劉晶晶 程春玲 席玉珍 魏書

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036）

煙草NtWRKY40在植物應(yīng)答病毒侵染過程中的作用

劉晶晶 程春玲 席玉珍 魏書

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036）

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在植物的抗病、抗逆反應(yīng)中具有重要功能。已有研究表明，煙草花葉病毒（TMV）的侵染顯著地誘導(dǎo)煙草NtWRKY的表達(dá)，有必要進(jìn)一步探明該基因在植物應(yīng)答病毒侵染過程中的作用。采用PCR的方法克隆獲得NtWRKY cDNA，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該基因?qū)儆赪RKY Ⅱa 亞族成員，與絨毛狀煙草NtoWRKY40高度同源，命名為NtWRKY40。以此建立了過表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因煙草，并以TMV為毒源進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因煙草和野生煙草的侵染實(shí)驗(yàn)，以觀察NtWRKY40在煙草應(yīng)答病毒侵染過程中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生煙草在TMV侵染后9 d，NtWRKY40的表達(dá)量顯著升高，而NtWRKY40過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草在病毒侵染后，病毒相關(guān)基因的表達(dá)高于野生型對照，與染病程度成正相關(guān)，說明過表達(dá)NtWRKY40增加了植株對病毒的敏感性，該基因?yàn)樨?fù)調(diào)控因子。此外，為探索應(yīng)用人工miRNA的抗病毒技術(shù)，以煙草天然miR167前體為骨架、馬鈴薯Y病毒（PVY）外殼蛋白基因的一段反向互補(bǔ)序列為成熟序列，構(gòu)建了amiR167-PVY植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，以抑制PVY。對amiRNA轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗病毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，amiR167-PVY能夠部分抑制病毒基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株具有一定的抗病毒能力。

煙草花葉病毒；馬鈴薯Y病毒；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；人工miRNA；抗病毒

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.023

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）均為RNA病毒，寄主廣泛，可危害煙草、馬鈴薯、番茄和辣椒等多種茄科作物，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［1］。

WRKY（WRKY transcription factors，WRKY TFs）等多種轉(zhuǎn)錄因子參與植物對生物逆境的防衛(wèi)［2］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基端包含保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域約含有60個(gè)氨基酸，由1個(gè)七肽WRKYGQR序列和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成，WRKY結(jié)構(gòu)域能夠與靶基因啟動子上的W-box元件［（C/T）TGAC（C/T）序列］特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對靶基因的調(diào)控作用［3］。根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)特征，將WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族分為類型I、IIa+ IIb、IIc、IId+IIe和III［4］。在擬南芥中的研究表明，WRKY40是一個(gè)負(fù)調(diào)控植物白粉病抗性的轉(zhuǎn)錄因子，它的表達(dá)會抑制抗病信號通路EDSl和抗病物質(zhì)亞麻薺素（camalexin）的合成［5］。在煙草中過表達(dá)苜蓿的WRKY基因，能夠顯著誘導(dǎo)NtPR2（endo-1，3-beta-glucanase）基因的表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對煙草花葉病毒抗性反應(yīng)［6］。在煙草中，WRKY8與植物的免疫相關(guān)［7，8］，WRKY3和WRKY6參與JA（茉莉酸）信號調(diào)控的防御反應(yīng)，將這兩個(gè)基因單獨(dú)或同時(shí)沉默，茉莉酸的合成顯著下降，加重?zé)煵萏於甑那趾Γ?］。也有報(bào)道指出，煙草的WRKY1和WRKY2基因能夠迅速響應(yīng)機(jī)械損傷和真菌侵害［10，11］。研究表明，病原物相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫（PTI）和效應(yīng)子觸發(fā)的免疫（ETI）可以誘導(dǎo)大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，例如煙草的WRKY7、8、9、11［12］。我們曾發(fā)現(xiàn)，當(dāng)煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）和黃瓜花葉病毒（Cucu-mber mosaic virus，CMV）侵染普通煙草后，煙草幼葉的一種WRKY基因的表達(dá)激增［13］。因此，進(jìn)一步研究該基因在煙草應(yīng)答病毒侵染過程中的作用，對闡明植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其作用機(jī)制具有重要作用。

近年來發(fā)展的人工miRNA（artificial miRNA，amiRNA）的技術(shù)，以生物體內(nèi)源miRNA前體作為天然骨架，以人為選定的靶基因的特定片段取代天然miRNA成熟序列，構(gòu)建amiRNA以達(dá)到抑制生物體內(nèi)靶基因表達(dá)的目的，實(shí)現(xiàn)特定基因的沉默，特別是用于共同抑制多個(gè)基因的表達(dá)［14，15］。這種技術(shù)以其特異性、高效性受到了普遍的關(guān)注，在動植物代謝工程、生長發(fā)育調(diào)控以及抵抗外源病毒等方面起著重要的作用［16］。但是由于難以明確所有amiRNA在體內(nèi)都能按預(yù)期被加工產(chǎn)生而具有顯著的抑制功能。因此，有必要對相關(guān)因素進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

為此，本研究在克隆獲得NtWRKY cDNA之后，建立該基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草，并以TMV為毒源，以明確該基因在煙草應(yīng)答病毒侵染過程中的作用。此外，為探索應(yīng)用人工miRNA的抗病毒技術(shù)，以煙草天然miR167e前體為骨架、PVY病毒外殼蛋白基因的一段反向互補(bǔ)序列為成熟序列，構(gòu)建35S啟動子驅(qū)動的植物表達(dá)載體35S∷amiRNA-PVY并轉(zhuǎn)化煙草，以抑制PVY病毒，旨在為植物基因表達(dá)的調(diào)控及其應(yīng)用技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料 實(shí)驗(yàn)所用煙草品種為云煙85，為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的無菌苗。

1.1.2病毒材料 煙草花葉病毒（TMV）和馬鈴薯Y病毒普通株系（PVYO系）繁殖并保存于云煙草85上，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)江彤副教授提供。

1.2方法

1.2.1DNA提取 煙草葉片DNA的提取采用CTAB法，DNA樣品經(jīng)RNase I 酶（TaKaRa）處理以去除RNA污染。DNA濃度用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（Thermo）測定。

1.2.2RNA提取及cDNA的合成 煙草葉片總RNA（Total RNA）和小RNA（Small RNA）提取分別使用RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa）和RNAiso Plus for Small RNA試劑盒（TaKaRa）并按使用說明提取?？俁NA樣品經(jīng)DNase I 酶（TaKaRa）處理以去除DNA污染。RNA濃度用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（Thermo）測定，RNA的完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。cDNA第一鏈合成分別使用PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa）和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit（TaKaRa）并按說明書進(jìn)行。

1.2.3生物信息學(xué)分析 在擬南芥信息資源網(wǎng)站TAIR上下載擬南芥WRKY家族的部分基因編碼蛋白的序列，包括AtWRKY1（AT2G04880）、AtWRKY4（AT1G13960）、AtWRKY6（AT1G62300）、AtWRKY9（AT1G68150）、AtWRKY10（AT1G55600）、AtWRKY14（AT1G30650）、AtWRKY15（AT2G23320）、AtWRKY17（AT2G24570）、AtWRKY36（AT1G69810）、AtWRKY40（AT1G80840）、AtWRKY56（AT1G64000）、AtWRKY57（AT1G69310）、AtWRKY60（AT2G25000）、AtWRKY61（AT1G18860）、AtWRKY63（AT1G66600）、AtWRKY64（AT1G66560）、AtWRKY65（AT1G29280）、AtWRKY67（AT1G66550）、AtWRKY71（AT1G29860），在NCBI數(shù)據(jù)庫下載其他植物WRKY家族基因編碼蛋白的序列，其中包括棉花的GhWRKY1（KF669831）、GhWRKY2（KF669759）、GhWRKY3（KF669771）、GhWRKY4（KF669822）、GhWRKY5（KF669781）、GhWRKY12（KF669853）、GhWRKY19（KF669784）、GhWRKY34（KF669842）、GhWRKY40（AGX24945.1），大豆的GmWRKY25（ABS18427.1）、GmWRKY40（ABC26914.1）、GmWRKY53（ABC26915.1）。運(yùn)用MEGA5.10 軟件基于鄰位歸并法（NJ 法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

運(yùn)用DNAMAN軟件，對普通煙草（Nicotiana tobacum）NtWRKY40（AB024510.1）、絨毛狀煙草（N. tomentosiformis）NtoWRKY40（XM_009612054.1），美花煙草（N. sylvestris）NsWRKY40（XM_0097821 27.1）和番茄（Solanum lycopersicum）SlWRKY40（NM_001317914.1）進(jìn)行多重序列比對。應(yīng)用WoLF PSORT（http：//wolfpsort.org/）在線軟件對NtWRKY40進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.4質(zhì)粒的構(gòu)建 以煙草cDNA為模板，NtWRKY40基因上下游引物進(jìn)行克隆，獲得煙草NtWRKY40基因全長序列，通過引物上的Xba I和Sac I酶切位點(diǎn)，連接到植物雙元表達(dá)載體pBI121上，獲得pBI121-NtWRKY40植物表達(dá)載體。

以病毒外殼蛋白為靶基因，以煙草天然miR167e為骨架［17］，在網(wǎng)站W(wǎng)MD3［18］（Web miRNA Designer，http：//wmd3.weigelworld.org/）上設(shè)計(jì)amiRNA引物，通過重疊PCR（overlapping PCR）的方法，以煙草DNA為模板，先以amiR167-F與 amiR167-I、amiR167-II與amiR167-III和amiR167IV與amiR167-R這3對引物進(jìn)行分段擴(kuò)增，回收3段目的片段，以這3段回收片段為模板，用引物amiR167-F和amiR167-R進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，即得到amiR167-PVY序列。然后通過BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)，連接到植物雙元表達(dá)載體pBI121上，獲得pBI121-amiR167-PVY植物表達(dá)載體。

1.2.5基因的定量分析 檢測NtWRKY40基因、病毒相關(guān)基因和amiRNA前體（pre-amiR167-PVY）基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是以總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，所用基因?qū)Ｒ恍砸?，見?。內(nèi)參基因?yàn)镹tubc2［19］，熒光定量PCR用TransStart Top Green qPCR Mix試劑盒（TransGen）并按照說明書配制反應(yīng)體系，在Bio-Rad熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火25 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。數(shù)據(jù)讀取由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動完成，供試基因的擴(kuò)增效率均在85%以上。基因表達(dá)水平計(jì)算采用2-ΔΔCt方法。試驗(yàn)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測amiRNA成熟序列。以小RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，專一性引物：一條為試劑盒內(nèi)的通用引物Uni-miR qPCR Primer，另一條為amiR167-PVY的成熟序列（轉(zhuǎn)基因煙草）或煙草天然miR167成熟序列（野生型煙草），內(nèi)參基因?yàn)闊煵輒iR159成熟序列［20］。熒光定量PCR用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit試劑盒（TaKaRa）并按照說明書配制反應(yīng)體系，在Bio-Rad熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。數(shù)據(jù)讀取由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動完成，供試基因的擴(kuò)增效率均在85%以上?；虮磉_(dá)水平計(jì)算采用2-ΔΔCt方法。試驗(yàn)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析。

1.2.6農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株 將構(gòu)建正確的植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，挑取單菌落搖菌，經(jīng)PCR驗(yàn)證正確后以1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)。參照Horsc等［21］的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.7病毒侵染 將保存的帶有病毒毒源的煙草葉片研磨，加入PBS緩沖液稀釋（1 g∶10 mL），對煙草的倒數(shù)第2、3片葉進(jìn)行摩擦接毒，取樣部位為侵染葉的非接毒區(qū)和非侵染葉（倒數(shù)第4片葉）。在病毒侵染前期，我們以葉片中病毒外殼蛋白基因（Coat protein，CP）和移動蛋白基因（Move protein，MP）的表達(dá)水平判斷病毒含量；在侵染后期，以煙草植株上的病毒癥狀判斷染病情況。

表1　用于構(gòu)建質(zhì)粒和定量分析的引物

2　結(jié)果

2.1煙草NtWRKY40對病毒侵染的響應(yīng)

2.1.1NtWRKY40的生物信息學(xué)分析 克隆獲得的受病毒誘導(dǎo)的煙草WRKY基因cDNA長777 bp，編碼258個(gè)氨基酸，在NCBI比對相似度最高的為絨毛狀煙草NtoWRKY40（XM_009612054.1）（95%），其次是美花煙草NsWRKY40（XM_009782127.1）（93.0%），番茄SlWRKY40（NM_001317914.1）（83.0%），故將該基因命名為NtWRKY40，GenBank登錄號為AB024510.1。

參照模式植物擬南芥WRKY家族的分類、進(jìn)化關(guān)系，NtWRKY40屬于WRKY 家族基因Ⅱa 亞族成員（圖1-A），多重序列比對顯示NtWRKY40具有該家族完整的結(jié)構(gòu)，包括一個(gè)典型的WRKY結(jié)構(gòu)域和一個(gè)假定的鋅指結(jié)構(gòu)（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H，圖1-B）。在線軟件WoLF PSORT預(yù)測NtWRKY40定位在細(xì)胞核中，序列分析表明，NtWRKY40含有3個(gè)可能的核定位信號（82RKRK85，104PKRPREI110，163PVKKKVQ169，圖1-B）。

2.1.2NtWRKY40過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得 為了進(jìn)一步研究煙草NtWRKY40在應(yīng)答病毒侵染中的作用，通過雙酶切的方法將目的基因插入植物表達(dá)載體pBI121，并置于花椰菜花葉病毒35S啟動子（35S）之后。再通過農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)，獲得35S∷NtWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草植株。經(jīng)過PCR鑒定，獲得7個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因株系（W-1-W-7）。NtWRKY40在不同獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平與野生型煙草相比，有不同程度的提高（圖2-A）。

2.1.3NtWRKY40過表達(dá)植株對植物病毒的抗病分析 選擇NtWRKY40表達(dá)水平較高（W-5）和較低（W-3）的兩個(gè)株系各20株接種TMV和PVY兩種病毒，野生型煙草（WT）作為對照。觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)植株比野生型植株早2 d出現(xiàn)病毒癥狀，在第9天時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的斑駁花葉病癥較野生型更為明顯（圖3），表明NtWRKY40過表達(dá)株系對病毒的敏感性增加。TMV病毒侵染實(shí)驗(yàn)（圖2-B）表明，野生型煙草的NtWRKY40表達(dá)在侵染后6 h和3 d均有升高，但兩者沒有明顯差異。但在侵染后9 d，NtWRKY40表達(dá)量顯著升高至148倍。NtWRKY40過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株W-3在病毒侵染6 h和3 d時(shí)，NtWRKY40的表達(dá)量均比野生型高。但在侵染后的9 d時(shí)，其表達(dá)水平則稍低于野生型。W-5轉(zhuǎn)基因植株在病毒侵染后6 h和3 d時(shí)，NtWRKY40的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于野生型，而9 d時(shí)雖高于野生型（W-5為184，WT為148），但二者沒有顯著性差異。從轉(zhuǎn)基因植株來看，9 d時(shí)NtWRKY40的表達(dá)水平均比6 h和3 d略有降低。

圖1　NtWRKY40基因系統(tǒng)進(jìn)化樹（A）和氨基酸序列分析（B）

圖2　35S∷NtWRKY40過表達(dá)煙草中NtWRKY40的表達(dá)（A）及病毒侵染后的變化（B）

為了進(jìn)一步研究病毒侵染后病毒含量的動態(tài)變化，以確定NtWRKY40基因與感病程度的關(guān)系，利用定量PCR的方法分析了NtWRKY40過表達(dá)煙草與野生煙草的非侵染葉中TMV病毒外殼蛋白基因（coat protein，CP）和移動蛋白基因（move protein，MP）的表達(dá)水平。在接種TMV病毒后6 h，即可檢測到CP和MP的表達(dá)（圖4）。分別以6 h時(shí)野生型煙草中CP和MP的表達(dá)水平為1，計(jì)算此后不同時(shí)間點(diǎn)的病毒基因表達(dá)的相對量。接種病毒后3 d（圖4-A），野生植株CP和MP的表達(dá)水平比6 h時(shí)高了1-2倍，而W-3和W-5中CP和MP升高了4-5倍；接種病毒后9 d（圖4-B），野生植株CP和MP的表達(dá)水平升高了5 000多倍，轉(zhuǎn)基因植株W-3升高了1×104多倍，而W-5的表達(dá)水平則升高了近1.5× 105倍。

圖3　TMV病毒侵染后9 d野生型煙草（WT）與NtWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草株系W-3和W-5病癥表型

綜合圖2和圖4的結(jié)果，NtWRKY40的表達(dá)水平與CP和MP的表達(dá)水平呈正相關(guān)，且與葉片的感病程度一致，說明過表達(dá)NtWRKY40使植物對病毒的侵染更加敏感，表明NtWRKY40是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。

圖4　病毒外殼蛋白基因（CP）和移動蛋白基因（MP）在TMV病毒侵染后3 d（A）和9 d（B）的表達(dá)變化

2.2amiRNA抗病毒技術(shù)

2.2.1amiR167-PVY轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得 為進(jìn)一步探索應(yīng)用人工miRNA抑制病毒病害的技術(shù)，以煙草miR167e為骨架，以PVY病毒外殼蛋白為抑制對象，應(yīng)用WMD3程序獲得反義基因序列，進(jìn)而構(gòu)建出35S∷amiR167-PVY重組質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立35S∷amiR167-PVY轉(zhuǎn)基因植株的3個(gè)株系PVY-1、PVY-2和PVY-3。在35S啟動子的驅(qū)動下，3個(gè)株系的amiR167-PVY成熟序列均比天然miR167有上百倍的表達(dá)（圖5-A）。以野生型煙草中miR167前體序列的表達(dá)水平為對照1，以此計(jì)算轉(zhuǎn)基因植株中amiR167-PVY前體序列（preamiR167-PVY）的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果（圖5-B）顯示，3個(gè)株系的前體序列的表達(dá)水平也有明顯的提高，且成熟序列的表達(dá)水平與前體基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)。

圖5　35S∷amiR167-PVY轉(zhuǎn)基因煙草植株中amiR167-PVY成熟序列（A）和前體（B）的定量分析

2.2.2amiR167-PVY轉(zhuǎn)基因煙草植株抗病毒實(shí)驗(yàn) 將35S∷amiR167-PVY轉(zhuǎn)基因植株的3個(gè)株系擴(kuò)繁后接種PVY病毒，侵染30 d后對野生型煙草及PVY-1、PVY-2和PVY-3三個(gè)株系的抗病能力進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果（表2）顯示，amiR167-PVY的3個(gè)株系均出現(xiàn)了病毒癥狀，但與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株發(fā)病率較野生型低，病癥發(fā)展較慢，對病毒有一定的抑制作用。

表2　野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的抗病能力比較

圖6　病毒侵染6 h和3 d后病毒外殼蛋白PVY-CP基因的定量分析

圖7　野生煙草（CK）和過表達(dá)amiR167-PVY的轉(zhuǎn)基因煙草（3-9，3-1，3-8）病毒侵染1個(gè)月后的病癥表型

為了追蹤病毒在侵染過程中的動態(tài)變化，對PVY-3號株系中的10棵煙草和野生型煙草中PVY病毒外殼蛋白基因（PVY-CP）進(jìn)行定量分析。以侵染后6 h野生型煙草PVY-CP的表達(dá)水平為1，計(jì)算侵染后6 h和3 d轉(zhuǎn)基因植株非侵染葉中PVY-CP的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果（圖6）顯示，6 h時(shí)除3-9中的表達(dá)水平與野生型相似外，其他植株的表達(dá)較低或者檢測不到，3 d時(shí)野生型植株的表達(dá)升高至6 h的3倍，而轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)顯著低于野生型，對病毒具有抑制效果。

病毒侵染1個(gè)月后，總體上轉(zhuǎn)基因煙株與野生株相比，病癥顯著減輕，但仍有個(gè)別轉(zhuǎn)基因植株的病癥與野生株相近（圖7）。為了進(jìn)一步了解病癥與人工amiR167-PVY、病毒外殼蛋白基因表達(dá)的關(guān)系，選擇amiR167-PVY-3轉(zhuǎn)基因植株F2分離后代中病癥較重的3-9、病癥較輕的3-1和抗病的3-8（圖7），進(jìn)行上述基因的定量分析。

以野生型煙草中miR167成熟序列的表達(dá)水平為1，計(jì)算轉(zhuǎn)基因植株中amiR167-PVY成熟序列的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果（圖8-A）顯示，病癥較輕植株的表達(dá)水平高于病癥重者（3-8＞3-1＞3-9）。以侵染后6 h的野生型煙草中PVY-CP的表達(dá)水平為1，計(jì)算轉(zhuǎn)基因植株病葉和非病葉中PVY-CP的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果（圖8-B）顯示，與6 h的野生型煙草相比，染病植株中PVY-CP的表達(dá)水平均有不同程度的升高，且與病癥的嚴(yán)重程度相關(guān)，即病癥嚴(yán)重的植株P(guān)VYCP表達(dá)水平高，病癥較輕的則表達(dá)水平低，而在未染病植株3-8中始終未檢測到病毒相關(guān)基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因植株中，PVY-CP的表達(dá)水平與成熟序列的表達(dá)水平表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)，說明amiRAN抑制了病毒基因的表達(dá)，起到了抗病毒作用。

圖8　侵染病毒一個(gè)月后染病植株中成熟序列（A）和病毒外殼蛋白（B）的定量分析

3　討論

3.1WRKY家族基因在病毒防御信號中的作用

對影響植物防衛(wèi)反應(yīng)的一些WRKY家族基因的研究表明，當(dāng)植物受到不同病原體或是防御信號物質(zhì)誘導(dǎo)時(shí)，WRKY基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白合成以及結(jié)合活性都會產(chǎn)生明顯變化，從而對不同的抗性反應(yīng)作出調(diào)節(jié)［5，22］。在病原菌感染以及用病原菌誘導(dǎo)子或水楊酸（salicylic acid，SA）處理時(shí)，許多植物中的WRKY基因迅速被誘導(dǎo)［23，24］，隨后WRKY蛋白通過特異性的識別啟動子上的W-box，激發(fā)一系列與抗病相關(guān)基因的表達(dá)，例如，PR基因等［25，26］。一些研究對特定的WRKY蛋白參與植物防御反應(yīng)提供了直接證據(jù)，例如，西芹中WRKY1作為轉(zhuǎn)錄激活子，通過與W-box結(jié)合來調(diào)節(jié)真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的基因表達(dá)［27］。有研究報(bào)道，植物對機(jī)械損傷和病原菌侵染的響應(yīng)有著共同的信號傳導(dǎo)元件，都能夠誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)［5］。當(dāng)前對WRKY家族的研究主要集中該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)防衛(wèi)反應(yīng)中下游抗病基因的表達(dá)機(jī)制，以及確立它所參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一些上游信號傳遞元件［28］。在擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病原菌侵染擬南芥時(shí)，AtWRKY40主要通過調(diào)控JZS的表達(dá)進(jìn)而影響一些相關(guān)信號途徑，如對JA信號途徑的影響使得擬南芥對霉粉菌的入侵更加敏感［5］。在煙草中過表達(dá)NtWRKY-R1基因，導(dǎo)致JA信號途徑關(guān)鍵防御基因PDF1.2表達(dá)量降低［29］，說明NtWRKY-R1 基因影響JA 信號途徑，參與逆境信號調(diào)節(jié)作用。

目前利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)并結(jié)合植物的逆境處理，可以有效揭示出WRKY轉(zhuǎn)錄因子所參與和調(diào)控的信號傳導(dǎo)途徑［5，22］。本研究中所用的35S啟動子是組成型啟動子，其本身不受病毒或機(jī)械損傷的影響，而植物內(nèi)源的NtWRKY40受病毒誘導(dǎo)，從病毒侵染后的發(fā)病癥狀來看，NtWRKY40過表達(dá)煙草對病毒的反應(yīng)更加敏感，感病時(shí)效更短，病毒的表達(dá)與NtWRKY40的表達(dá)呈現(xiàn)出正相關(guān)，因此我們認(rèn)為NtWRKY40是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，這有可能是病毒侵染6 h和3 d時(shí)，過表達(dá)株系中NtWRKY40的表達(dá)水平顯著高于野生型的主要原因，而野生煙草在病毒侵染9 d時(shí)才受到顯著誘導(dǎo)（圖2-B）。我們在取樣過程中對植株造成一定的機(jī)械損傷，可能引起了PRs和JZS基因的表達(dá)變化，使得NtWRKY40過表達(dá)植株對TMV的敏感性增加。另外，有研究顯示［13］，煙草WRKY的表達(dá)水平與葉片發(fā)育程度呈負(fù)相關(guān)，即幼葉中表達(dá)水平高，老葉中表達(dá)水平低，本研究中，NtWRKY40的轉(zhuǎn)基因煙草在病毒侵染后9 d，NtWRKY40的表達(dá)水平低于6 h和3 d，可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因煙草對病毒的侵染更加敏感，導(dǎo)致其衰老程度加快，因而9 d時(shí)NtWRKY40的表達(dá)水平下降。

3.2amiRNA骨架和病毒靶基因位點(diǎn)的選擇

到目前為止，一般amiRNA均以天然miRNA作為骨架，一方面可以避免amiRNA轉(zhuǎn)錄后的降解碎片可能引起的內(nèi)源基因的表達(dá)受到意外抑制，另一方面，可以使amiRNA在生物體內(nèi)得以像天然miRNA一樣順利產(chǎn)生成熟的短鏈amiRNA片段［30，31］。不同的miRNA骨架對靶基因的抑制效果也不盡相同，Ai等［32］在擬南芥上的研究發(fā)現(xiàn)，在選用相同的靶基因和成熟序列的前體下，miR159a，miR167b和miR171a三種不同前體對PVX（Potato virus X，馬鈴薯X病毒）和PVY病毒的抑制效果有所不同，以miR159a為骨架對病毒的抑制效率達(dá)到100%，而miR167b和miR171a則分別為75%和50%。這可能是由于植物在產(chǎn)生amiRNA時(shí)，miR159前體（pre-miR159a）的莖環(huán)結(jié)構(gòu)更容易被DCL1（Dicer-like protein 1）識別，從而更有效的產(chǎn)生miRNA：miRNA*復(fù)合體（*代表反義鏈，與miRNA成熟序列互補(bǔ)）；也可能與miRNA前體的自由能有關(guān)（pre-miR159a △G=-73 kcal·mol-1，premiR167b △G=-46.9 kcal·mol-1，pre-miR171a △G= -54.2 kcal·mol-1），自由能越低莖環(huán)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，從而前體轉(zhuǎn)錄折疊成二級結(jié)構(gòu)的時(shí)間變短，加快形成RISC復(fù)合體（RNA-induced silencing complex），實(shí)現(xiàn)更有效的基因沉默［32］。本研究以煙草miR167e為骨架構(gòu)建amiRNA，根據(jù)在線網(wǎng)站RNAfold WebServer（http：//rna.tbi.univie.ac.at/）預(yù)測，煙草miR167e的自由能為-31.35 kcal·mol-1，自由能偏高可能是amiR167-PVY不能完全抑制PVY病毒的原因之一。

此外，為數(shù)不多的有關(guān)amiRNA中人工靶基因片段序列選擇的研究表明，選擇高效率的小RNAs（small RNAs）和具有高度專一性的靶基因是大多數(shù)在線amiRNA序列分析軟件設(shè)計(jì)amiRNA的原則，如WMD3［15］和PsRNAtarget［33］（http：//plantgrn. noble.org/psRNATarget/）等。本研究中選用的amiRNA成熟序列便是基于WMD3網(wǎng)站預(yù)測獲得，選取供試序列中的最佳序列。有文獻(xiàn)報(bào)道，WMD3網(wǎng)站平臺是基于序列的互補(bǔ)配對和amiRNA與靶基因的結(jié)合能量進(jìn)行預(yù)測，為每個(gè)靶基因提供出上百條候選amiRNA序列，而這些amiRNA在生物體內(nèi)的表達(dá)、加工機(jī)器成熟序列的產(chǎn)生尚難預(yù)測［34］。amiRNA與靶基因的互作受到生物體多種因素的影響，包括靶基因mRNA的序列和mRNA結(jié)合蛋白等［35，36］。因此，用于基因沉默的最佳a(bǔ)miRNA僅從目標(biāo)反向互補(bǔ)的序列上判斷，仍有不足，尚需進(jìn)一步的研究。

本研究及此前的研究均表明，RNA病毒如TMV、PVY的侵染能夠極顯著地誘導(dǎo)煙草NtWRKY40的表達(dá)，而該基因在干旱、低溫等逆境條件下的表達(dá)卻無顯著變化［13］。這些結(jié)果表明，該基因的表達(dá)控制元件對RNA病毒有較為專一的反應(yīng)。因此，利用這一特點(diǎn)可以構(gòu)建以抗病毒人工amiRNA和NtWRKY40表達(dá)控制元件為主體的表達(dá)系統(tǒng)，有可能實(shí)現(xiàn)對病毒侵染自動應(yīng)答式的控制。

4　結(jié)論

煙草NtWRKY40是WRKY家族基因Ⅱa 亞族成員，與擬南芥AtWRKY40基因同源，具有該家族的典型結(jié)構(gòu)域，它的過量表達(dá)使植物對于病毒的侵染更加敏感，是抗病負(fù)調(diào)控因子，同時(shí)它的過表達(dá)可能刺激了一些與植物生長有關(guān)的基因的表達(dá)，我們推斷NtWRKY40可能是參與機(jī)械損傷脅迫和病原菌侵染的重要組分。

另外，以馬鈴薯Y病毒基因特定反相互補(bǔ)片段序列構(gòu)建的amiR167-PVY在轉(zhuǎn)基因煙草的抗病毒試驗(yàn)中，表現(xiàn)出對病毒有一定的抑制作用。

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（責(zé)任編輯李楠）

Roles of Nicotiana tobacum NtWRKY40 in Plant Responding to Virus Infection

LIU Jing-jing CHENG Chun-ling XI Yu-zhen WEI Shu
（State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization，Anhui Agricultural University，Hefei 230036）

Some of WRKY transcription factors have involved in plant abiotic defense. A WRKY gene，a homologue of Arabidopsis WRKY40，was found being dramatically induced by plant virus and further characterized in this study. To verify its function，NtWRKY40 overexpressed tobacco plants were established. After virus infection，the transcription levels of NtWRKY40 and virus related genes were quantified using quantitative real time PCR at three stages（6 h，3 d，9 d after infection）. Results showed that tobacco mosaic virus infection led to 150 fold higher of NtWRKY40 transcript in non-transgenic wild type tobacco than non-infected control. No significant change in NtWRKY40 transcription levels was noted in the NtWRKY40 over-expressed tobacco after virus infection. NtWRKY40 over-expressed tobaccos were more sensitive to TMV infection than non-transgenic wild type. The data suggested that NtWRKY40 was a negative regulator in responding to TMV. In addition，an artificial miRNA vector amiR167-PVY was constructed，for silencing the coat protein gene of Potato virus Y，using the miR167 precursor of Nicotiana tabacum as backbone and cauliflower mosaic virus 35S promoter. Over-expression of amiR167-PVY exhibited inhibitory effect on the virus. The results provide the basis for the further research on amiRNA-mediated virus resistance mechanism，and contributes to antiviral transgenic plants cultivation with the optimal target sequence.

Tobacco mosaic virus；Potato virus Y；WRKY transcription factor；artificial microRNA；virus resistance

2016-06-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070614，31370687），教育部博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20123418110002）

劉晶晶，女，博士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：xiaoayatou@163.com；程春玲同為本文第一作者

魏書，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：茶樹次生代謝；E-mail：weishu@ahau.edu.cn