鞠丹 胡安妮 張杰 張凌云

（北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

青杄PwRbcS 基因克隆及對(duì)逆境響應(yīng)分析

鞠丹 胡安妮 張杰 張凌云

（北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

RbcS基因編碼了植物光合作用中核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶的亞基，這種酶能催化二氧化碳的固定和碳氧化兩者之間競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中通過RACE-PCR方法成功獲得了青杄RbcS的cDNA全長(zhǎng)，對(duì)PwRbcS的cDNA序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定青杄各個(gè)組織及非生物脅迫下PwRbcS的表達(dá)水平。結(jié)果表明：PwRbcS基因cDNA全長(zhǎng)936 bp，編碼區(qū)共552 bp，共編碼186個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)分子量為20.712 6 kD，等電點(diǎn)為9.07。組織特異性表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PwRbcS該基因主要在葉片中表達(dá)，且成熟葉表達(dá)量最高。非生物脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ABA 和NaCl以及低溫處理處理下響應(yīng)十分明顯。在NaCl處理下，表達(dá)量先上升后下降，處理6 h時(shí)達(dá)到對(duì)照的14倍，施加ABA時(shí)，在處理8 h時(shí)上升至對(duì)照的24倍，低溫脅迫下，表達(dá)量先上升后下降，6 h達(dá)到對(duì)照的12倍，而高溫脅迫及PEG（polyethylene glycol）下表達(dá)量變化不明顯。因此PwRbcS作為一個(gè)在木本植物青杄中發(fā)現(xiàn)的新的RbcS基因，可能在青杄逆境響應(yīng)中行使一定的功能。

Picea wilsonii；RbcS；生物信息學(xué)分析；組織表達(dá)；脅迫響應(yīng)

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.019

RbcS是編碼核酮糖1，5-磷酸羧化酶（Rubisco）小亞基的基因，這種酶能催化二氧化碳的固定和碳氧化間競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)［1］，其活性是限制這兩個(gè)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)速率的關(guān)鍵因素［2］。Rubisco蛋白是由大亞基和小亞基組成，小亞基能調(diào)控大亞基的表達(dá)［3］。對(duì)于不同的物種來說，編碼小亞基（RbcS）的基因家族成員個(gè)數(shù)和類型存在一定差異，有2-22個(gè)不等［4-7］。RbcS家族中不同成員基因的表達(dá)情況受多種因素的影響，如物種，組織器官類型等［7-9］。RbcS 基因的總轉(zhuǎn)錄水平與 Rubisco蛋白的含量具有高度相關(guān)性［7，10］。Rubisco蛋白的活性主要受大亞基調(diào)控，但其多個(gè)小亞基對(duì)于蛋白活性也有一定的影響［11-13］。前人研究發(fā)現(xiàn) RbcS 基因?qū)Νh(huán)境的變化有一定的響應(yīng)。當(dāng)降低光照強(qiáng)度時(shí)，黃瓜葉片中 RbcS 的轉(zhuǎn)錄水平和 Rubisco總蛋白活性都呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)［14］。外源性的施加 ABA 或者萎蔫脅迫下時(shí)，擬南芥中rbcS 的轉(zhuǎn)錄水平均表現(xiàn)為下降，4℃脅迫處理 4 h時(shí)rbcS的表達(dá)量會(huì)上升［15］。大豆Rbcs基因含有3個(gè)不同成員，對(duì)水楊酸、鹽脅迫和干旱處理均具有明顯的響應(yīng)。但不同濃度的水楊酸和NaCl 處理對(duì)Rbcs基因的轉(zhuǎn)錄有不同程度的影響［16］。在煙草中轉(zhuǎn)入天山雪蓮sikRbcs2 基因提高了煙草對(duì)于低溫的耐受性［17］。說明RbcS基因表達(dá)調(diào)控與植物抗逆性有一定的關(guān)聯(lián)。

青杄（Picea wilsonii）屬于松科（Pinaceae）云杉屬（Picea）多年生木本針葉樹種，在干旱、陰冷等惡劣環(huán)境中具有較強(qiáng)的適應(yīng)和生存能力。由于木本植物的生活史長(zhǎng)且遺傳背景復(fù)雜，對(duì)于針葉樹種進(jìn)行的生物學(xué)研究比較少。本研究通過RACE-PCR的方法，克隆PwRbcS基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分析PwRbcS的分子組成和理化性質(zhì)，并且預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等。同時(shí)利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其在青杄不同組織中的表達(dá)情況，以及在ABA、NaCl、PEG、冷熱等處理下PwRbcS的表達(dá)情況，旨在為林木中RbcS基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，為篩選優(yōu)質(zhì)的林木基因以及林木遺傳育種等提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

本實(shí)驗(yàn)中以青杄（Picea wilsonii Mast）莖、針葉（幼葉和成熟葉）、花粉、種子、果實(shí)以及12周大的青杄幼苗作為實(shí)驗(yàn)材料，其中花粉、種子、果實(shí)采于中國(guó)科學(xué)院北京植物所植物園。成熟葉（多年生青杄的多年生針葉）、幼葉（多年生青杄的一年生針葉）、莖（多年生青杄的多年生莖）采于北京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。青杄種子春化后，置于濕潤(rùn)的濾紙上，在種子萌發(fā)后，將其移栽到濕潤(rùn)的草炭土與珍珠巖（體積比為1∶1）混合基質(zhì)，培養(yǎng)幼苗的溫室相對(duì)濕度為60%-70%，日照時(shí)間為16 h。生長(zhǎng)至12周、長(zhǎng)勢(shì)一致的青杄幼苗用于脅迫及激素響應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1青杄PwRbcS全長(zhǎng)cDNA的獲得及PwRbcS基因的克隆

1.2.1.1全長(zhǎng)cDNA的獲得 通過RACE-PCR的方法，根據(jù)前期構(gòu)建好的青杄均一化cDNA文庫［18］，從 pDONR222載體和分析獲得的PwRbcS的EST序列設(shè)計(jì)RACE引物，分別使用引物5'RACE-F和5'RACE-R擴(kuò)增5'方向獲得5'PCR產(chǎn)物，使用3'RACE-F和3'RACE-R擴(kuò)增 3'方向的序列獲得3'PCR產(chǎn)物（表1）。通過膠回收構(gòu)建到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌測(cè)序后獲得PwRbcS 的末端序列，與EST序列拼接后獲得PwRbcS全長(zhǎng)cDNA序列。

表1　RACE-PCR與RT-qPCR所用的引物

1.2.1.2PwRbcS基因的克隆 取正常生長(zhǎng)的12周大青杄幼苗5株，按照艾德萊生物公司植物RNA提取試劑盒的操作方法獲得青杄的總RNA，利用天根生化科技的cDNA 第1條鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA模板備用。

將RACE-PCR獲得的cDNA序列全長(zhǎng)，利用DNAMAN6.0軟件導(dǎo)入，分析獲得PwRbcS的編碼區(qū)序列，分別從其編碼區(qū)的兩端設(shè)計(jì)克隆引物RbcS-F，RbcS-R。利用引物RbcS-F和RbcS-R（表1），青杄的cDNA模板，通過PCR克隆得到PwRbcS的CDS序列，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物通過膠回收，構(gòu)建于pEASY-T1載體上保存。

1.2.2生物信息學(xué)分析 將PwRbcS的cDNA全長(zhǎng)導(dǎo)入到DNAMAN軟件，通過軟件上的翻譯功能推導(dǎo)出PwRbcS的ORF，并進(jìn)一步將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；通過NCBI上的BLAST功能找出同源序列，運(yùn)用ClustalX軟件將同源的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA5.0軟件中的鄰連法（Neighbourjoining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstap檢測(cè)次數(shù)為1 000次；利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫對(duì)目的基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；蛋白的理論等電點(diǎn)與分子量利用ExPASy中的Compute pI/Mw工具來計(jì)算；用Prot-Scale和TMHMM工具進(jìn)行疏水性分析和預(yù)測(cè)該蛋白是否存在跨膜結(jié)構(gòu)；利用GOR4和 SWISS-MODEL在線分析工具二、三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)。

1.2.3組織特異性表達(dá)及脅迫響應(yīng)實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1組織特異性表達(dá) 實(shí)驗(yàn)中分別提取莖、幼葉、成熟葉、花粉，果實(shí)、種子的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第1條鏈，將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板濃度調(diào)整一致后在Step One Plus Real Time RT-PCR 儀器上進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)PwRbcS基因在不同組織的相對(duì)表達(dá)量。其中提取RNA的試劑盒采用的是艾德萊生物公司的植物RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（cDNA 第1條鏈合成試劑盒）和熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green SuperReal Premix）均購(gòu)于天根公司。用于RT-qPCR的引物分別為RbcSRT-F和RbcS-RT-R（表1），實(shí)驗(yàn)中以青杄的EF1-α-F和EF1-α-R作為內(nèi)參基因［19］，實(shí)驗(yàn)程序采用兩步法：95℃ 15 min；95℃ 3 s，60℃ 30 s，循環(huán)次數(shù)為40次。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.3.2逆境脅迫及激素響應(yīng)實(shí)驗(yàn) 逆境處理和激素響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中采用12周大正常生長(zhǎng)的青杄幼苗，實(shí)驗(yàn)方法具體參照［20-23］，處理濃度和時(shí)間略有改動(dòng)。實(shí)驗(yàn)中使用的處理溶液包括100 μmol/L ABA溶液、200 mmol/L NaCl溶液，20% PEG 4000溶液，溫度逆境脅迫中主要采用了4℃、42℃處理，對(duì)照為水處理的植株。實(shí)驗(yàn)方法是將12周苗齡的青杄幼苗根浸入處理溶液，實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間為0、2、4、6、8和12h，處理后的青杄幼苗置于液氮中速凍，于 -80℃保存，用于響應(yīng)實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.3.3數(shù)據(jù)處理方法 組織特異性表達(dá)，逆境脅迫以及激素響應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖均采用Microsoft Excel 2007，數(shù)據(jù)處理使用SPSS19.0軟件，差異顯著性分析使用方法為單因素方差分析，多重比較方法為L(zhǎng)SD（Least-significant difference）法。

2　結(jié)果

2.1青杄PwRbcS全長(zhǎng)cDNA的獲得

以青杄的cDNA為模板，利用青杄EST序列分析庫中PwRbcS的EST序列和pDONR222 載體兩端設(shè)計(jì)特異引物分別進(jìn)行5'端和3'端的RACE-PCR。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過膠回收，連接pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌送去測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果序列與EST序列進(jìn)行比對(duì)和拼接，得到青杄PwRbcS全長(zhǎng)cDNA。結(jié)果（圖1）表明PwRbcS基因cDNA全長(zhǎng)936 bp，編碼區(qū)共552 bp，共編碼186個(gè)氨基酸。在11 bp處出現(xiàn)起始密碼子ATG，在560 bp處出現(xiàn)終止密碼子TAA，911 bp處為Poly（A）26尾巴。

2.2生物信息學(xué)分析

2.2.1功能結(jié)構(gòu)域分析 在NCBI網(wǎng)站上輸入PwRbcS的氨基酸序列，進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖2-A）顯示，青杄PwRbcS蛋白具有Rubis-CO small family典型的結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其屬于RbcS家族的一類蛋白。

2.2.2理化性質(zhì)分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) PwRbcS全長(zhǎng)936 bp，11 bp發(fā)現(xiàn)起始密碼子ATG，在560 bp處發(fā)現(xiàn)終止子TAA，總共編碼186個(gè)氨基酸。由ProParam工具預(yù)測(cè)理論分子質(zhì)量（Molecular weight）為20.712 6 kD，理論等電點(diǎn)pI為9.07。蛋白質(zhì)分子式為C926H1423N251O270S10，帶有正電氨基酸殘基（Arg+Lys）22個(gè)，負(fù)電氨基酸殘基（Asp+Glu）16個(gè)，預(yù)測(cè)其半衰期大約為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為33.79，低于閾值數(shù)40，預(yù)測(cè)該蛋白穩(wěn)定。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)位于PwRbcS的第12、17、24、44、124位有5個(gè)絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)，有3個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。ProtScale分析蛋白質(zhì)的疏水性指數(shù)為-5.49，表明該蛋白為親水性蛋白（圖2-B）。蛋白無序化分析顯示，有一處無序化序列，在28-76氨基酸處，預(yù)測(cè)該蛋白的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)較強(qiáng)，蛋白在行使功能時(shí)構(gòu)象易發(fā)生變化（圖2-C）。TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果不存在跨膜區(qū)域。

采用GOR4軟件預(yù)測(cè)PwRbcS的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白中α-螺旋，占總體的17.49%，無規(guī)則卷曲占55.19%，延伸鏈中占27.32%，無β-折疊結(jié)構(gòu)（圖2-D）。SWISS-MODEL工具預(yù)測(cè)得到該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2-E）。

圖1　PwRbcS基因的cDNA全長(zhǎng)及其編碼的氨基酸序列

2.2.3多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹 根據(jù)PwRbcS的cDNA序列推導(dǎo)其氨基酸序列，在NCBI上利用在線數(shù)據(jù)庫Blast其同源序列，得出PwRbcS同源性蛋白包括：美洲落葉松（LlRbcS，X54464）、日本黑松（PtRbcS，X13408）、海岸松（PpRbcS，AJ309096）、北美紅杉（SsRbcS，AY048671）、高粱（SbRbcS，AB564718）、玉米（ZmRbcS，NP_001105294）、燕麥（AvRbcS，AF104249；AcRbcS，AF192776；Am-RbcS，AF192779）、馬蹄蓮（ZaRbcS，AF034479）、黃瓜（CsRbcS，M16056）、擬南芥（AtRBCS1A、At1g67090、AtRBCS1B、At5g38430；AtRBCS2B，At5g38420）、黃菊（AvRbcS，AF104249）等。通過CLUSTAL X和Esprit 3.0軟件將PwRbcS的氨基酸序列與以上同源性較的蛋白氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果（圖3）表明，RbcS蛋白在進(jìn)化上相對(duì)保守，與其同源性較高的物種有美洲落葉松（Larix laricina）、海岸松（Pinus pinaster）這些親緣關(guān)系較近的松科物種，相似度分別是93%和90%，而與擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的RBCS蛋白的同源性相較低，相似度在60%左右。

2.3青杄PwRbcS表達(dá)分析

2.3.1組織特異性表達(dá)實(shí)驗(yàn) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析PwRbcS基因在不同組織器官中的表達(dá)量，結(jié)果（圖4）顯示PwRbcS主要在葉片中表達(dá)，并且在不同葉齡的針葉中的表達(dá)量變化很大。在幼葉中的表達(dá)量約為莖的15倍，而在成熟葉中表達(dá)量更高，約為莖中的25倍。

2.3.2對(duì)NaCl和PEG處理響應(yīng) 在200 mmol/L NaCl溶液處理下，PwRbcS的表達(dá)量表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)，在6 h達(dá)到表達(dá)量的高峰，表達(dá)量大約是對(duì)照的14倍。在8 h和12 h時(shí)表現(xiàn)為持續(xù)下降，在12 h基因的表達(dá)量大約為對(duì)照的5倍。用20% PEG4000（V/V）處理2 h后，表達(dá)量已經(jīng)上升到對(duì)照的1.8倍，處理4 h時(shí)表達(dá)量上升至第一個(gè)高峰，表達(dá)量約為對(duì)照的2.2倍，隨后基因的表達(dá)量在6 h、8 h出現(xiàn)持續(xù)的下降，在8 h時(shí)PwRbcS的表達(dá)量已經(jīng)下降到對(duì)照的0.7倍左右，在處理12 h時(shí)，表達(dá)量出現(xiàn)回升至2.3倍左右（圖5）。

圖2　PwRbcS蛋白理化分析及二級(jí)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.3溫度脅迫處理 低溫脅迫處理青杄幼苗，PwRbcS的表達(dá)量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在處理6 h 時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最大值，約為對(duì)照組的12倍。之后表達(dá)量持續(xù)下降，在處理12 h后表達(dá)量為對(duì)照的4倍左右（圖6）。高溫脅迫（42℃）處理下，在處理4 h后，表達(dá)量逐漸上升至對(duì)照1.7倍左右，之后表達(dá)量下降至對(duì)照水平，處理12 h后表達(dá)量回升至對(duì)照的1.6倍左右。

圖3　PwRbcS蛋白多序列比對(duì)（A）及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（B）

圖4　PwRbcS在青杄各組織中的表達(dá)情況

圖5　NaCl（A）及PEG（B）處理下PwRbcS表達(dá)量變化

2.3.4激素脅迫及水對(duì)照響應(yīng) 100 μmol/L的ABA處理青杄幼苗時(shí)該基因的表達(dá)量變化十分明顯（圖7）。在處理0、2、4、6 h 表達(dá)量幾乎沒有變化，最高表達(dá)量（6 h）也只達(dá)到對(duì)照的2倍左右。但在處理8 h時(shí)，PwRbcS的表達(dá)量急劇上升至對(duì)照的24倍左右，并且在處理12 h 時(shí)表達(dá)量急劇下降至對(duì)照水平。水對(duì)照處理下，該基因表達(dá)量差異不顯著，顯示本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

圖6　溫度脅迫下PwRbcS基因的表達(dá)量變化

3　討論

基于準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的RACE-PCR的方法［24］，本研究獲得了PwRbcS的cDNA全長(zhǎng)。結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)936 bp，編碼區(qū)共552 bp，共編碼186個(gè)氨基酸。青杄PwRbcS蛋白具有RubisCO small family典型的結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其屬于RbcS家族的一類蛋白。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得出，該基因在進(jìn)化上相對(duì)保守，與北美落葉松，黑松等親緣關(guān)系較近的松科類植物，相似度都在85% 以上。前人研究表明Rubisco蛋白與光合、呼吸作用關(guān)系緊密［1］，并且參與了植物抗逆、衰老等多種生理過程［15-17，25］。PwRbcS是青杄中Rubisco蛋白的一個(gè)小亞基，通過組織特異表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該基因主要是在青杄的針葉中表達(dá)，并且與幼葉相比，成熟葉片中的表達(dá)量明顯更高，這與前人在水稻、擬南芥中的研究結(jié)果［7-9］相似。盡管青杄作為多年生木本植物，而擬南芥、水稻是一年生的草本植物，在植物類型上差異較大但組織特異性表達(dá)結(jié)果具有相似性可能與其催化光合作用二氧化碳的固定和呼吸作用碳氧化兩者之間競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的功能上的相似性緊密相關(guān)。

圖7　ABA（A）以及H2O（B）處理下PwRbcS的表達(dá)量變化

葉片作為植物光合呼吸作用的重要器官，在植物正常生長(zhǎng)以及響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。RbcS基因主要在葉片中表達(dá)，前人對(duì)于該基因是否參與植物抗逆過程的研究主要集中在擬南芥、黃瓜和大豆等模式植物，且研究發(fā)現(xiàn)該基因?qū)τ诠庹諒?qiáng)度、溫度及干旱等脅迫均有一定響應(yīng)［15-17］。我們的研究結(jié)果與這些模式植物相似，在青杄中該基因?qū)τ谶@些非生物脅迫均有較明顯的響應(yīng)。在NaCl處理下，處理6 h表達(dá)量上升到對(duì)照的14倍，ABA處理后，PwRbcS基因的表達(dá)量在處理的前期，即0-6 h內(nèi)幾乎沒有太大變化，而在處理8 h時(shí)出現(xiàn)急劇的上升現(xiàn)象。低溫脅迫下，表達(dá)量表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)，最高時(shí)是對(duì)照組的12倍左右。結(jié)果預(yù)示該基因參與了多種非生物脅迫響應(yīng)過程，并且對(duì)于不同的非生物脅迫，基因響應(yīng)的時(shí)間和模式存在差異。前人研究在煙草中轉(zhuǎn)入天山雪蓮的sikRbcs2基因明顯提高了對(duì)低溫脅迫的耐受性［17］，基于研究對(duì)象青杄中的PwRbcS基因?qū)τ诙喾N非生物脅迫均有一定的響應(yīng)，我們推測(cè)該基因可能參與到了植物多種抗逆響應(yīng)過程，但是該基因能否提高植物的抗逆能力，以及其參與抗逆反應(yīng)的信號(hào)途徑和調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步將PwRbcS基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥及煙草等進(jìn)一步驗(yàn)證，以期為該基因在植物中的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

從青杄cDNA文庫中成功克隆出核酮糖1，5-二磷酸羧化加氧酶的小亞基編碼基因PwRbcS。組織特異性表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PwRbcS基因主要在葉片中表達(dá)，且成熟葉表達(dá)量最高。非生物脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該基因參與了多種非生物逆境脅迫反應(yīng)包括ABA、NaCl及低溫處理。對(duì)于高溫脅迫及PEG處理表達(dá)量變化則不十分明顯。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Stress Response Analysis of PwRbcS in Picea wilsonii

JU Dan HU An-ni ZHANG Jie ZHANG Ling-yun
（Key Laboratory of Forestry Silviculture and Conservation of the Ministry of Education，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

RbcS gene encodes a subunit of nuclear plant photosynthesis 1，5 two ribulose bisphosphate carboxylase / oxygenase. In this study，PwRbcS cDNA was obtained using RACE -PCR method. Bioinformatics analysis and real-time PCR technique were used to determine the relative expression of PwRbcS. The results showed that the full-length of PwRbcS cDNA was 936 bp，including the ORF of 552 bp encoding 186 amino acids. The theoretical molecular weight of PwRbcS is 20.712 6 kD and the pI value was 9.07. RT-qPCR showed that PwRbcS is mainly expressed in the needles，especially in mature needles. The expression of PwRbcS changed obviously under the treatment of NaCl，ABA and low temperature，respectively. After NaCl treatment，the expression level of PwRbcS changed significantly，reaching to 14 times than the control at 6 h. The expression level of PwRbcS reached to 24 times than the control after 8 h-ABA-treatment. And under low temperature stress，the expression increased gradually to 12 times than the control and followed by a drop，while under high temperature and PEG stress expression level did not change significantly. Therefore，PwRbcS may play an important role during abiotic stresses in planta.

Picea wilsonii；RbcS；bioinformatics；tissue expression；stress response

2016-07-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270663），國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2014ZX08009003-002-004）

鞠丹，女，碩士研究生，研究方向：植物抗逆基因克隆和功能研究；E-mail：1542283723@qq.com

張凌云，女，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物生殖與逆境生理；E-mail：lyzhang@bjfu.edu.cn