張佳佳 張力維 李勇鵬 焦曉琳 朱逢玲 杜麗

（南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南陽 473000）

不同非生物脅迫下香樟實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的選擇

張佳佳 張力維 李勇鵬 焦曉琳 朱逢玲 杜麗

（南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南陽 473000）

旨在獲得香樟（Cinnamomum camphora L.）在不同非生物脅迫下表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以香樟實(shí)生苗為材料，利用實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)研究分析了兩個香樟候選內(nèi)參基因CcACTc和CcEF1α在不同非生物脅迫下的表達(dá)量，并通過BestKeeper軟件對CcACTc和CcEF1α的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在低溫處理中，CcACTc的穩(wěn)定性較好，在干旱、高鹽和ABA處理中則CcEF1α的穩(wěn)定性較好，并且其在低溫處理中也相對穩(wěn)定。由此可知，CcEF1α更適合作為內(nèi)參基因應(yīng)用于香樟非生物脅迫相關(guān)基因的定量分析。

香樟；qRT-PCR；內(nèi)參基因；非生物脅迫

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.025

隨著技術(shù)的發(fā)展，用于基因表達(dá)研究的檢測方法也越來越多樣化，主要包括：實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）、Northern印跡（northerblot）、DNA微陣列（DNA microarray）和高通量測序（High-throughput sequencing）等［1］。其中，qRT-PCR具有操作方便、靈敏性強(qiáng)、效率高等特點(diǎn)，而且對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較為準(zhǔn)確的分析［2-4］，是目前研究基因表達(dá)最常用也是最重要的一種手段，在植物基因的研究中有著較為廣泛的應(yīng)用［5，6］。qRT-PCR通過檢測樣品cDNA中的模板量比較和分析來自不同組織或不同處理的樣品中目的基因的表達(dá)量，但是其分析結(jié)果通常受樣品RNA質(zhì)量、cDNA合成效率以及實(shí)驗(yàn)條件的影響，需要內(nèi)參基因來矯正cDNA樣品之間的差異，從而實(shí)現(xiàn)對目的基因的定量和標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)而得到更加準(zhǔn)確、可靠的分析數(shù)據(jù)［7］。

目前，在植物基因表達(dá)研究中常用的內(nèi)參基因大多是一些管家基因，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）基因GAPDH、肌動蛋白（actin）基因ACT、延伸因子（elongation factor 1-alpha）基因EF1α、18S核糖體RNA（18SrRNA）和微管蛋白（tubulin）基因TUB等［8］。這些管家基因在細(xì)胞中均有較高的表達(dá)量，且表達(dá)量相對恒定［9，10］。一個合適的內(nèi)參基因在研究目的基因的實(shí)驗(yàn)條件下其表達(dá)量是相對恒定的。此外，內(nèi)參基因作為研究對象，其表達(dá)量也應(yīng)該保持在相對穩(wěn)定的水平［11，12］。近年來有關(guān)非生物脅迫下內(nèi)參基因篩選的報(bào)道很多，如Wan等［13］研究發(fā)現(xiàn)，EF1α是黃瓜在非生物脅迫下較穩(wěn)定的基因；Chen［14］在篩選非生物脅迫下匍莖剪股穎的內(nèi)參基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)EF1α基因在其冷脅迫的葉中具有較好的穩(wěn)定性；韓曉雪等［15］在研究非生物脅迫下的番茄中，發(fā)現(xiàn)Actin基因較其他幾個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性更好。由此可知，EF1α和Actin基因在非生物脅迫下的不同植物中均具有較好的穩(wěn)定性。

迄今為止，園林樹木香樟內(nèi)參基因相關(guān)研究十分有限，李勇鵬等［16］從香樟中分離和鑒定了香樟肌動蛋白基因（CcACTa、CcACTb、CcACTc和CcACTd），其中，CcACTc的核苷酸序列與樟科山雞椒中的ACT7有較高的相似性，相似度達(dá)98%，氨基酸序列相似度達(dá)100%，而山雞椒ACT7基因是優(yōu)良候選內(nèi)參基因［17］。張力維等［18］從香樟中分離得到了香樟延伸因子基因（CcEF1α）。經(jīng)qRT-PCR分析表明，在低溫處理下香樟CcACTc和CcEF1α基因表達(dá)量均相對恒定，是研究低溫脅迫條件下較好的候選內(nèi)參基因［16，18］。但是，上述兩個基因在其他非生物脅迫下的穩(wěn)定性分析并未見報(bào)道，香樟非生物脅迫的應(yīng)答分子機(jī)制缺乏相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)室已成功從香樟中分離并鑒定得到4個香樟冷誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因CBF/DREB1（CRT/DRE binding factor），為了系統(tǒng)研究香樟CBF/DREB1基因的表達(dá)模式，本實(shí)驗(yàn)擬對其進(jìn)行相對定量分析，而內(nèi)參基因在不同逆境處理下的穩(wěn)定性分析是必要的研究基礎(chǔ)。本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析和比較這兩個基因在低溫、干旱、高鹽和ABA處理下表達(dá)量的穩(wěn)定性，旨在為研究香樟逆境相關(guān)基因的表達(dá)模式提供內(nèi)參基因。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)采用生長在自然環(huán)境中6月齡，株高約30 cm的香樟（Cinnamomum camphora L.）實(shí)生幼苗作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2試劑 EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊公司；PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自TaKaRa生物公司（大連）；qRT-PCR試劑為FastStart Universal SYBR Green Master 試劑盒（Roche，Germany）；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2方法

1.2.1香樟在不同非生物脅迫下的處理 選取12株無病害、生長健壯且長勢一致的香樟幼苗，置于人工氣候箱中進(jìn)行一周的培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間16/8 h（光照/黑暗），溫度（25±1）℃，相對濕度75%。1周后，每3株香樟幼苗分為一組，分別做低溫、干旱、高鹽和ABA處理。將其中一組放入另一同型號人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，將溫度設(shè)為4℃，其他條件保持不變，分別于0、0.5、1、2、4、6、12和24 h時(shí)取其葉片，將收獲的葉片放入液氮中速凍后于-80℃冰箱中保存。其余3組幼苗轉(zhuǎn)入蒸餾水中，在原人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行液體培養(yǎng)1周，然后將3組香樟幼苗分別轉(zhuǎn)入對應(yīng)的處理溶液中：20% polyethylene glycol（PEG）6000用來模擬干旱脅迫、250 mmol/L NaCl溶液用來模擬高鹽脅迫、ABA的處理濃度為100 μmol/L。分別于各處理0、0.5、1、2、4、6、12和24 h時(shí)取其葉片，放入液氮中速凍后于-80oC冰箱中保存。

1.2.2總RNA的提取和cDNA的合成 將各處理的材料用液氮研磨后，使用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊公司）提取總RNA，具體操作按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。提取的總RNA用Thermo Fisher Scientific公司的微量紫外檢測儀NanoDrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA樣品的濃度和質(zhì)量測定。然后根據(jù)PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（大連TaKaRa公司）試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄得到的各個cDNA樣品分別用去離子水稀釋10倍作為模板。

1.2.3內(nèi)參基因擴(kuò)增片段特異性檢測 以香樟葉片cDNA為模板，利用李勇鵬等［16］和張力維等［18］設(shè)計(jì)的qRT-PCR引物CcACTc-RTF、CcACTc-RTR、CcEF1α-RTF和CcEF1α-RTR進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1），擴(kuò)增產(chǎn)物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有非特異性擴(kuò)增。

表1　引物序列及相關(guān)信息

1.2.4qRT-PCR反應(yīng)條件 qRT-PCR反應(yīng)按照FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒（Roche，Germany）的說明書進(jìn)行。使用CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad）和8連管。反應(yīng)體系為10 μL：2×Power Taq PCR Master Mix 5 μL，3.4 μL的ddH2O，上下游引物各0.3 μL，cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，60℃退火30s，72℃延伸1 min，共40次循環(huán)；熔解曲線在65-95℃之間，每0.05 s升高0.5℃?；虮磉_(dá)分析軟件為BioRad CFX manager2.0，每個樣品重復(fù)3次。每個實(shí)驗(yàn)設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5引物擴(kuò)增效率的計(jì)算 將各反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品等量混合后，等比逐級稀釋6個梯度，每個梯度稀釋5倍，則初始cDNA濃度分別為1、1/5、1/25、1/125、1/625、1/3 125、每個反應(yīng)設(shè)3個重復(fù)。反應(yīng)在qPCR分析，由PCR儀自帶的計(jì)算軟件CFX ManagerTMSoftware繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。由公式E= 10（-1/k）-1計(jì)算出擴(kuò)增效率E。

1.2.6BestKeeper軟件分析 BestKeeper軟件根據(jù)每個樣品的平均Ct值進(jìn)行分析［19］。根據(jù)不同處理時(shí)間下各個樣品的CT值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，SD值越小，基因穩(wěn)定性越好，若SD＞1，則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定［20，21］。

2　結(jié)果

2.1CcACTc和CcEF1α基因片段的PCR擴(kuò)增分析

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，在200-500 bp之間和200 bp處，CcACTc和CcEF1α基因擴(kuò)增條帶單一，無雜帶和引物二聚體，表明CcACTc和CcEF1α基因引物特異性較高，可以用于qRT-PCR分析。

圖1　CcACTc和CcEF1α的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2引物擴(kuò)增效率及特異性分析

通過qRT-PCR分析，成功獲得了CcACTc和CcEF1α基因引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知CcACTc基因的斜率k（slope）為-3.079，回歸方程R2=0.994，擴(kuò)增效率E=111%；CcEF1α基因的斜率k（slope）為-3.144，回歸方程R2=0.997，擴(kuò)增效率E=108%。以上數(shù)據(jù)中，回歸方程R2均大于0.99，擴(kuò)增效率在0.9-1.2之間，說明CcACTc和CcEF1α基因引物qRT-PCR體系較好，可以用于后續(xù)分析。溶解曲線結(jié)果（圖2）表明，CcACTc和CcEF1α基因都只有顯著單一的熔解峰，各重復(fù)間的曲線有較好的重復(fù)性，表明引物均有良好特異性。

2.3CcACTc和CcEF1α基因在各脅迫下的平均Ct值分析

為了比較CcACTc和CcEF1α基因在各個非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平，通過qRT-PCR獲得的Ct值來對其進(jìn)行測定。qRT-PCR中基因的表達(dá)量與Ct值成反比，即Ct值越大，基因表達(dá)量越小，反之亦然。qRT-PCR結(jié)果（圖3）顯示，在不同時(shí)間的低溫處理下CcACTc基因的平均Ct值在23.33-23.94個循環(huán)之間，在干旱處理下的平均Ct值在21.78-23.30個循環(huán)之間，在高鹽處理下的平均Ct值在22.00-23.59個循環(huán)之間，在ABA處理下的平均Ct值在24.17-26.24個循環(huán)之間；在不同時(shí)間低溫處理下CcEF1α基因（圖4）的平均Ct值在21.95-23.17個循環(huán)之間，在干旱處理下的平均Ct值在22.01-22.55個循環(huán)之間，在高鹽處理下的平均Ct值在21.51-22.16個循環(huán)之間；在ABA處理下的平均Ct值在21.57-23.53個循環(huán)之間。由Ct值的循環(huán)數(shù)差值，初步了解到，在低溫脅迫下CcACTc基因較CcEF1α基因穩(wěn)定；在干旱、高鹽和ABA處理下，則CcEF1α基因更穩(wěn)定。

圖2　CcACTc基因和CcEF1α基因的Real-time PCR溶解曲線

圖3　CcACTc基因在不同非生物脅迫下的平均Ct值

2.4CcACTc和CcEF1α基因BestKeeper軟件分析

BestKeeper軟件根據(jù)候選內(nèi)參基因在不同處理時(shí)間樣品中的Ct值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，對基因的穩(wěn)定性作分析，SD值越小，穩(wěn)定性越好，若SD＞1，則說明該基因不穩(wěn)定。分析結(jié)果（表2）表明，CcACTc和CcEF1α基因在各非生物脅迫下的SD值均小于1。CcACTc基因的SD值（0.15）在低溫條件下比CcEF1α基因（0.28）小，而在干旱、高鹽和ABA條件下CcEF1α基因的SD值都比CcACTc基因的小。因此，在低溫條件中，CcACTc基因較穩(wěn)定；而在干旱、高鹽和ABA脅迫中，CcEF1α基因更穩(wěn)定。

圖4　CcEF1α基因在不同非生物脅迫下的平均Ct值

表2　CcACTc和CcEF1α基因在不同非生物脅迫下的BestKeeper分析結(jié)果

3　討論

qRT-PCR具有較高的靈敏性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，近年來被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)的研究［22］。而在運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)時(shí)，選擇合適的內(nèi)參基因是基因表達(dá)研究中的關(guān)鍵，選擇不恰當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因可能會得出錯誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。Actin存在于所有的真核細(xì)胞中，所表達(dá)的肌動蛋白是真核細(xì)胞中含量最豐富的蛋白，是qRT-PCR過程中的首選內(nèi)參基因［23］；EF1α是真核生物中一種多功能蛋白，在細(xì)胞的翻譯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞骨架的形成以及癌基因的轉(zhuǎn)化中都發(fā)揮著重要的作用［24］，這兩個基因都廣泛作為內(nèi)參基因應(yīng)用于功能基因的表達(dá)分析研究中。此外，研究表明，Actin基因和EF1α基因經(jīng)常作為內(nèi)參基因應(yīng)用于植物中逆境相關(guān)基因DREB的表達(dá)分析研究中。如煙草［25］、胡楊［26］、枸杞［27］和麻風(fēng)樹［28］等的Actin基因及馬鈴薯［29］、梅花［30］和萵苣［31］等的EF1α基因。然而，同一基因在不同物種或同一物中的不同處理中其穩(wěn)定性有一定的差異，如在低溫脅迫下，檸條錦雞兒［32］Actin基因表達(dá)比較穩(wěn)定，而在馬鈴薯的6個候選內(nèi)參基因篩選中，Actin基因穩(wěn)定性卻最差［11］；在干旱脅迫下，柳枝稷［33］Actin基因表達(dá)較穩(wěn)定，而在油菜中［34］卻表達(dá)不穩(wěn)定；在脫落酸（ABA）處理下的水芹［35］和檸條錦雞兒［32］中EF1α基因表達(dá)較穩(wěn)定，而在短柄草［36］中卻是較不穩(wěn)定的。因此，在研究目標(biāo)基因的表達(dá)模式前，對候選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性分析是非常必要的。

本研究通過qRT-PCR獲得了CcACTc和CcEF1α基因在不同非生物脅迫下的平均Ct值。同時(shí)又利用BestKeeper軟件對其Ct值進(jìn)行了分析，依據(jù)所得SD值來判定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低溫條件下，CcACTc基因的表達(dá)相對穩(wěn)定，而在干旱、高鹽、ABA處理的條件下，則CcEF1α基因的表達(dá)較穩(wěn)定。

4　結(jié)論

本研究對受不同脅迫的香樟實(shí)生苗進(jìn)行了候選內(nèi)參基因的分析與選擇，在低溫脅迫下，CcACTc基因的穩(wěn)定性較好，較適合作內(nèi)參基因；而在干旱、高鹽和ABA脅迫中，CcEF1α基因的穩(wěn)定性都較CcACTc基因高。CcEF1α基因雖然在低溫條件下穩(wěn)定性低于CcACTc基因，但其表達(dá)量也相對穩(wěn)定，因此，CcEF1α基因則更適合作為非生物脅迫相關(guān)基因研究中的內(nèi)參基因。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Evaluation of Candidate Reference Genes for Normalization of Quantitative RT-PCR in Cinnamomum camphora Under Various Abiotic Stresses

ZHANG Jia-jia ZHANG Li-wei LI Yong-peng JIAO Xiao-lin ZHU Feng-ling DU Li
（School of Life Science and Technology，Nangyang Normal University，Nanyang 473000）

This study is to obtain the optimal reference genes of Cinnamomum camphora under different abiotic stresses. The expression level and expression stability of two candidate reference genes CcACTc and CcEF1α in C. camphora under various abiotic stresses were analyzed using quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）technique and BestKeeper software，respectively. The results indicated that，CcEF1α was relatively stable under low temperature treatment，and performed higher stability under other abiotic stress，such as drought，high salinity and ABA treatment compared to CcEF1α. Accordingly，CcEF1α is a considerable reference gene for quantitative analysis of stress-related genes in C. camphora.

Cinnamomum camphora；qRT-PCR；reference gene；abiotic stress

2016-06-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31100511），南陽師范學(xué)院2015年度研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（2015CX008），南陽師范學(xué)院2016年度STP項(xiàng)目（2016001）

張佳佳，女，碩士研究生，研究方向：園林植物遺傳育種；E-mail：zhangjiapple@126.com

杜麗，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：園林植物遺傳育種；E-mail：dldldlucky@163.com