xiàn)藥物靶區(qū)分布的同時(shí)減低系統(tǒng)毒性，使藥物緩釋，在靶區(qū)持續(xù)發(fā)揮作用，提高藥物利用率及抗腫瘤療效［11，14-15］。③ 載藥納米凝膠系統(tǒng)可由溫度、壓力、pH值、超聲等條件觸發(fā)釋放其內(nèi)部藥物。超聲波作用于載藥納米復(fù)合凝膠可產(chǎn)生空化效應(yīng)，產(chǎn)生的能量激發(fā)生成的自由基斷離聚合物連接鍵，使載藥納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)釋放其內(nèi)包裹的藥物［9］。本研究是將超聲波作為體外觸發(fā)條件來(lái)探究藥物靶向局部促釋。

應(yīng)用細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定藥物及其他處理方式對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的毒性，并測(cè)定細(xì)胞增殖情況與活性。應(yīng)用MTT法處理各組細(xì)胞并檢測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞RGR，可反映細(xì)胞存活情況，進(jìn)而反映載紫杉醇納米復(fù)合系統(tǒng)及其在超聲輻照后所起的作用。統(tǒng)計(jì)組內(nèi)24、48、72 h時(shí)RGR差異發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與空白納米復(fù)合凝膠組RGR隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯差異，表明空白納米復(fù)合凝膠組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與對(duì)照組相仿，兩組細(xì)胞均處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)，納米復(fù)合凝膠對(duì)細(xì)胞無(wú)殺傷作用；游離紫杉醇組、載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組、超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組RGR隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此3組均加入藥物紫杉醇，表明紫杉醇抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用是持續(xù)性的，且隨時(shí)間延長(zhǎng)越發(fā)明顯。統(tǒng)計(jì)組間RGR差異發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與空白納米復(fù)合組24、48、72 h的RGR均在95%以上，且兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明制備納米復(fù)合凝膠所采用的聚合物mPEG-PLGA及普朗尼克F68、F127對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯殺傷作用，兩者有較好的生物相容性；包含藥物的游離紫杉醇組、載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組、超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組RGR在47%～78%之間，與對(duì)照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），表明C6細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感，紫杉醇可作為抗膠質(zhì)瘤的化療藥；24、48、72 h時(shí)載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組與超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3個(gè)時(shí)間段內(nèi)游離紫杉醇對(duì)細(xì)胞的殺傷作用比載紫杉醇納米復(fù)合凝膠強(qiáng)，表明載藥納米復(fù)合凝膠對(duì)藥物的殺傷作用有影響，載藥納米凝膠對(duì)包裹其中的紫杉醇起暫時(shí)隔離作用，從而產(chǎn)生相應(yīng)的緩釋作用，故可應(yīng)用該特征建立靶區(qū)特異性持久抗膠質(zhì)瘤藥物模型。在載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組基礎(chǔ)上進(jìn)行超聲輻照，RGR有所下降，且載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組與超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠組24、48、72 h時(shí)RGR差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明超聲輻照增強(qiáng)了紫杉醇對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，超聲促使載紫杉醇納米凝膠內(nèi)藥物更快地釋放，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

以上結(jié)果表明，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感，紫杉醇對(duì)其殺傷作用明顯，因此紫杉醇可作為一種抗膠質(zhì)瘤的化療藥。制備載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)的主要原料高分子聚合物mPEGPLGA及普朗尼克F127、F68對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯殺傷作用，有較好的生物相容性。載藥納米復(fù)合凝膠形式影響藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，與游離紫杉醇相比，載紫杉醇納米復(fù)合凝膠具有較好的緩釋作用，超聲輻照能增強(qiáng)載紫杉醇納米復(fù)合凝膠內(nèi)藥物釋放速度，從而影響藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。因此，應(yīng)用超聲輻照載紫杉醇納米復(fù)合凝膠系統(tǒng)抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)藥物緩釋結(jié)合藥物促釋，為實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤體外無(wú)創(chuàng)個(gè)體化治療打下基礎(chǔ)。

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Paclitaxel-loaded nanoparticle gel system combined with ultrasonic irradiation inhibits growth of rat C6 glioma cells

LI Yiming， ZHANG Haixian， WANG Xiaohong， WANG Yida， WANG Yi （Department of Ultrasound， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）
Correspondence to: WANG Yi E-mail: y_wang1111@hotmail.com

Objective: To observe the inhibitory effects of paclitaxel （PTX）-loaded nanoparticle （NP） gel system combined with ultrasonic irradiation on the growth of C6 glioma cells. Methods: Five groups were set up: Control， BLANK-NP-GEL， PTX，PTX-NP-GEL and PTX-NP-GEL-US. They were administered to C6 glioma cells respectively. The relative growth rate （RGR） of cells was detected by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） method， and the inhibitory effects on the growth of C6 glioma cells were observed. Results: The nano materials had no obvious inhibitory effects on cell proliferation. Paclitaxel could obviously inhibit cell proliferation compared to control group （P＜0.05）. There were significant differences in RGR among PTX， PTX-NP-GEL and PTXNP-GEL-US groups （P＜0.05）. Conclusion: The selected nanoparticle gel system materials have fine biocompatibility. Paclitaxel can inhibit the growth of C6 glioma cells. The paclitaxel-loaded nanoparticle gel system has sustained release effect， and ultrasonic irradiation can promote drug release.

Ultrasound； Nano； Gel； Paclitaxel； Glioma

R445.1

A

1008-617X（2016）03-0243-05

王怡 E-mail：y_wang1111@hotmail.com

（2016-09-03）