陳偉 舒健虹 陳瑩 曾慶飛 王小利 陸瑞霞 付薇

（貴州省草業(yè)研究所，貴陽 550009）

黑麥草根際鐵載體產(chǎn)生菌WN-H3的分離鑒定及其產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

陳偉 舒健虹 陳瑩 曾慶飛 王小利 陸瑞霞 付薇

（貴州省草業(yè)研究所，貴陽 550009）

從黑麥草（Lolium perenne L.）根際土壤中分離得到28份菌株，采用刃天青（chrome azural S，CAS）平板檢測法定性、定量篩選出1株產(chǎn)鐵載體能力較強的細菌WN-H3，經(jīng)過菌落形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步判斷為一株弗村假單胞菌（Pseudomonas vranovensis）。在搖瓶水平上采用單因子法分別研究了鐵載體合成菌株WN-H3的碳、氮源利用效果及培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值等因素對菌株生長及鐵載體合成能力的影響，最終優(yōu)化得到鐵載體產(chǎn)生菌的最佳發(fā)酵條件：蔗糖10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，NaCl 5 g/L，溫度28℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，pH7.5，該條件下培養(yǎng)48 h后菌株WN-H3產(chǎn)生的鐵載體活性su值可達80.4%。實驗表明，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件更利于鐵載體產(chǎn)生菌的生長和鐵載體合成。

鐵載體產(chǎn)生菌；篩選；鑒定；條件優(yōu)化

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.027

鐵元素是作物生長必需的營養(yǎng)元索之一，是葉綠素合成所必需的，也是與呼吸作用有關(guān)的細胞色素氧化酶與過氧化酶的組成成分，參與植物體內(nèi)眾多氧化還原的過程［1］。隨著作物品種的更換，大量氮、磷、鉀無機化肥的施用，作物相繼出現(xiàn)缺鐵現(xiàn)象，其中缺鐵對生長在堿性土壤上的植物表現(xiàn)較明顯［2-5］。全世界具有潛在性缺鐵的土壤占世界耕地面積的40%。植物缺鐵是世界各地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所面臨的一個普遍問題，土壤中的鐵在一般情況下均會氧化為溶解性極差的氧化鐵或沉淀為氫氧化鐵，使植物難于吸收利用［6］。

鐵載體是包括細菌和真菌在內(nèi)的，幾乎所有好氧和兼性厭氧的微生物在鐵脅迫條件下向環(huán)境分泌對Fe3+具有極高親和力的小分子量鐵螯合物，這些化合物協(xié)助微生物從環(huán)境中獲取必需的鐵元素［7］。在鐵缺乏時，微生物在體內(nèi)產(chǎn)生特異的鐵載體，與Fe3+形成緊密的可溶復(fù)合物；同時在革蘭氏陰性菌（G-）的細胞外膜上產(chǎn)生受體蛋白，即鐵受體蛋白，特異識別Fe3+鐵載體并把Fe3+運輸?shù)郊毎麅?nèi)［8］。現(xiàn)在的一些研究表明，鐵載體不僅對微生物的鐵營養(yǎng)至關(guān)重要，而且它是根際促生細菌（PGPR）抑制土壤病害的重要機制［9-11］，另外，鐵載體還在某些動植物病原菌的致病性等諸多方面起著作用［12］。這些具有鐵載體合成能力的微生物通過競爭鐵元素，不僅能夠改善自身的營養(yǎng)狀況，還能夠供給植物鐵營養(yǎng)或通過與植物病原菌競爭鐵營養(yǎng)達到生物防治的作用［13］。

目前，國內(nèi)外對鐵載體合成細菌的研究主要集中在玉米、水稻、小麥、棉花等大宗作物［14-16］，利用產(chǎn)鐵載體細菌提高牧草根際及周圍土壤Fe3+利用率的研究鮮見報道。本研究以貴州適生牧草黑麥草為實驗材料，采用CAS藍色檢測平板、定性定量法，結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化分析，篩選鑒定出鐵載體螯合能力較強的菌株，并對產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期研究其根際鐵載體分泌細菌動態(tài)變化，為進一步挖掘牧草根際鐵載體細菌產(chǎn)鐵載體潛力，并為貴州石灰性土壤缺鐵問題的改善提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株采集 2014年4月，于威寧（海拔2 100m，年降雨量950 mm）、興仁（海拔1 963 m，年降雨量1 320.5 mm）、獨山（海拔970 m，年降雨量1 346.3 mm）、貴陽（海拔1 056 m，年降雨量1 124mm）4個牧草實驗地中，選取長勢較為旺盛的多年生黑麥草植株，去除表層土壤和雜物，采集其土層深度15 cm的根際土樣，去除根系上附著的大土粒，用無菌的毛刷將根上粘著的細土掃落到無菌袋后封口，貼上標簽，然后將土樣用冰盒迅速帶回實驗室進行根際土壤細菌的分離。

1.1.2培養(yǎng)基及鐵載體檢測液 鐵載體檢測CAS染液：將0.079 g CAS（鉻天青）溶于50 mL去離子水中，再加入10 mL 1 mmol/L FeCl3溶液（含12 mmol/L HCl），溶液A。將0.069 g十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）溶于40 mL的去離子水中，得溶液B。將A溶液沿?zé)诰従徏尤隑溶液中，攪拌混勻即得100 mL CAS藍色檢測液。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）：每100 mL含Na2HPO4·12H2O 2.427 g，NaH2PO4·2H2O 0.590 5 g，KH2PO40.075 g，NH4Cl 0.250g，NaCl 0.125 g，使用時稀釋10倍。

CAS培養(yǎng)基［17］：每100 mL含20%蔗糖溶液1 mL，10%酸水解酪素3 mL，1 mmol/L CaCl2100 μL，1 mmol/L MgSO42 mL，瓊脂1.8 g，在約60℃時緩慢加入磷酸鹽緩沖液和CAS染液各5 mL，即得CAS藍色培養(yǎng)基。

MKB液體培養(yǎng)基：酪蛋白氨基酸5.0 g，甘油15 mL，K2HPO42.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂1.8 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3產(chǎn)鐵載體細菌 產(chǎn)鐵載體菌株HMGY6B、GY4A分離自貴州省草業(yè)研究所貴陽實驗基地，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子學(xué)等方法鑒定，現(xiàn)保存于貴州省草業(yè)研究所分子生物學(xué)實驗室。

1.2方法

1.2.1黑麥草根際產(chǎn)鐵載體細菌的分離純化與定性檢測 參照文獻［18］稱取鮮土樣10 g溶于100 mL已經(jīng)滅菌的去離子水中，并置于搖床上在28℃ 145r/min的速度下?lián)u30 min，進行稀釋。吸取上清液50 μL均勻涂抹在CAS平板上，置于28℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h。菌落表面比較光滑，菌落大而黏稠的菌落接種在CAS檢測平板上進行純化與鑒定，純培養(yǎng)物保存在LB斜面上和甘油管以備菌種鑒定。將細菌純培養(yǎng)物接種到CAS檢測平板上，28℃培養(yǎng)48 h，經(jīng)過培養(yǎng)的CAS檢測平板上，分泌鐵載體的細菌菌落周圍會出現(xiàn)明顯的橙黃色暈圈，記錄橙黃色暈圈產(chǎn)生的時間、大小、顏色、形態(tài)特征。同時，通過計算暈圈比例即可溶性指數(shù)［19］，對其分泌鐵載體能力進行比較分析，以定性篩選鐵載體能力強的菌株。

1.2.2黑麥草根際產(chǎn)鐵載體細菌定量篩選 挑取暈圈比較明顯的菌落，接種于MKB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，然后將菌懸液8 000 r/min離心15 min后得到細菌發(fā)酵上清液，分別取發(fā)酵上清液與CAS檢測液各3 mL充分混勻，靜置1 h后采用721型分光光度計在630 nm波長處測定吸光值（As），并取雙蒸水作對照調(diào)零，另取3mL CAS檢測液與3 mL未接種的MKB液體培養(yǎng)基上清液充分混勻，同上測定吸光值即為參比值（Ar）。按照Machuca和Miliagres［20］的方法計算鐵載體活性單位（su），su=［（Ar-As）/ Ar］×100，篩選鐵螯合能力強的菌株。

1.2.3黑麥草根際產(chǎn)鐵載體細菌鑒定

1.2.3.1鐵載體細菌培養(yǎng)性狀觀察 將細菌分別接種在LB平板和斜面培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫箱中，培養(yǎng)48 h后，觀察描述其菌落質(zhì)地、形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等培養(yǎng)性狀。

1.2.3.2生理生化鑒定 測定方法參照常用細菌鑒定手冊［21］，對篩選出的鐵載體細菌進行相應(yīng)的生理生化檢測。

1.2.3.316S rDNA序列分析 采用16S rDNA擴增通用引物27F/1495R，以菌株總DNA為模板進行擴增，測得的序列與GenBank中已有的16S rDNA序列進行同源性比對，用Mega 2法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4黑麥草根際產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.4.1搖床發(fā)酵條件［22］用接種環(huán)從斜面菌種上取適量菌體，接種于裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在145 r/min，28℃條件下，搖床振蕩培養(yǎng)24 h，以10%（V/V）的接種量接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，使其OD630值在0.1左右，同樣條件下振蕩培養(yǎng)48 h，此培養(yǎng)條件是進行一下培養(yǎng)基優(yōu)化實驗的基礎(chǔ)。

1.2.4.2碳源和氮源的篩選［22］在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上首先對10 g/L的碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖）和0.5 g/L的氮源（硫酸銨、草酸銨、硝酸銨、氯化銨、檸檬酸銨）進行篩選。菌株在LB斜面上活化24 h后，制成菌懸液（濃度約為109cell/mL，OD值1.0），按菌懸液與添加碳源、氮源的LB液體培養(yǎng)基1∶100接種，即每100 mL培養(yǎng)基接菌懸液1 mL，每菌株3次重復(fù)，培養(yǎng)48 h，測定OD630，以不接菌空白MKB液體培養(yǎng)基為對照，按照1.2.4.1步驟，獲得發(fā)酵上清液，用蒸餾水洗滌3次，計算鐵載體活性單位。

1.2.4.3培養(yǎng)基組成的優(yōu)化［22］確定最優(yōu)碳氮源劑量后，采用逐個單因子法研究培養(yǎng)溫度（14℃、21℃、28℃和37℃）、搖床轉(zhuǎn)速（120、150、180和210 r/min）、培養(yǎng)基初始pH值（6.5、7.5、8.5和9.5）對菌株生長及鐵載體合成能力的影響，最終篩選得到最適菌株鐵載體合成的培養(yǎng)基條件，并以鐵載體菌株HMGY6B、GY4A進行培養(yǎng)條件驗證。

2　結(jié)果

2.1黑麥草根際鐵載體細菌分離純化與定性檢測

CAS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，部分細菌周圍出現(xiàn)明顯橙黃色暈圈，依據(jù)細菌形態(tài)、顏色、大小，挑選出28株菌株，繼續(xù)接種于CAS培養(yǎng)基，經(jīng)過連續(xù)4代養(yǎng)后，得到4株產(chǎn)鐵載體能力較強的菌株（圖1），4份菌株第3天菌落直徑大小約1.01-1.26 cm、顏色乳白或淡粉色，可溶性指數(shù)2.44-4.52（表1）。可溶性指數(shù)由大到小依次為WN-H3＞DS-H5＞GYH1＞DS-H2。

表1　產(chǎn)鐵載體細菌菌落大小、暈圈直徑

圖1　菌株WN-H3純化與CAS檢測篩選

2.2黑麥草根際鐵載體細菌定量篩選

在MKB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h檢測4份菌株鐵載體產(chǎn)生能力，檢測結(jié)果如表2所示。細菌培養(yǎng)液樣品受外界環(huán)境影響pH變化較大，為了避免CAS檢測液的吸收值因pH變化造成偏差，鐵載體的定量檢測可以通過As/Ar值的降低來衡量。如表2所示，4份菌株中WN-H3菌株的As/Ar值最低為0.26，鐵載體活性單位su值為74.3%，依據(jù)Manjanatha等對細菌產(chǎn)鐵載體能力劃分，As/Ar從1.0-0之間以0.2為間隔，每減少0.2增加一個“+”，該菌株分泌鐵載體的能力為“++++”，由此表明WN-H3為一株產(chǎn)鐵載體能力較強的菌株。

表2　4份菌株在630 nm波長處的吸光值及鐵載體活性單位

2.3黑麥草根際產(chǎn)鐵載體菌株鑒定

圖2　WN-H3在掃描電鏡下的形態(tài)特征（5 000×）

表3　菌株WN-H3生理生化特征鑒定

2.3.1菌落形態(tài)、電鏡掃描及生理生化鑒定 WN-H3菌落較小、淡粉色、表面光滑半透明、有光澤、邊緣整齊、中部略微凸起。WN-H3革蘭氏染色陰性，近圓形的短桿狀，短徑0.5-1 μm，長徑0.8-1.5 μm，具端鞭毛，運動，不產(chǎn)芽孢（圖2）。最適生長溫度為26℃-35℃，在4℃仍然可以生長，而41℃無法生長，最適生長pH值為6.2-7.8。生理生化特征如表3，鑒定結(jié)果與弗村假單胞菌（Pseudomonas vranovensis）較為一致。

2.3.2菌株WN-H3的16S rDNA序列分析 以WN-H3菌株總DNA為模板，對其16S rDNA全基因進行測序，得到總長為1 242 bp的16S rDNA序列。將WN-H3的16S rDNA序列在BLAST中進行對比并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），發(fā)現(xiàn)WN-H3與有效發(fā)表菌株P(guān)seudomonas vranovensis strain T-16（HQ202845）和Pseudomonas vranovensis strain T-26（HQ202851）聚在同一小枝上，與P. vranovensis strain T-16（HQ202845）同源相似性為99.3%，與P.vranovensis strain T-26（HQ202851）同源相似性為99.1%；結(jié)合菌落菌體特征、生理生化指標，初步判斷WN-H3可能與Pseudomonas vranovensis strain T-16（HQ202845）和Pseudomonas vranovensis strain T-26（HQ202851）屬同一物種，為一株弗村假單胞菌P. vranovensis。但因WN-H3與其他P. vranovensis菌株遺傳距離較遠，并未聚在同一大類，其間還聚有P. asplenii、P. putida、P. fluorescens等其它菌株，因此其明確的分類地位有待進一步研究。

圖3　菌株WN-H3的系統(tǒng)進化樹

2.4產(chǎn)鐵載體細菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.4.1碳源對菌株WN-H3生長及鐵載體合成的影響 菌體和鐵載體合成的能量來源及碳骨架主要是碳元素，本實驗以10 g/L的葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖替代蛋白胨研究碳源對菌株WN-H3生長及產(chǎn)鐵載體的影響。結(jié)果（表4）顯示，以乳糖、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中，菌株WN-H3不能夠生長，在葡萄糖、可溶性淀粉作為碳源的培養(yǎng)基中生長緩慢，前者產(chǎn)生較少量鐵載體，后者無法合成鐵載體。在蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中菌株生物量增加快速，培養(yǎng)48 h后OD630可達1.784，鐵載體合成量達到最大值su=76.9%。

表4　不同碳源對菌株WM-H3生長及鐵載體合成的影響

2.4.2氮源對菌株WN-H3生長及鐵載體合成的影響 氮源是合成細菌蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)和鐵載體的來源。本實驗利用0.5 g/L的硫酸銨、草酸銨、硝酸銨、氯化銨、檸檬酸銨替代酵母浸出粉研究了菌株WN-H3對氮源的利用效果。WN-H3在無機氮培養(yǎng)基中幾乎不生長，培養(yǎng)48 h后菌體生物產(chǎn)量仍然很低，鐵載體無法合成，推測菌株WN-H3的生長和鐵載體的合成與酵母浸出粉中的多種生長刺激因子以及蛋白胨中各種營養(yǎng)元素有關(guān)，因此培養(yǎng)基繼續(xù)使用5 g/L酵母浸出粉。

2.4.3培養(yǎng)溫度對菌株WN-H3生長及鐵載體合成的影響 在不同培養(yǎng)溫度下研究了菌株WN-H3生長及鐵載體合成情況，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時，菌株WN-H3生長情況最好，且鐵載體合成能力最強su值可達到78.8%。溫度太低，菌體生長緩慢，在14℃時菌株WN-H3 OD630僅為0.506，su值低至37.8%，溫度35℃時，OD630和su值也僅分別為0.902和52.1%。由此可見，菌株生長及鐵載體合成的最佳溫度為28℃。

2.4.4轉(zhuǎn)速對菌株WN-H3生長及鐵載體合成的影響 在250 mL三角瓶中裝50 mL培養(yǎng)液，考察不同搖床轉(zhuǎn)速對菌株生長和產(chǎn)鐵載體能力的影響（圖5）。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達180 r/min時，菌株WN-H3生長情況最好，OD630高達1.901，鐵載體合成能力最強su值可達到76.5%，在120、150和210 r/min轉(zhuǎn)速下，各菌液OD630分別為1.128、1.678和1.690，鐵載體活力su值分別為69.7%、72.3%和62.7%，各轉(zhuǎn)速之間差異較小，由此可見轉(zhuǎn)速對鐵載體的生長和鐵載體的合成影響不大。

圖4　培養(yǎng)溫度對菌株WN-H3生長及鐵載體合成的影響

圖5　搖床轉(zhuǎn)速對菌株WN-H3生長及鐵載體合成的影響

2.4.5初始pH對菌株WN-H3生長及鐵載體合成的影響 為了研究初始pH值對菌株生長和產(chǎn)鐵載體能力的影響，設(shè)置了6.5、7.5、8.5和9.54的pH值。結(jié)果（圖6）顯示，在pH值為7.5時，菌株生長能力及鐵載體合成效果最好，OD630高達2.061，鐵載體合成能力最強su值可達到78.3%，其次是pH6.5時，OD630達1.64，鐵載體合成su值為71.1%，盡管pH在8.5和9.5時菌體能夠較好的生長，但鐵載體合成能力明顯減弱，分別降低為60.3%和57.6%，因此將7.5定為該菌株最佳的生長及產(chǎn)鐵載體pH值。

2.4.6鐵載體合成最佳培養(yǎng)條件驗證 綜合以上優(yōu)化實驗，篩選得到鐵載體菌株理論最佳培養(yǎng)條件：10 g/L蔗糖，5 g/L酵母浸出粉，5 g/L NaCl，pH值調(diào)至7.5，28℃溫度下180 r/min培養(yǎng)。另以產(chǎn)鐵載體菌株WN-H3、WN-H3、GY4A為實驗菌株，分別接種于未優(yōu)化的LB液體培養(yǎng)基和優(yōu)化后的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)進行驗證，培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、36和48 h后取樣，測定兩種不同培養(yǎng)基內(nèi)菌液OD630和鐵載體活力su值。實驗結(jié)果（圖7，圖8）顯示，盡管3份菌株在兩種培養(yǎng)基內(nèi)進入對數(shù)生長的時間相差較小，均在8-24 h，但在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，同一取樣時間內(nèi)3份菌株的OD630和鐵載體活力su值均高于未優(yōu)化的培養(yǎng)基，且鐵載體的分泌時間提前，其中WN-H3在培養(yǎng)6 h即可達19%，16 h時已經(jīng)高達71%，48 h時可達80.4%。而在未優(yōu)化的培養(yǎng)基內(nèi)，菌株WN-H3培養(yǎng)6 h鐵載體量僅為11%，20 h時鐵載體分泌量才能提高到70%以上。此外，菌株WN-H3和GY4A在培養(yǎng)6 h時的鐵載體量達16.7%和17.3%，均高于未優(yōu)化的培養(yǎng)條件。由此證明，通過優(yōu)化實驗，調(diào)整后的培養(yǎng)條件更利于鐵載體產(chǎn)生菌的生長和鐵載體的合成。

圖6　初始pH值對菌株WN-H3生長及鐵載體合成的影響

圖7　菌株WN-H3在未優(yōu)化培養(yǎng)條件下的生長曲線及鐵載體分泌圖

圖8　菌株WN-H3在優(yōu)化培養(yǎng)條件下的生長曲線及鐵載體分泌圖

3　討論

近年來鐵載體合成細菌的篩選鑒定主要為假單胞菌屬熒光假單胞菌或惡臭假單胞菌，而在鐵載體產(chǎn)生菌的篩選研究方面，Schwyn&Neilands提出的CAS法是目前應(yīng)用最廣泛的檢測法。于素芳等［16］通過CAS法從棉花根際土壤中成功篩選出一株產(chǎn)鐵載體能力較強的細菌菌株E19，并鑒定出該菌株為惡臭假單胞菌Pseudomonas putida。趙翔等［23］采用改進后的CAS法從東湖中篩選得到了一株產(chǎn)鐵載體能力極高的熒光假單胞菌P. fluorescens。本研究通過CAS平板分離純化、定性定量檢測從貴州省威寧縣黑麥草根際土壤里篩選得到一株鐵載體產(chǎn)生能力較強的細菌WN-H3，形態(tài)及生理生化特征均與弗村假單胞菌P. vranovensis一致。BLAST比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WN-H3與有效發(fā)表的弗村假單胞菌菌株P(guān). vranovensis strainT-16（HQ202845）和P. vranovensis strain T-26（HQ202851）聚在同一小枝上，與兩者同源相似性分別達99.3%和99.1%，結(jié)合菌落菌體特征、生理生化指標，初步判斷WN-H3可能與Pseudomonas vranovensis strainT-16（HQ202845）和Pseudomonas vranovensis strain T-26（HQ202851）屬同一物種，也為一株弗村假單胞菌P. vranovensis，但因WN-H3與其他P. vranovensis菌株遺傳距離較遠，并未聚在同一大類，其間還聚有P. asplenii、P. putida、P. fluorescens等其它菌株，因此其明確的分類地位有待進一步研究。

目前，國內(nèi)外對弗村假單胞菌的研究利用十分少見。董立萍等［24］發(fā)現(xiàn)一株弗村假單胞菌，該菌具有溶磷功能，對鉛污染土壤具有較好的修復(fù)功能，通過固定土壤中游離態(tài)的鉛來有效抑制植物對重金屬鉛的吸收，同時還可以促進植物對土壤環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。本實驗研究所發(fā)現(xiàn)的該株弗村假單胞菌，具有較強的鐵螯合能力，生長48 h后鐵載體活力su值即高達78.6%，該菌株是否同時具有解磷功能將繼續(xù)開展下一步研究。為了更好的發(fā)掘鐵載體產(chǎn)生菌的產(chǎn)鐵載體能力，本實驗在搖瓶水平上采用單因子法分別研究了菌株WN-H3碳、氮源利用效果及培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值等因素對菌株生長及鐵載體合成能力的影響，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件更利于鐵載體產(chǎn)生菌的生長和鐵載體合成。

現(xiàn)在的一些研究表明，鐵載體不僅對微生物的鐵營養(yǎng)至關(guān)重要，而且它是根際促生細菌（PGPR）抑制土壤病害的重要機制［7，17］。這些具有鐵載體合成能力的微生物通過競爭鐵營養(yǎng)，不僅能夠改善自身的營養(yǎng)狀況，還能夠供給植物鐵營養(yǎng)或通過與植物病原菌競爭鐵營養(yǎng)達到生物防治的作用［9］。除生物防治作用外，鐵載體能與重金屬離子結(jié)合，形成金屬—鐵載體螯合物，提高植物根際環(huán)境中重金屬的活性，增加植物對重金屬的吸收和累積，提高植物修復(fù)的效率［25，26］。晉銀佳［27］選取熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescence）作為代表微生物菌種，在培養(yǎng)液中添加該菌體后，采用砂基和水基方式培養(yǎng)的油麥菜中Cd的含量分別減少了27.23%-50.74%和10.57%-45.53%，表明微生物產(chǎn)生的鐵載體能有效抑制油麥菜對Cd的吸收。

4　結(jié)論

結(jié)合菌株形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析，將分離篩選得到的鐵載體產(chǎn)生菌WN-H3鑒定為弗村假單胞菌P. vranovensis。該菌菌落較小，革蘭氏染色陰性，最適生長溫度為26-35℃。通過對碳、氮源利用效果及培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值等因素對菌株生長及鐵載體合成能力的影響研究，最終優(yōu)化得到鐵載體產(chǎn)生菌的最佳發(fā)酵條件：蔗糖10 g/L，酵母浸出份5 g/L，NaCl 5 g/L，溫度28℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，pH7.5，該條件下培養(yǎng)48 h后菌株WN-H3產(chǎn)生的鐵載體活性su值可達80.4%。

［1］胡碧惠， 趙春貴， 楊素萍. 鐵對產(chǎn)鐵載體的沼澤紅假單胞菌光合色素與鐵載體合成的影響［J］. 微生物學(xué)報， 2014， 54（4）：408-416.

［2］朱慧明， 張彥， 楊洪江. 高產(chǎn)鐵載體假單胞菌的篩選及其對鐵氧化物的利用［J］. 生物技術(shù)通報， 2015， 31（9）：177-182.

［3］魏本杰， 曾曉希， 劉志成， 等. 產(chǎn)鐵載體菌的篩選鑒定及活化鎘的性能探究［J］. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)， 2014， 37（11）：26-31.

［4］王英麗， 林慶祺， 李宇， 等. 產(chǎn)鐵載體根際菌在植物修復(fù)重金屬污染土壤中的應(yīng)用潛力［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報， 2015， 24（7）：2081-2088.

［5］肖艷紅， 李菁， 劉祝祥， 等. 1株蛇足石杉根際鐵載體細菌的分離、篩選與鑒定［J］. 微生物學(xué)雜志， 2013， 33（2）：63-67.

［6］林天興， 唐梅， 黃明遠， 等. 高產(chǎn)鐵載體棉田土壤細菌SS05的篩選與鑒定［J］. 微生物學(xué)通報， 2012， 39（5）：668-676.

［7］Haas D， Défago G. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent Pseudomonads［J］. Nature Reviews Microbiology，2005， 3（4）：307-319.

［8］Taghavi S， van der Lelie D， Hoffman A， et al. Genome sequence of the plant growth promoting endophytic bacterium Enterobacter sp. 638［J］. PLoS Genetics， 2010， 6（5）：e1000943.

［9］Catara V. Pseudomonas corrugata：plant pathogen and/or biological resource？［J］. Molecular Plant Pathology， 2007， 8（3）：233-244.

［10］Lodewyckx C， Vangronsveld J， Porteous F， et al. Endophytic bacteria and their potential applications［J］. Critical Reviews in Plant Sciences， 2002， 21（6）：583-606.

［11］謝小軍， 王敬國. 一株細菌兒茶酚型鐵載體分泌的影響因素研究［J］. 微生物學(xué)通報， 2006， 33（1）：105-109.

［12］Manninen M， Mattila-Sandholm T. Mmethods for the detection Pseudomonas siderophores［J］. Journal Microbiological Methods，1994， 19（3）：223-234.

［13］Barzanti R， Ozino F， Bazzicalupo M， et al. Isolation and characterization of endophytic bacteria from the nickel hyperaccumulator plant Alyssum bertolonii［J］. Microbial Ecology， 2007， 53（2）：306-316.

［14］朱彭玲， 杜秉海， 丁延芹， 等. 新疆棉花根際土壤鐵載體產(chǎn)生菌的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育研究［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009，42（5）：1568-1574.

［15］何苗， 黃云， 王靖， 等. 桃樹根際鐵載體產(chǎn)生菌MX-26的分離鑒定及誘變選育［J］. 植物保護學(xué)報， 2011， 38（5）：432-436.

［16］于素芳， 丁延芹， 姚良同， 等. 一株棉花根際鐵載體產(chǎn)生菌E19的分離鑒定［J］. 生物技術(shù)， 2007， 17（6）：19-21.

［17］Schwyn B， Neilands JB. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores［J］. Anal Biochem， 1987，160：47-56.

［18］席琳喬， 周斌， 劉婷. 鐵載體合成細菌動態(tài)變化與初步鑒定研究［C］. 中國草原發(fā)展論壇文集， 2009.

［19］榮良燕， 姚拓， 趙桂琴， 等. 產(chǎn)鐵載體PGPR菌篩選及其對病原菌的拮抗作用［J］. 植物保護， 2011， 37（1）：59-64.

［20］Machuca A， Milagres AMF. Use of CAS-agar plate modified to study the effect of different variables on siderophore production by Aspergillus［J］. Lett Appl Microbiol， 2003， 36：177-181.

［21］東秀珠， 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］. 北京：科學(xué)出版社， 2001.

［22］李俊峰， 李紅芳， 姚淑敏， 等. J61321（Alteromonas aurantia）菌株產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)條件的研究［J］. 青島科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2007， 28（1）：20-24.

［23］趙翔， 陳紹興， 謝志雄， 等. 高產(chǎn)鐵載體熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens sp-f的篩選鑒定及其鐵載體特性研究［J］. 微生物學(xué)報， 2006， 46（5）：691-695.

［24］董立萍. 解磷菌修復(fù)土壤鉛污染效應(yīng)優(yōu)化及機理探索［D］.西安：西北大學(xué)， 2014：21-27.

［25］劉阿梅， 向言詞， 田代科， 等. 生物炭對植物生長發(fā)育及重金屬鎘污染吸收的影響［J］. 水土保持學(xué)報， 2013， 27（5）：193-198， 204.

［26］Shim J， Babu AG， Velmurugan P， et al. Pseudomonas fluorescens JH 70-4 promotes Pb stabilization and early seedling growth of Sudan grass in contaminated mining site soil［J］. Environmental Technology， 2014， 35（20）：2589-2596.

［27］晉銀佳， 劉文， 朱躍， 等. 熒光假單胞菌產(chǎn)鐵載體對油麥菜吸收砂基和水基中鎘的影響［J］. 環(huán)境工程學(xué)報， 2016， 10（1）：415-420.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Screening，Identification and Fermentation Condition Optimun of a Siderophore-producing Bacteria WN-H3 from Rhizosphere of Ryegrass

CHEN Wei SHU Jian-hong CHEN Ying ZENG Qing-fei WANG Xiao-li LU Rui-xia FU Wei
（Guizhou Institute of Prataculture，Guiyang 550009）

By mean of the chrome azural S（CAS）assay，a high-affinity siderophore- producing bacteria WN-H3 was screened out from 28 bacteria，which were isolated from the ryegrass（Lolium perenne L.）rhizosphere soil. According to morphological，biochemical and physiological characteristics，16S rDNA sequence and phylogenetic analysis，the strain was identified as Pseudomonas vranovensis. The optimal medium components（carbon and nitrogen sources）and growth conditions（temperature，rotation speed and initial pH）for siderphore production by strain WN-H3 were researched by one variable-at-a-time method. The result demonstrated that high siderophore production was yeilded at high siderophore- producing ability of 80.4% under the condition of 10 g/L sucrose，5 g/L yeast extracion，5 g/L NaCl，temperature 28℃，initial pH7.5，180 r/min.

siderophore-producing bacteria；screening；identification；condition optimun

2016-02-16

貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生科研創(chuàng)新基金項目（黔農(nóng)科合（創(chuàng)新基金）2011015號）

陳偉，男，助理研究員，研究方向：生物技術(shù)；E-mail：44075638@qq.com

付薇，女，碩士，副研究員，研究方向：牧草栽培及根際微生物；E-mail：494978600@qq.com